一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，涉及动物模型构建领域，包括将若干CD仔猪养殖至18～25日龄，均分为感染组A和对照组B，判定CD仔猪体内不存在HPS病原、不含APP病原或APP抗体后，饲养至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种HPS菌种；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射培养基，得到空白组B′，观察并检测攻毒组A′、空白组B′，提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，判定攻毒组A′的肺脏组织中存在HPS病原的同时，空白组B′的肺脏组织的中不存在HPS病原。本发明能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福利的相关要求。
【专利说明】一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物模型构建领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建 方法。
【背景技术】
[0002] HPS (Haemophilus parasuis，副猪嗜血杆菌）是一种定居在猪上呼吸道部位的革 兰氏阴性短小杆菌，HPS的毒力菌株侵入猪体后会使猪产生严重的系统性炎症疾病，临床表 现以格拉泽氏病（Glaser'S Disease)，即血纤维蛋白性心包炎、多发性关节炎和脑膜炎； 有些感染猪只还表现出急性肺炎和急性败血症。
[0003] 从上个世纪末至今，HPS感染给世界各国的养猪业造成了严重的损失，HPS已成为 猪场最主要的细菌性病原体之一，在我国呈全国性病发趋势。
[0004] 现阶段没有预防HPS感染的有效措施。通常，在猪感染HPS后大量使用抗生素进 行治疗，但一方面抗生素使用会造成养殖成本上升；另一方面大量抗生素的使用会导致排 泄物和肉制品中存有抗生素残留，排泄物排入环境中容易造成环境污染，人体摄入含有抗 生素的肉制品后，抗生素会在人体内聚集，导致人体抵抗力降低。因此，需要降低猪感染HPS 后抗生素的使用量。
[0005] 目前降低抗生素使用量的途径包括使用疫苗和培育抗病猪种，由于抗病育种可以 从根本上解决病原体感染，因此，抗病育种成为未来猪育种产业发展的新方向。研宄显示： 常规的猪群中，不同的猪个体感染HPS后的表现存在差异，该差异与猪个体的遗传基因有 关，该现象为通过遗传改良培育出抗性品系和/或抗性品种提供了充分的依据。
[0006] 目前，本领域技术人员通过建立感染模型来筛选相关抗病基因，建立可靠的活体 感染模型是培育出抗性品系和/或抗性品种的关键。建立感染模型（以下简称建模）具体 是指：通过实施攻毒试验，收集攻毒后（含对照）的猪只在临床病征、生长发育、体温变化、 血液参数和免疫指标表型数据用以评判建模效果，最终在实验室（或实验动物中心等实验 性场地）复制出病原体感染猪只的相关生物学现象。
[0007] 根据实验猪只的区别，可以将现有的感染模型分为普通级、⑶级 (Colostrum-Deprived,禁食母猪初乳）、CDCD 级（Caesarean-Derived and Colostrum-Deprived，剖腹产、禁食母猪初乳）和 SPF 级（Specific pathogen free，无特定 病原体）。
[0008] 普通级感染模型建立时，直接通过母体初乳对仔猪进行喂食，并对仔猪进行多次 疫苗免疫，由于母体初乳中含有大量的抗体，可能会导致仔猪机体产生免疫，同时，进行疫 苗免疫后也会产生抗体，产生抗体后的仔猪经HPS攻毒后可能会自行康复，难以复制HPS感 染；HPS是一种寄居在猪上呼吸道部位的常见菌和机会性致病菌，母猪通常携带有HPS，因 此会直接感染猪仔，影响建模效果。总之，普通级感染模型建立过程中存在较多影响因素， 尤其是模型不稳定、结果不准确。
[0009] CDCD级感染模型建立时，仔猪是通过剖腹产得到的，对母猪实施剖腹产时，需要配 备专业能力较强的外科手术医生和严格的无菌手术室，成本较高，难以推广。
[0010] SPF级感染模型建立时，需要使用HPS阴性猪，现在，HPS阴性猪群已很难找到，建 模成本较高，操作难度较大，可靠性较低，难以推广。
[0011] CD级感染模型建立时，仔猪经母猪自然分娩后立即与猪舍隔离，一方面隔绝了 CD 仔猪出生早期HPS在上呼吸道的定植，另一方面由于禁食初乳最大程度上避免了母体抗体 的不利影响；建模期间不需要苛刻的无菌环境，饲养条件也相对宽松，操作较为简单。所以 CD仔猪是最适合作为HPS活体感染建模的实验动物，综合比较来看有望使得格拉泽氏病的 复制更稳定、更现实、更可靠。
[0012] 目前，Blanco等人所在的课题组（西班牙CISA)以及与之合作的PIC种猪公司和 美国Minnesota大学相关课题组利用CD仔猪进行HPS感染建模。
[0013] 现有的⑶级感染模型建立时存在以下缺陷：
[0014] (I)CD仔猪喂养时，先使用牛初乳喂食3天，通常来讲，牛初乳的获得并不方便且 需要做灭菌处理，不仅提高了实验成本而且可能会因含有牛肠炎病毒增加 CD仔猪腹泻风 险，CD仔猪的死亡率较高。
[0015] (2)已有模型对21日龄的⑶仔猪进行攻毒，由于21日龄的⑶仔猪体内器官发育 尚不完善，相关实验结果可能难以全面反映猪只感染HPS后的症状，准确度较低；同时，使 用与生产上断奶日龄（15?21日龄）相接近的CD仔猪进行实验，不太符合动物福利的相 关举措。
[0016] (3)现有的⑶仔猪至感染前存活率仅为50%?78. 9%，存活率较低，实验成本较 尚。
