一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)重组蛋白的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)的应用。长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制备抑菌剂或饲料添加剂。本发明中体外重组表达的长牡蛎凝集素-2(CgCLec-2)蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有抑制生长作用，作为一种有效的模式识别受体，在开发抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
【专利说明】一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)重组 蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集 素-2 (CgCLec-2)的应用。
【背景技术】
[0002] 长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类，在中国沿海均有分布。牡蛎养殖业在我国沿 海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨大的发展前景。由于各种微生物引起的 多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。因此，对长牡蛎开展免 疫防御机制研宄将有助于人类对其病害进行有效防控和治疗。
[0003] 长牡蛎作为软体动物的代表，以其特殊的进化地位，得到人们越来越多的关注。由 于缺乏适应性免疫防御系统，长牡蛎主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染。 海洋环境中存在着大量的微生物群，宿主识别有害非己成分的能力显得尤为重要。C型凝集 素作为一类重要的模式识别受体，能够识别表达在微生物细胞表面的病原相关分子模式， 在固有免疫应答中发挥不可或缺的作用。
[0004] C型凝集素是一类包含有糖类识别结构域（CRD)并且以钙离子依赖的形式识别并 结合糖类的蛋白。I860年，研宄人员报道了蛇毒凝集素的凝集活性。随着对C型凝集素的 深入研宄，越来越多的证据表明，C型凝集素不仅作为模式识别分子在固有免疫应答反应中 起作用，同时也作为效应分子抵御病原微生物的入侵。它不仅可以识别并结合入侵病原，并 且具有促吞噬，结节形成及激活补体等功能。C型凝集素的抑菌活性首先在小鼠中发现，随 后文昌鱼中也有类似报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的在于提供一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)重组蛋 白的应用。
[0006] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0007] -种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)重组蛋白的应用，长牡蛎C 型凝集素-2 (CgCLec-2)基因用于制备抑菌剂或饲料添加剂。
[0008] 所述长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因用于制备抑制抗金黄色葡萄球菌的抑 菌剂。
[0009] 所述长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因为序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示。
[0010] 制备方法：
[0011] (1)用特定引物Pl和P2对长牡蛎C型凝集素CgCLec-2编码区片段进行扩增；
[0012] Pl :5, -CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3，
[0013] P2 :5' -CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3'
[0014] (2)采用BamH I和Hind III对上述的重组子及pET32a载体进行酶切，酶切片段通 过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
[0015] (3)将上述构建重组子转入Transetta DE3表达菌株中进行诱导培养，而后纯化， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白CgCLec-2。本发明所具有的优 占.
[0016] 本发明中体外重组表达的长牡蛎凝集素-2(CgCLec-2)蛋白对革兰氏阳性菌金黄 色葡萄球菌有抑制生长作用，作为一种有效的模式识别受体，在开发抗菌类药物、新型免疫 制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实时例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2以钙离子依赖的形式识别 并结合PAMPs。
[0018] 图2为本发明实施例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2对金黄色葡萄球菌生长的 影响。
【具体实施方式】
[0019] 下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0020] 实施例1
[0021] 长牡蛎凝集素-2(CgCLec-2)基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：
[0022] 1、重组载体的构建
[0023] 本发明中采用的重组载体为pET_32a原核表达载体。
[0024] 通过PCR技术，采用5'末端分别添加了 Bam H I和Hind HI特定酶切位点的基因 特异性引物，对长牡蛎C型凝集素CgCLec-2编码区片段进行扩增：
[0025] 基因特异性引物为：
[0026] Pl(5' -CGCGGATCCATGGATACAGAAGTGACCTCAT-3' ）：
[0027] P2 (5' -CCCAAGCTTCTATAAAGTTTGTTCACAGATG-3'），
[0028] 反应条件为：首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环：94°C变性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸45秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。将扩增片段纯化回收， 与PMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BamH I和Hind III两个酶酶 切质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回 收；回收目的片段与经BamH I和Hind III两个酶酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体 的构建。上述实验操作的具体方法请参照《分子克隆第三版》。
[0029] 2、重组蛋白CgCLec-2的表达
[0030] 将构建好的重组载体转化表达宿主菌Transetta(DE3)中，并筛选阳性克隆，测序 确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm，37°C培养至 OD 600 = 0.4-0.8。加入IPTG，使终浓度达到lmmol L-1，继续培养4小时。4°C，5000rpm， 离心10分钟，收集菌体，于-20°C冻存备用。取ImL菌液离心，弃去上清后，加入80 y L水和 20 y L的5倍的蛋白上样缓冲液，100°C煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
[0031] 3、重组蛋白CgCLec-2的纯化与复性
