一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆柱体支架的构建的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体-神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法。应用时将种植有过表达TrkC受体细胞及其分化细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆柱体支架移植到横断性脊髓损伤处，可更好地促进受损伤中枢神经再生和功能修复。本发明在生物组织工程水平上加强对横断性脊髓损伤后保护受损伤神经元、促进其轴突再生、提高伤病者生存质量、减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展有重要意义。
【专利说明】-种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆 柱体支架的构建
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体-神经营养 素-3(neurotrophin_3, NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达 TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 中枢神经损伤如严重的脊髓创伤主要表现为截瘫和四肢瘫，目前还没有行之有效 的治疗方法。传统认为，脊髓神经损伤后很难再生。现在认为，脊髓神经再生困难的原因主 要是它们所处微环境中缺乏促进神经再生的神经营养因子。因此，要想脊髓神经损伤后能 够再生，必需进行人工干预。现阶段促进脊髓神经损伤修复的策略，多着力于改善神经元发 出的神经纤维再生微环境，让再生的神经纤维借助桥接物支架穿过损伤区，进入另一侧的 脊髓组织中，重建神经通路联系，恢复原有的功能。
[0003] 在脊髓损伤修复的策略中，生物组织工程材料作为具有保护神经元和促进其轴突 再生作用的活性因子或作为移植干细胞的载体，被用于治疗脊髓损伤且逐渐引起人们的关 注。组织工程材料主要有天然高分子生物材料和可降解高分子合成材料。天然高分子生物 材料包括明胶、胶原、壳聚糖和海藻酸盐等。天然材料具有良好的生物相容性，在体外能促 进细胞的黏附、增殖与分化。它们方便承载神经营养因子，与脊髓组织的整合性好，能够降 低炎症反应以及减少星形胶质细胞增生所形成的疤痕，在一定程度上能够促进受损伤脊髓 的结构和功能恢复。由于天然材料存在加工、机械性能较差和降解速率不易调控等问题，在 体内应用受到一定限制。可降解的高分子合成材料以聚左旋乳酸（poly D，L-lactic acid, PLLA)和聚乳酸-聚轻基乙酸共聚物（poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)为代 表，它最大的优点易于加工成各种复杂的结构和形状，有一定的机械强度，能够起到桥接组 织的作用，降解产物易于被吸收。但是，这种材料在体外没有促进细胞黏附和生长的功能， 植入体内后可能存在降解产物呈酸性的问题。
[0004] 天然生物材料做成的凝胶、明胶海绵和胶原海绵，都可用于横断性脊髓损伤修复。 凝胶能够在脊髓损伤空洞处起填充作用，促进轴突再生，减少星形细胞增生形成的疤痕。但 是，它不能较好地引导再生轴突穿越损伤区域，尤其是缺乏机械强度。明胶和胶原具有凝胶 的优点，且能够方便承载活性物质。明胶来自于胶原，但去胶原的自然属性后（de-nature collagen)没有了胶原的抗原性，而且含有类似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)序列，能 够促进细胞的黏附和迁移。另外，明胶价格比较便宜，但其机械强度也不高。
[0005] 明胶海绵应用于临床已经有许多年的历史了，这得益于它的良好的组织相容性和 细胞亲和力。但是近年有病例报告指出，由于明胶海绵吸水容易膨胀，最终导致植入中枢 神经后出现对周围组织挤压的情况。基于这种情况，我们设计用一种相对膨胀系数较小的 材料PLGA膜作为导管外壳，并在导管的中央填塞明胶海绵（曾园山，曾湘。一种用于修 复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建。获中华人民共和国发明专利，发明专利号：ZL 200910040176. 9)。这明胶海绵圆柱体支架一方面可以尽可能保持明胶海绵的良好材料特 性，另一方面可以减少明胶海绵的过度膨胀。此外，由于有了机械强度较高的PLGA膜作为 导管外壳，导管中间的明胶海绵不容易发生塌陷。这些优点都有利于我们进行体内、外的实 验研究。
[0006] 丝素蛋白（Silk fibroin)与其它天然高分子相比有明显的优越性：（1)安全可靠； 丝素蛋白是来源于家蚕的天然高纯度蛋白质，向人类传播疾病的风险比较少，而且具有明 确的一级结构，不存在潜在的危害性。（2)通过不同处理方法可以获得膜状或液态性状。（3) 可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰，改变其表面性能，较容易吸附细胞。（4)在 体内、外可缓慢降解，具有一定的缓释性。