【发明内容】
[0017] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌感染仔猪 模型的构建方法，能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福 利的相关要求。
[0018] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的 构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0019] 步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18?25 日龄，将未死亡的⑶仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B ;待感染组A和对照组B的 所有⑶仔猪生长至30?40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有⑶仔猪的鼻拭子和 非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸 膜肺炎放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二；
[0020] 步骤二、待感染组A和对照组B的所有⑶仔猪生长至40?70日龄时，向感染组 A中所有CD仔猪的气管内接种剂量为107CFU?109CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到 攻毒组Y ;接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同 的培养基，得到空白组V，转入步骤三；
[0021] 步骤三、接种HPS细菌1?20天后，分别提取攻毒组A'、空白组B'的肺脏组织 的总DNA，当攻毒组Y的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组^的肺脏组织的 总DNA中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组Y的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病 原，或空白组B'的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一?步骤三。
[0022] 在上述技术方案的基础上，步骤一中所述将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔 离，养殖至18?25日龄包括以下步骤：母猪自然分娩时人工助产，防止仔猪分娩后接触母 猪、地面、栏舍及其他猪场物品，立即放入温度为33?35°C的无菌保温箱中，待CD仔猪体表 干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37°C的温开水约40ml，出生 后3?5h内，将⑶仔猪转移至实验动物中心负压条件下，温度为28?35°C的仔猪保育栏 中；
[0023] ⑶仔猪的1?12日龄均喂食人工乳，其中：1?2日龄每日喂食次数为5次，3? 4日龄每日喂食4次，5?14日龄每日喂食3次；每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加； CD仔猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15?21日龄每日喂食3次， 22日龄后自由采食颗粒饲料和饮水，养殖至18?25日龄时，⑶仔猪的存活率为80 %? 85%〇
[0024] 在上述技术方案的基础上，自⑶仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料，⑶仔猪13日 龄后强制性在人工乳中添加 CD仔猪颗粒料，首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、 颗粒料28g，之后按照颗粒料每日5?10 %的比例递加，对应人工乳粉以5?10 %的比例减 少。
[0025] 在上述技术方案的基础上，步骤一中将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔 猪进行隔离，饲养至18?25日龄，包括以下步骤：将⑶仔猪饲养至3日龄后，判定⑶仔猪 拉稀，根据CD仔猪的体重，自发现日起，连续3天，向对应CD仔猪早晚分别注射50 μ Ι/kg的 土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天灌食糖盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3. 5g 氯化钠和2. 5g碳酸氢钠。
[0026] 在上述技术方案的基础上，步骤一中所述采集感染组A和对照组B中所有⑶仔猪 的鼻拭子和非抗凝外周血之后，还包括以下步骤：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外 周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除，转到步 骤二。
[0027] 在上述技术方案的基础上，步骤二和步骤三之间还包括以下步骤：观察攻毒组 A'、空白组B'中所有CD仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情 况；
