乳酸菌对支气管哮喘治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属生物医药【技术领域】，具体涉及乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法。用于临床上因各种原因引起的支气管哮喘患者。由生物性变应原和非生物性变应原引起的支气管哮喘，在治疗过程中，可应用乳酸菌，可刺激机体产生抗体，从而调节机体的免疫应答；具有抵抗炎性反应和减轻平滑肌的肥大的作用，进而减轻哮喘的发作与发生。
【专利说明】乳酸菌对支气管哮喘治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量 乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是 研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值， 而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。其 中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道 中。目前已被证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。
[0003] 乳酸菌可控制人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能。乳酸杆菌 和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，另一方面由于它能在肠道定植，相当 于天然自动免疫。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体 及促进细胞免疫等，能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高机体的抗病能力。人 类口服乳酸菌后，对巨璇细胞的半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活 和促进作用。当异物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作 用。乳酸菌之所以具有刺激机体产生抗体的作用，是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细 胞接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结（MIN)循环到血流中，并分布全身，从而调节 机体的免疫应答。辅助性T淋巴细胞（Thl/Th2)细胞比例失衡是哮喘发病机制之一。白细 胞介素12 (L-12)通过结合L-12受体，提高γ干扰素（IFN-γ )含量并成为提高Thl细胞 分泌的主要因素。
【发明内容】
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[0004] 本发明公开了乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法，用于治疗各种原因引起的 支气管哮喘。本发明通过以下实验证明乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法。将50只 小鼠按随机数字表法分为模型对照组（A组）、PBS滴鼻组（B组）、野生菌滴鼻组（C组）、重 组L-12(rL-12)滴鼻组（D组）、工程菌滴鼻组（E组），每组10只。除A组外，各组小鼠在 第1、7、14天腹腔注射0VA(100yg/015ml)，20?26d每天吸入2% OVA。B、C、E组在第1、 2、3、14、19、20、21天予以？85、无质粒野生乳酸菌液及含1^-12质粒工程菌液各1(^1，0组 第20、21、22天每只鼻腔予以3ng rL-12,第28天取标本。进行行为学观察：记录第20? 26天每只小鼠喷嚏、抓鼻次数及哮喘程度：无喷嚏：0分；〈4次：1分；4?10次：2分；>11 次：3分。无抓鼻：0分；轻度抓鼻：1分；频繁抓鼻：2分；抓鼻不止：3分。无喘息：0分； 呼吸急促：1分；明显喘息：2分；喘息致死：3分。肺组织病理及细胞因子测定：第28天小 鼠经麻醉后开胸观察小鼠肺脏，结扎取左肺切片做苏木精2伊红（HE)染色。冲洗右肺获支 气管肺泡灌流液（BALF)后离心转移上清液待测。BALF中细胞经沉淀后计算细胞总数，另取 涂片作瑞氏染色，镜下（XlO)数500个细胞，计算嗜酸粒细胞（EOS)百分比，以细胞总数乘 百分比即EOS绝对数。
【具体实施方式】
[0005] 下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
[0006] 本发明通过以下实验证明乳酸菌在支气管哮喘治疗中的作用：将6?8周50只清 洁级小鼠，体重18?25g，按随机数字表法分为模型对照组（A组）、PBS滴鼻组（B组）、野 生菌滴鼻组（C组）、重组L-12 (rL-12)滴鼻组（D组），工程菌滴鼻组（E组），每组10只。 除A组外，各组小鼠在第1、7、14天腹腔注射卵白蛋白（OVA) 100 μ g/0. 5ml，20?26d每天 吸入2%(^八。8、(：4组在第1、2、3、14、19、20、21天予以磷酸盐缓冲液（?85)、无质粒野生 乳酸菌液及含L-12质粒工程菌液各10 μ 1，D组第20、21、22天，每只鼻腔予以3ng rL-12， 第28天取标本。
[0007] 1行为学观察：记录第20?26天每只小鼠喷嚏、抓鼻次数及哮喘程度。无喷嚏：0 分；〈4次：1分；4?10次：2分；>11次：3分。无抓鼻：0分；轻度抓鼻：1分；频繁抓鼻：2 分；抓鼻不止：3分。无喘息：0分；呼吸急促：1分；明显喘息：2分；喘息致死：3分。A组 小鼠无异常；B、C组小鼠有不同程度烦躁不安、喷嚏、抓鼻，其中5只（3只在B组，2只在C 组）合并呼吸急促、腹肌痉挛、大小便失禁，每只小鼠总评分为6?8分；D、E组小鼠偶有喷 嚏、抓鼻，其余无明显异常，每只小鼠总评分为1?3分。实验证明，在应用了乳酸菌后，小 鼠的行为较为安静，没有明显哮喘的表现，表示乳酸菌在支气管哮喘的发作中起到了一定 的对抗作用。
[0008] 2肺组织病理观察：第28天小鼠经麻醉后开胸观察小鼠肺脏，结扎取左肺切片做 苏木精2伊红（HE)染色。肉眼观察A组小鼠肺组织基本正常，B、C组小鼠肺脏与A组比 较体积增大、表面肿胀、多处有不规则充血区，切面泡沫有渗出物。光镜观察显示A组小鼠 支气管黏膜基本正常，B、C组小鼠支气管平滑肌肥大，管壁炎性细胞浸润。HE染色结果显 示B、C组小鼠肺局部有片状出血，支气管及血管周围有中、重度淋巴细胞、EOS等慢性炎性 细胞浸润。D、E组与B、C组比较病变明显减轻，血管周围有轻度炎性细胞浸润，基本接近A 组。经病理观察后发现，应用乳酸菌后的小鼠肺组织病变明显减轻，基本接近正常组，证明 乳酸菌具有抵抗炎性反应、减轻平滑肌的肥大的作用，进而减轻哮喘的发作与发生。
[0009] 3细胞因子测定：冲洗右肺获支气管肺泡灌流液（BALF)后离心转移上清液待测。 BALF中细胞经沉淀后计算细胞总数，另取涂片作瑞氏染色，镜下（XlO)数500个细胞，计算 嗜酸粒细胞（EOS)百分比，以细胞总数乘百分比即EOS绝对数。BALF中EOS及L-4水平B、 C组分别与A、D、E组比较差异均有统计学意义（P均〈0. 01) ;IFN- γ水平B、C组与A、D、E 组比较差异也有统计学意义（P均〈0. 01，表1)。L-12蛋白质表达：L-12能在NZ9000中有 效表达，判断NZ9000能够产生并分泌约80pg/ml的L-12。通过实验证明，乳酸菌能够减轻 支气管平滑肌的肥大作用，减少炎性反应。
[0010] 表 1 5 组小鼠 BALF 中 EOS、L-4、IFN2 γ 比较（X土 S)
[0011]
【权利要求】
1. 乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法。
2. 根据权利要求1所述的乳酸菌在支气管哮喘治疗中的一种方法，其特征在于：在 临床上因各种原因引起的支气管哮喘患者，在治疗过程中可应用乳酸菌，应用方法为口服 5ml/ 天。
【文档编号】A61K35/744GK104435000SQ201410634746
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】庞庆丰, 范红斌, 陈俊良, 杜斌 申请人:江南大学