一种消石利胆片的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种消石利胆片的制备方法及应用。本发明的消石利胆片的制备方法，由醋制柴胡165g、青皮165g、黄芩165g、白芍165g、大黄66g、郁金165g、金钱草165g、海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三棱110g、威灵仙165g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本发明还提供了消石利胆片在制备抑制小鼠肛门肉瘤细胞S-180细胞增殖药物中的应用。
【专利说明】一种消石利胆片的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种消石利胆片的制备方法及其在抑制小鼠 肛门肉瘤细胞S-180细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 消石利胆胶囊标准号WS-11331 (ZD-1331)-2002,记载于国家中成药标准汇编内科 脾胃分册。由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、 桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成，具有疏肝利胆，行 气止痛、清热解毒排石的功效，用于慢性胆囊炎、胆囊结石、胆管炎、胆囊手术后综合症及胆 道功能性疾病。
[0003] 现有技术中，尚未有消石利胆胶囊在提取制备方面采用超临界和微波技术的报 道，而挥发油提取，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服 用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种消石利胆片的制备方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种消石利胆片在制备抑制小鼠肛门肉瘤细胞 S-180细胞增殖药物中的应用。
[0006] 本发明的目的是通过如下的方案实现的： 一种消石利胆片的制备方法，由醋制柴胡165g、青皮165g、黄苳165g、白巧165g、大黄 66g、郁金165g、金钱草165g、海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三棱 ll〇g、威灵仙165g作为原料药制成，所述的制备方法由下列步骤组成：取醋制柴胡、茵陈、 郁金、青皮、姜黄、三棱，加入到〇) 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为4-6%，萃取压力20-30MPa，温度30-501：，〇)2流量l-3ml/g生药?min，萃 取时间240-300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微 波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓 缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇， 浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制胶囊，干燥，压片，制成333片，每片重0. 5g。
[0007] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述C02超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为5%。
[0008] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取压力为25MPa。
[0009] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取温度为40°C。
[0010] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述C02超临界萃取中C02流量2ml/g生 药?min〇
[0011] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取时间为270min。
[0012] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。
[0013] 上述的消石利胆片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
[0014] 上述的消石利胆片在制备抑制小鼠肛门肉瘤细胞S-180细胞增殖药物中的应用。
[0015] 现有技术中，消石利胆胶囊每次3粒，一日3次。消石利胆胶囊服药量大，采用本 发明方法制备成的消石利胆片每片重〇. 5g，每次仅需1片，一日服用3次。在具有更多活性 成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随 水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。
[0016] 试验一、不同方法制备的消石利胆片中橙皮苷含量的比较 1、仪器及试药本发明消石利胆片：按实施例1方法制备，使用1991g原料药，经提取制 成333片，每片重0. 5g。原消石利胆胶囊，按照WS-11331 (ZD-1331)-2002标准方法制备。 Agilentl200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；橙皮苷对照品（中国药品生 物制品检定所）。
[0017] 2、方法 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VD)测定。
[0018] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水 (25 : 75)为流动相；检测波长为284nm。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000。
[0019] 对照品溶液的制备取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0. 2mg的 溶液，即得。
[0020] 本发明产品供试品溶液的制备取本发明的消石利胆片，研细，取0. 33g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5ml,蒸干，加水适量使溶解，通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径1. 5cm，长9cm)，分别用水和17%甲醇溶液各120ml洗脱，弃去 洗脱液，再用2%吡啶甲醇溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至 l〇ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0021] 对照产品供试品溶液的制备取本对照的消石利胆胶囊，研细，取lg，精密称定，置 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，加水适量使溶解，通过D101型大 孔吸附树脂柱（内径1. 5cm，长9cm)，分别用水和17%甲醇溶液各120ml洗脱，弃去洗脱液， 再用2%吡啶甲醇溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶 中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0022] 测定法分别精密吸取对照品溶液3yl与供试品溶液5yl，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0023] 3、结果 结果表明，本发明消石利胆片中橙皮苷的含量为9. 5-19mg/片；而原消石利胆胶囊中 橙皮苷的含量为1. 5mg/粒，每次服用量1片的橙皮苷含量为原胶囊剂含量的2-4倍，在服 用量减少的情况下，橙皮苷含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本发明制备方法制备的消石利胆片，有效成分含量远远高于 WS-11331 (ZD-1331)-2002标准记载的方法制备的消石利胆胶囊。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解 本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0026] 实施例1 取醋制柴胡165g、青皮165g、黄芩165g、白芍165g、大黄66g、郁金165g、金钱草165g、 海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三棱110g、威灵仙165g，将醋制柴 胡、茵陈、郁金、青皮、姜黄、三棱，加人到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总 萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40°C，C(V流量2ml/g生药?min，萃取 时间270min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取 装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101 大孔吸附树脂柱上，70 %乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥， 得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制胶囊， 干燥，压片，制成333片，每片重0. 5g。
[0027] 经检测，成品中橙皮苷的含量为18. 9mg/片。