[0028] 采集所有攻毒组Y和空白组V中⑶仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参 数；攻毒1?20天，后将攻毒组A'、空白组B'中所有⑶仔猪麻醉并放血，采集每头⑶ 仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组 织；并对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察。
[0029] 在上述技术方案的基础上，步骤二包括具体以下步骤：待感染组A和对照组B的所 有⑶仔猪生长至45日龄时，向感染组A中所有⑶仔猪气管内接种剂量为109CFU、分散于 培养基中的HPS细菌进行攻毒实验；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射相同体积的培养 基，得到空白组B'。
[0030] 在上述技术方案的基础上，所述HPS细菌选用血清型为1、5、10、12、13或14的HPS 细菌中的任意一种。
[0031] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0032] (1)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括使用人工乳喂食至12 日龄；，13?21日龄，采用人工乳辅助颗粒饲料喂食，每日喂食3次，22日龄后，进行颗粒 饲料自由采食和饮水。期间，自CD仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料。与现有技术中仔猪 存活率50 %?78. 9 %，存活率较低，实验成本较高相比，本发明的CD仔猪存活率为80? 85%，能够提高仔猪的存活率，有效降低实验成本。
[0033] (2)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括对40?70日龄的⑶ 仔猪进行攻毒实验，与现有技术中使用21日龄的CD仔猪，测定结果准确度较低，与动物福 利相违背相比，本申请的CD仔猪发育较完善，能够准确反映实际养殖过程中的猪群感染 HPS后的症状，为研宄和预防HPS感染提供较好的研宄平台，测定结果的准确度较高，符合 动物福利理论。
[0034] 本领域技术人员在进行模型的构建时，通常采用的为21日龄仔猪，即使参考其他 文献，由于不同仔猪的生长发育情况不同，本领域技术人员不能仅仅参考其他品种仔猪的 攻毒时间，轻易得到本发明的仔猪攻毒时间，即：该时间不是本领域技术人员根据实际情况 能够轻易获得的。
[0035] (3)本发明中副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括判定非抗凝外周血中 含有APP或者非抗凝外周血含有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。本发明根据多次试 验得到：APP或相关抗体的存在对HPS感染的影响较大，移除含有APP病原或者非抗凝外周 血含有APP血清抗体的CD仔猪，能够提高结果的准确性和建模的成功率。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为本发明实施例1和3中攻毒前⑶猪只体内HPS病原检测的PCR电泳图；
[0037] 图2为本发明实施例1中HPS攻毒前后通城⑶猪外周血总白细胞对比图；
[0038] 图3为本发明实施例1中HPS攻毒前后通城⑶猪外周血主要白细胞亚类对比图；
[0039] 图4为本发明实施例1中HPS攻毒后通城⑶猪对照组与攻毒组猪只体温变化对 比图；
[0040] 图5为本发明实施例1中通城⑶猪攻毒组和对比组的腹膜、脾脏、肺脏、心脏、脑 膜、大脑组织细胞对比图；
[0041] 图6为本发明实施例1中通城⑶猪攻毒后肺脏组织中HPS的PCR鉴定电泳图；
[0042] 图7为本发明实施例3中HPS攻毒后杜长大⑶猪对照组与攻毒组猪只体温变化 对比图。
[0043] 图4、5、6、7中：所有C表示对照组，所有I表示实验组。
【具体实施方式】
[0044] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
[0045] 本发明实施例提供一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，包括以下步骤：
[0046] Sl :将自然分娩得到的若干⑶仔猪进行隔离后、放入温度为33?35°C的无菌保 温箱中，待CD仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37°C 的温开水约40ml，出生后3?5h内，将⑶仔猪转移至实验动物中心负压条件下，温度为 28?35°C的保育栏中。
[0047] S2 :参见表1所示，CD仔猪的1?12日龄均喂食人工乳（45°C温开水冲泡，每升含 140g人工乳粉），其中：1?2日龄每日喂食次数为5次，3?4日龄每日喂食4次，5?14 日龄每日喂食3次。每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加。
[0048] ⑶仔猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15?21日龄每日喂 食3次，18?25日龄后自由采食颗粒饲料和饮水，转入步骤S3。
[0049] 步骤S2期间，所有⑶仔猪1日龄时肌肉注射浓度为10%、体积为Iml的右旋糖酐 铁注射液；1?3日龄时，根据⑶仔猪的体重，每天向每头⑶仔猪注射50 μ Ι/kg的肌注土 霉素注射液。