[0007] 应用神经营养因子治疗中枢神经损伤是目前研究的热点之一，但所运用的多是神 经生长因子（NGF)、脑源性神经营养因子（BDNF)和神经营养素-3 (neurotrophin-3, NT-3) 等神经营养因子。现已证明NGF主要作用于感觉神经元，对运动神经元作用不明显，而BDNF 作用的神经元类型范围较窄小。许多研究认为，NT-3对神经元的发育、分化以及对受损伤 中枢神经元的存活及其轴突再生有重要作用。有研究还证实，NT-3对脊髓损伤处皮质脊髓 束神经纤维的再生有明显的促进作用，这也在我们先前的研究中得到了验证。许多研究表 明，NT-3通常与细胞膜上的高亲力受体-TrkC结合而发挥作用。
[0008] 目前脊髓损伤后神经再生尚未得到有效解决，损伤处微环境缺乏神经营养因子可 能是最关键的因素之一。因此，给予外源性神经营养因子是必要的。新近认为，联合治疗策 略有望使脊髓损伤修复达到更好的效果，如神经营养因子与生物支架材料联合应用等。研 究表明，由于外源性给药方式不能满足在脊髓神经再生过程中的要求，传统注射神经营养 因子等给药途径取得的临床效果并不理想，使得神经营养因子的广泛应用受到了限制。因 此，亟需找到一种理想的承载神经营养因子，且能使其在脊髓损伤处微环境一定时间内维 持有效浓度的方法。
[0009] 综合上述研究中存在的问题，本项发明专利试图通过在天然生物材料一一多孔 隙明胶海绵圆柱体支架内添加 NT-3/丝素蛋白，利用丝素蛋白特性将使NT-3结合到明胶 上，构建一种用于修复脊髓损伤的缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架。然后，在此支架内种植 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)。
【发明内容】
[0010] 目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体 (NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达TrkC受体干细胞的缓释 TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法及其应用。本发明的目的是想克服现有临床上 治疗脊髓损伤所使用的方法上的不足，应用我们自行构建的含有过表达TrkC受体细胞的 缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料治疗脊髓创伤性疾病，可能会更好地促进受损伤脊 髓神经再生和功能修复。
[0011] 本发明的基本方案包括：
[0012] 以多孔隙明胶海绵为主体，加入丝素蛋白和NT-3,外面应用PLGA薄膜包裹，形成 一种形貌像圆柱体的支架材料。在此基础上种植骨髓间充质干细胞等，构建成能够促进脊 髓神经再生的人工神经导管。应用时，将其移植到脊髓横断性损伤处。
[0013] 本发明有其显著优点；它是在我们前一项发明专利（一种用于修复神经损伤的明 胶海绵圆柱体支架的构建，发明专利号：ZL 200910040176.9)的基础上构建一种含有过表 达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体（NT-3)明胶海绵支架，用于促进受损伤的脊髓神经 再生及其功能修复，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病进行临床前研究，将会有 力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者 生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本发明将使我国 的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解天然生物材料、可降解高 分子合成材料、家蚕蚕茧、神经营养因子、实验细胞、实验动物和试剂作详尽的描述：
[0015] 1.主要仪器
[0016] 超净工作台（苏州净化设备有限公司）、普通离心机（日本久保田制作所）、低温 高速离心机（美国Eppendorf公司）、5% CO2培养箱（美国Queue公司）、倒置突光显微镜 (德国Leica公司）、酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司）、恒冷箱切片机（英国Shandon 公司）和XL30FEG型扫描电镜（德国Philips公司）。
[0017] 2.可降解天然生物材料
[0018] 明胶海绵购自南京金陵药业股份有限公司的产品。
[0019] 3.可降解高分子合成材料
[0020] PLGA (50 : 50)薄膜购自济南岱罡生物科技公司的产品。
[0021] 4.家蚕蚕茧
[0022] 制备丝素蛋白溶液所用的原料家蚕蚕茧，是由浙江省农业科学院蚕桑研究所 赠送的产品。