[0028] 实施例2 取醋制柴胡165g、青皮165g、黄芩165g、白芍165g、大黄66g、郁金165g、金钱草165g、 海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三棱110g、威灵仙165g，将醋制柴 胡、茵陈、郁金、青皮、姜黄、三棱，加人到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总 萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度30°C，C02流量31111/^生药*1^11，萃取 时间300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取 装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101 大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥， 得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制胶囊， 干燥，压片，制成333片，每片重0. 5g。
[0029] 经检测，成品中橙皮苷的含量为14. 9mg/片。
[0030] 实施例3 取醋制柴胡165g、青皮165g、黄芩165g、白芍165g、大黄66g、郁金165g、金钱草165g、 海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三棱110g、威灵仙165g，将醋制柴 胡、茵陈、郁金、青皮、姜黄、三棱，加人到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总 萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力20MPa，温度50°C，C02流量11111/^生药*1^11，萃取 时间240min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的70%乙醇，投入微波萃取 装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101 大孔吸附树脂柱上，70 %乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥， 得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制胶囊， 干燥，压片，制成333片，每片重0. 5g。
[0031] 经检测，成品中橙皮苷的含量为9. 5mg/片。
[0032] 实施例4 :消石利胆片抑制小鼠肛门肉瘤细胞S-180细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1.1实验用细胞株 小鼠肛门肉瘤细胞S-180细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0033] 1. 2实验药物 研究药物：本发明消石利胆片：按实施例1方法制备。
[0034] 药液储液：称取100mg消石利胆片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤， 500iildoff管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0035] 1. 3实验试剂 DMEM(GIBC0公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清（浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No. 11810-033Lot. No.1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司）；EDTA(AMRESC0 公司）；PenicillinGSodium Salt(AMRESC0公司1);StreptomycinSulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜博亚杜兰经贸有限 公司）；MTT(Biosharp批号：0793):PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公 司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制 造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精密移液器（法国吉 尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S);全自动高压灭菌锅 (日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号： DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号：2001);低速离心机 (上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0. 2iim滤器（MILLIP0RE型号：SLGP033RB);lcm培 养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2?实验方法 l)s-180细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞 生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-0. 04% EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管 中，lOOOrpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0037] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180ii1，培养板放入细胞培养箱 中（37°C，5%C02)常规培养。
[0038] 3)根据细胞生长情况，一般长至50% -70%，加入消石利胆片溶液，继续培养24h。
[0039]4) 24h后加入 20illMTT溶液（5mg/ml，即 0?5%MTT)，继续培养 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200yl二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0041] 6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解 介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
[0042] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％ )=(对照孔0D值-给 药孔0D值）、对照孔0D值X100%。实验重复3次。
[0043] 3?统计处理 采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean土S.D.表不。
[0044] 4.实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对S-180细胞 增殖抑制有差异（P〈〇. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量达到 15_20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0045] 表1消石利胆片对S-180细胞增殖抑制影响研究（X土SD)
【权利要求】
1. 一种消石利胆片的制备方法，由醋制柴胡165g、青皮165g、黄苳165g、白巧165g、大 黄66g、郁金165g、金钱草165g、海金沙165g、烫鸡内金165g、茵陈165g、姜黄165g、醋制三 棱ll〇g、威灵仙165g作为原料药制成，其特征在于，所述的制备方法由下列步骤组成：取醋 制柴胡、茵陈、郁金、青皮、姜黄、三棱，加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力20-30MPa，温度30-50°C，C02流量1-31111/^ 生药萃取时间240-300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入5L的70% 乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合 并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减 压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，力口 入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成333片，每片重0. 5g。
2. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 萃取压力为25 MPa。
4. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 萃取温度为40 °C。
5. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 C02 流量 2ml/g 生药? min。
6. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 萃取时间为270min。
7. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取功率为 700W。
8. 根据权利要求1所述的消石利胆片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃 取时间为8分钟。
9. 权利要求1所述的消石利胆片在制备抑制小鼠肛门肉瘤细胞S-180细胞增殖药物中 的应用。
【文档编号】A61K36/9066GK104383427SQ201410562859
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】尤晓明, 王显涛, 李洋, 迟文泉, 邓世海 申请人:山东永泰化工有限公司