[0050] 3日龄后，若有⑶仔猪拉稀，则根据对应⑶仔猪的体重，自发现日起，连续3天，向 对应CD仔猪早晚分别注射50 μ Ι/kg的土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天灌食糖 盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3. 5g氯化钠和2. 5g碳酸氢钠。攻毒前2周停用任何抗 生素药品。
[0051] 其中，自⑶仔猪7日龄起开始训练采食颗粒料；⑶仔猪13日龄后强制性在人工 乳中添加 CD仔猪颗粒料，首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、颗粒料28g，之后按 照颗粒料每日5?10%的比例递加，对应人工乳粉以5?10%的比例减少。
[0052] 通常，⑶仔猪2周龄可主动采食颗粒料，但仍有部分⑶仔猪不食，故13?21日 龄仍主要以人工乳辅助进行喂食，防止CD仔猪因为进食不足影响健康状况和存活率，本发 明实施例中⑶仔猪的存活率为80%?85%，高于现有技术中的50%?78. 9%。
[0053] S3 :将未死亡的⑶仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B。待感染组A和对 照组B的所有⑶仔猪生长至30?40日龄时（最优为35日龄），采集感染组A和对照组B 中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血。
[0054] 判定鼻拭子中不存在HPS病原、非抗凝外周血中不含APP(Actinobacillus pleuropneumoniae，猪胸膜肺炎放线杆菌）病原或APP血清抗体，转入步骤S5。
[0055] 其中，HPS病原采用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）法检测， APP病原或APP血清抗体米用ELISA (enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附 测定）法检测。
[0056] 判定鼻拭子中存在HPS病原、非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含 有APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除。
[0057] S4 :采集感染组A和对照组B中的所有⑶仔猪的外周血2ml，测定血液中的 WBC(血液总白细胞）、NEU (中性细胞）、LYM(淋巴细胞）、Μ0Ν0 (单核细胞）、E0S (嗜酸性粒 细胞）、BASO (嗜碱性粒细胞）、RBC (红细胞）、HGB (血红蛋白浓度）、HAT (红细胞压积）、 MCV (平均红细胞体积）、MCH (平均红细胞血红蛋白含量）、RDW (红细胞分布宽度）和PLT (血 小板），（以下简称血液参数）转入S5。
[0058] S5 :待感染组A和对照组B的所有⑶仔猪生长至40?70日龄（最优为45日龄） 时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种剂量为107CFU?109CFU的HPS病原，HPS病原 选用血清型为1、5、10、12、13或14的即3病原中的任意一种，得到攻毒组"，即3的培养 基选用TSB培养基（Tryptic Soy Broth，胰蛋白胨大豆肉汤培养基）
[0059] 向对照组B中所有⑶仔猪气管内注射相同体积的TSB培养基，得到空白组B'，转 入步骤S6。
[0060] S6:观察攻毒组A'、空白组B'中所有⑶仔猪的行为举止、呼吸、跛行、关节肿胀、 神经症状、咳嗽和进食情况。
[0061] 采集所有攻毒组Y和空白组V中⑶仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参 数，转入步骤S7。
[0062] S7:攻毒1?20天后，将攻毒组Y、空白组V中所有⑶仔猪麻醉并放血，采集每 头CD仔猪的颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和 大脑组织。并对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察，转入步骤S8。
[0063] S8:分别提取攻毒组A'、空白组B'的肺脏组织的总DNA，判断攻毒组A'的肺脏 组织的总DNA中存在HPS病原的同时，空白组V的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原。 综合临床病征、组织病理和细菌鉴定判定HPS感染，若是，建模成功；否则，重复执行步骤 Sl ?S8〇
[0064] 表1，⑶仔猪饲喂方案
[0065]
【权利要求】