[0032] 本发明中重组蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化。获得了变性重组蛋白，用透析缓 冲液透析复性。
[0033] 具体操作步骤如下：
[0034] 镍琼脂糖凝胶柱纯化分离带His标签的重组蛋白变性状态下蛋白纯化步骤如下：
[0035] (1)镍琼脂糖凝胶FF装柱，I. 6 X 20cm，柱床体积为IOmL ;
[0036] (2)用缓冲液 I (缓冲液 I 为 50mmol L-ITris-Hcl 缓冲液，pH = 7. 4, 50m mol L-INaCl, 8mol L-I尿素）平衡2-5个床体积，流速为2mL min-1 ;
[0037] (3)经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000转， 4°C离心30分钟，上清液用0. 45 y m滤膜过滤后，过柱，流速为ImL min-1 ;
[0038] (4)用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2mL min-1 ;
[0039] (5)用含有50mmol L-I咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min-1 ; [0040] (6)用含400mmol L-I咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集。
[0041] (7)用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；
[0042] (8)用纯水流洗5个柱床体积，再用20 %的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL min-1，柱子置于4°C环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通 过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱 甘肽、0.2mM 氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HClUOOmM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及 梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、1M、0M，最后一次透 析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4°C透析12h，即得到SEQ ID NO. 1所示的长牡蛎 CgCLec-2基因重组蛋白。
[0043] SEQ ID NO. 1
[0044] MDTEVTSLQDKYTDQKDNITDLGDTLKILLREQEWMVSNVSELHGKMQEMRDATLVIHQQVSEQLNHTE DSLRRFFVESFQNITNEYFENLQNISKQNVTSSLFEVVFKQANAAVALKEEIRKYALMMERLQFEISELKQNITLNK GTPSSPVTCPVGWSMFETSCYMAFNQQLSWNDASMKCLMSGSKLVEIETKAENDFLTTTLPNFKAGEAYWTGGKDDV TEGLWVWISSGATFGFLNWNQGEPNDAGGIEDC LQLYKRRGRKTYffNDNYCERSFNFICEQTL
[0045] ?长度：286个氨基酸
[0046] ?类型：氨基酸
[0047] ?链型：单链
[0048] ?特性：分子量为33kDa，等电点为4. 75,具有一个保守的CRD结构域。
[0049] ?来源：长牡蛎
[0050] 实施例2
[0051] 长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2以钙离子依赖的形式识别并结合糖类
[0052]将20 y g的LSP，PGN和MAN分别溶于50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中（pH 9. 6)， 每孔100^包被酶标板，41：过夜。为了避免非特异性结合加入200 ^3%854,371：封闭 Ih。之后，每孔加入IOOy L 2倍梯度稀释的重组蛋白rCgCLec-2,在加入终浓度为IOmM Ca2+ 或者不加入Ca2+的条件下18°C孵育3h。加入100 y L用3% BSA稀释的大鼠抗rCgCLec-2 的多克隆抗体（l:l〇〇〇)，37°C孵育lh。加入IOOyL HRP标记的羊抗大鼠IgG(l:3000)， 37°C孵育lh。每次孵育步骤之间用TBST洗3次，每次5min。二抗孵育并彻底清洗结束后， 每孔加入100 U L TMB，避光发色30min后，加入50 y L 2M NaOH终止发色，酶标仪405nm处 读取并记录数值。设rTrx蛋白阴性对照组和TBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据 3次测定结果取平均值作图（参见图1)。数据分析时，实验组（P)-空白对照（B)/阴性对 照组（N)-空白对照（B) >2. 1的孔视为阳性（参见图1)。实验表明重组蛋白CgCLec-2在 没有钙离子的条件下，LPS，PGN和MN的P/N都小于2. 1，表明对该三类糖都没有结合能力 (参见图1.A);重组蛋白rCgCLec-2在IOmM钙离子存在的条件下当蛋白浓度为17yg I71 时，LPS孔的P/N值为3. 37,当蛋白浓度为2. 12 y g I71时，PGN孔的P/N值为2. 23,当蛋白 浓度为68 y g I71时，MN孔的P/N值为3. 95。随着蛋白浓度的升高，各个PAMPs的P/N值 逐渐变大，表明对糖的结合能力逐渐增强。该实验表明重组rCgCLec-2蛋白对糖类的识别 和结合有钙离子依赖性。
[0053] 实施例3
[0054] 长牡蛎重组蛋白rCgCLec-2的抑菌活性
[0055] 1、微生物的培养及制备
[0056] 金黄色葡萄球菌用LB培养基37 °C，220rpm，培养到对数生长期时，用 Tris-HCl(50mmol L_l，pH = 8. 0)稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1X103CFU。
[0057] 2、重组蛋白CgCLec-2抑菌活性测定
[0058] 对数生长期的金黄色葡萄球菌离心收集后用TBS (50mM Tris-Hcl，150mM NaCl)清 洗重悬（IO4CFU)。50 y L的长牡蛎重组蛋白CgCLec-2与等体积的金黄色葡萄球菌重悬液在 CaCl2终浓度IOmM的条件下室温孵育2h。取20 y L上述混合物于平底96孔板（Costar， Fisher)中，每孔加入200 y L LB液体培养基，于酶标仪中37°C振荡培养，每隔Ih分别检测 记录各孔0D600值。另设rTrx蛋白对照组和TBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据 3次测定结果取平均值作图（参见图2)。实验表明重组蛋白CgCLec-2在没有钙离子的条件 下对LPS，PGN和MAN的P/N值〈2. 1，表明没有结合能力（参见图LA);重组蛋白CgCLec-2 在IOmM的钙离子存在的条件下随着。
【权利要求】
1. 一种具有抑菌活性的长牡蛎c型凝集素-2 (CgCLec-2)重组蛋白的应用，其特征在 于：长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制备抑菌剂或饲料添加剂。
2. 按权利要求1所述的所述的具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素-2 (CgCLec-2)基因 重组蛋白的的应用，其特征在于：所述长牡蛎C型凝集素-2(CgCLec-2)基因用于制备抑制 抗金黄色葡萄球菌的抑菌剂。
【文档编号】A61K38/36GK104474557SQ201410686778
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】宋林生, 李慧, 张峘, 王玲玲 申请人:中国科学院海洋研究所