[0023] 5.神经营养因子
[0024] 人NT-3基因重组蛋白（neurotrophin-3, NT-3 ;购自Sigma公司的产品）
[0025] 6.实验细胞和实验动物
[0026] 绿色荧光骨髓间充质干细胞（MSCs，自行分离培养获取）和绿色荧光蛋白转基因 SD(Sprague-Dawley)大鼠乳鼠 （Osaka University, Osaka, Japan)。
[0027] 7.主要试剂
[0028] DMEM-LG (Gibico)，优级胎牛血清（TBD)，多聚赖氨酸（Sigma)，D-Hank' s 平衡液 (自配），胰蛋白酶（Sigma), EDTA(Sangon)，0· Olmol/IPBS(中杉金桥），MTT(Sigma),二甲 基亚砜（DMSO) (Sangon), Hoechst33IM2 (Sigma)，山羊血清（中杉金桥）等。
[0029] 本发明详细的具体操作技术说明如下：
[0030] 1.缓释NT-3的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建
[0031] 所述的缓释NT-3的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建可分为4个步骤。第 1步骤是制备支架外壳：外壳薄壁是环绕圆柱体的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（poly D， L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)，其由可降解的高分子合成材料PLGA (聚乳酸与聚轻 基乙酸比值为50 : 50,分子量为100000)构成。0.02mm厚PLGA薄膜购自山东济南岱罡生 物技术公司，材料的构建方法如下：取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5 %溶液，待 PLGA完全溶解后，浇注与已调水平的聚四氟模具中，室温（控制温度在20°C )，挥发24小 时，第2天小心揭下薄膜，反置于模具中24小时，剪裁到适宜大小后干燥保存。将薄膜包绕 在直径为3mm的不锈钢圆柱磨具上一圈，边缘用丙酮粘贴，形成直径为3mm的圆筒状PLGA 外壳。使用时将PLGA外壳剪成2mm长度，酒精浸泡15分钟，随后用无菌D-Hank' s平衡液 浸洗3次，每次10分钟。
[0032] 第2步骤是制备丝素蛋白溶液：（1)将20g Na2CO3溶于4升水中，加热至KKTC，放 入75g家蚕蚕茧（由浙江省农业科学院蚕桑研究所赠送），保持溶液微沸，并不断搅拌。1小 时后，倒去溶液。再重复上述过程1次。将煮沸好的蚕茧自然冷却，用去离子水冲洗干净，放 在烘箱内24小时，50°C烘干后备用。（2)取CaCl 244. 40g、乙醇46. 00ml，去离子水57. 60ml 制成混合溶液，在此溶液中放入烘干的蚕茧15. 00g。使溶液充分浸没蚕茧后，80°C水浴加 热，搅拌溶解。1小时后，蚕茧全部溶解为丝素蛋白溶液。停止加热和搅拌，自然冷却丝素蛋 白溶液至室温。（3)用透析袋（购自于广州市齐云生物技术有限公司）透析去除丝素蛋白 溶液中的盐离子。前2天用自来水浸泡含有丝素蛋白溶液的透析袋,后1天改用去离子水 浸泡，共透析3天。在透析期间，每隔3小时换1次自来水或去离子水。（4)将透析后的丝 素蛋白溶液倒入量筒中，静置4小时，除去溶液中的固体杂质。用锥形瓶收集静置后的丝素 蛋白溶液，4°C冰箱保存，在1周内使用完毕。（5)取约IOml静置后的丝素蛋白溶液倒入小 烧杯中，60°C烘干。称量烘干后的丝素蛋白的质量，除以溶液质量，即可得到丝素蛋白溶液 的浓度。计算公式为
【权利要求】
1. 一种用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体 明胶海绵支架材料，其形貌结构特征是：支架中央填充着负载TrkC受体配体/丝素蛋白的 明胶海绵；通过负载TrkC受体配体/丝素蛋白的明胶海绵吸附种植的过表达TrkC受体细 胞，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及其功能修复的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架。
2. 根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓 释TrkC受体配体明胶海绵支架材料，其过表达TrkC受体细胞特征是：所吸附种植的过表达 TrkC受体细胞为过表达TrkC受体的干细胞。
3. 根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓 释TrkC受体配体明胶海绵支架材料，其负载的TrkC受体配体特征：是能够与TrkC这种高 亲力受体特异性结合的NT-3。
【文档编号】A61L27/22GK104258460SQ201410545001
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】曾园山, 张可 申请人:中山大学