1. 一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18?25日龄， 将未死亡的⑶仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B ;待感染组A和对照组B的所有 ⑶仔猪生长至30?40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有⑶仔猪的鼻拭子和非抗凝 外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸膜肺炎 放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二； 步骤二、待感染组A和对照组B的所有⑶仔猪生长至40?70日龄时，向感染组A中 所有CD仔猪的气管内接种剂量为107CFU?109CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到攻毒 组A';接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同的培 养基，得到空白组B'，转入步骤三； 步骤三、接种HPS细菌1?20天后，分别提取攻毒组A'、空白组B'的肺脏组织的总 DNA，当攻毒组f的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组V的肺脏组织的总DNA 中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组A'的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原，或 空白组V的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一?步骤三。
2. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤一 中所述将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔离，养殖至18?25日龄包括以下步骤：母猪 自然分娩时人工助产，防止仔猪分娩后接触母猪、地面、栏舍及其他猪场物品，立即放入温 度为33?35°C的无菌保温箱中，待⑶仔猪体表干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使 用奶瓶饲喂温度为37°C的温开水约40ml，出生后3?5h内，将⑶仔猪转移至实验动物中 心负压条件下，温度为28?35°C的仔猪保育栏中； ⑶仔猪的1?12日龄均喂食人工乳，其中：1?2日龄每日喂食次数为5次，3?4日 龄每日喂食4次，5?14日龄每日喂食3次；每次的喂食量根据日龄的增长逐渐增加；⑶仔 猪自13日龄起，采用人工乳并辅助颗粒饲料喂食，其中：15?21日龄每日喂食3次，22日 龄后自由采食颗粒饲料和饮水，养殖至18?25日龄时，⑶仔猪的存活率为80 %?85%。
3. 如权利要求2所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：自CD仔 猪7日龄起开始训练采食颗粒料，CD仔猪13日龄后强制性在人工乳中添加 CD仔猪颗粒料， 首次添加量为：每升流食中含人工乳粉112g、颗粒料28g，之后按照颗粒料每日5?10%的 比例递加，对应人工乳粉以5?10%的比例减少。
4. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：步骤一 中将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18?25日龄，包括以下 步骤：将CD仔猪饲养至3日龄后，判定CD仔猪拉稀，根据CD仔猪的体重，自发现日起，连续 3天，向对应CD仔猪早晚分别注射50 y 1/kg的土霉素注射液和头孢噻呋钠注射液，并每天 灌食糖盐水，每升糖盐水中含20g葡萄糖、3. 5g氯化钠和2. 5g碳酸氢钠。
5. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤一 中所述采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血之后，还包括以下 步骤：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有 APP血清抗体，将对应的CD仔猪移除，转到步骤二。
6. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤二 和步骤三之间还包括以下步骤：观察攻毒组A'、空白组B'中所有⑶仔猪的行为举止、呼 吸、跛行、关节肿胀、神经症状、咳嗽和进食情况； 采集所有攻毒组A'和空白组B'中CD仔猪的外周血，检测所有外周血的血液参数；攻 毒1?20天，后将攻毒组A'、空白组B'中所有⑶仔猪麻醉并放血，采集每头⑶仔猪的 颈部淋巴结、腹股沟淋巴结、腹膜、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、肺脏、心、脑膜和大脑组织；并 对腹膜、脾脏、心脏、肺脏、脑膜、大脑组织进行切片并染色观察。
7. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，步骤二 包括具体以下步骤：待感染组A和对照组B的所有⑶仔猪生长至45日龄时，向感染组A中 所有CD仔猪气管内接种剂量为109CFU、分散于培养基中的HPS细菌进行攻毒实验；向对照 组B中所有CD仔猪气管内注射相同体积的培养基，得到空白组B'。
8. 如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于：所述HPS 细菌选用血清型为1、5、10、12、13或14的HPS细菌中的任意一种。
【文档编号】A61K35/74GK104488823SQ201510011558
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月9日 优先权日:2015年1月9日
【发明者】陈洪波, 程蕾, 赵书红, 张晶, 向敏, 侯永清, 高其双, 郭玲, 邱银生, 黎旺明 申请人:武汉轻工大学