本发明属于中药领域，特别涉及一种红背叶根的有效部位提取物，还涉及该提取物的制备方法和用途。
背景技术：
肝纤维化是严重危害人类身心健康的疑难病之一，至今仍未发现有效的防治办法。肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化发展的前期过程，在决定慢性肝病患者预后的诸多因素中起着至关重要的作用，如能在演变为肝硬化之前，通过某种手段阻断或逆转肝纤维化的发生与发展，在慢性肝病治疗学上将产生一个重大突破。现代医学方面,秋水仙碱是较早应用于临床的抗肝纤维化药物，但毒副作用较强，临床应用受到限制。糖皮质激素和D-青霉胺等由于副作用大而未被广泛采用。脯氨酸4-羟化酶抑制物、前列腺素E类似药物、γ-干扰素、前胶原肽、肝细胞生长因子、白介素10等目前多处于实验阶段，且其制剂及来源均存在诸多缺点，西药方面目前尚无成熟有效且副作用小的抗肝纤维化药物。中医药有关抗肝纤维化的研究工作近年来亦取得了可喜进展。不少方剂经实验或临床研究证明具有一定的抗肝纤维化作用，目前集中在疏肝活血化瘀、益气补肾、软坚消癥、扶正化瘀等中药的抗肝纤维化的研究，如强肝软坚汤、扶正化瘀319方、桃仁提取物、人工虫草菌丝、复方861合剂等。但大多停留在实验研究或临床疗效观察，目前尚无具有显著疗效的药物上市。
红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.–Arg.的根。别名红背娘、红帽顶(《广西中草药》)，红罗裙(广州空军《常用中草药手册》)。分布我国中部和东南、华南，通常以根、叶入药。其根味甘，性平。功效清热解毒，祛风除湿，散瘀止血，平喘，杀虫止痒。传统应用于治肠炎腹泻，痢疾，黄疸型肝炎，尿路感染和结石，肾炎，小便不利，血尿，血崩，白带，湿疹，荨麻疹，痈疮肿毒，疮疡久不收口等症。近代医学研究表明，红背叶根中具有止咳、祛痰作用，抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。
红背叶根水提物及水提醇沉所得浸膏具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用，可在临床上用以治疗慢性肝炎和肝硬化。研究结果表明红背叶根可显著抑制四氯化碳(CCL4)复合因素及酒精性肝纤维化大鼠血清中的致肝纤维化的两个重要因子(TGF-β1、TIMP-1)，且模型动物肝纤维指标(HA、Ⅲ型前胶原)，肝功指标(ALT、AST)都有显著降低，并有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用。因此，进一步对红背叶根进行抗肝纤维化有效部位的筛选及用途研究具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种红背叶根提取物及其制备方法和用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种红背叶根提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)红背叶根药材用6-12倍量60％-90％乙醇提取1-2小时，提取1-3次，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩；
(2)将步骤(1)所得浓缩液离心，上清液减压浓缩备用；
(3)将步骤(2)得到的浓缩液，以1.3-1.7柱体积/小时的流速，上大孔吸附树脂柱；
(4)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇洗脱，洗脱流速为2.3-2.7柱体积/小时；
(5)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后得到红背叶根有效部位提取物。
所述步骤(1)中乙醇浓度为60％-90％。
所述步骤(1)中乙醇浓度为70％-80％。
所述步骤(4)中乙醇浓度为20％-60％。
所述步骤(4)中乙醇浓度为30％-50％。
所述步骤(5)得到的红背叶根有效部位提取物是以生物碱类及黄酮类为主要活性成分的提取物。
由上述制备方法制得的红背叶根提取物。
上述红背叶根提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明的有益效果如下:
1.本发明的提取工艺简便合理，可以得到红背叶根有效部位提取物。
2.本发明的红背叶根提取物，在肝功能指标检测方面，本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的ALT和AST(p<0.01)，秋水仙碱对血清中的ALT和AST也呈一定程度的降低趋势(p<0.05)。其他提取物组也可降低模型动物血清中的ALT和AST(p<0.05)，但作用强度较本发明提取物差。在肝纤维化指标(血清中HA、LN、Ⅲ前胶原)的检测方面，本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的HA、LN、Ⅲ前胶原(p<0.01)，秋水仙碱对血清中的HA、LN、Ⅲ前胶原、Ⅳ型胶原也呈一定程度的降低趋势(p<0.05)。其他提取物组也可在一定程度上降低模型动物血清中的ALT和AST，但作用强度较本发明提取物差。在血清中TGFβ1和TIMP-1的检测方面，本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的TGFβ1和TIMP-1，秋水仙碱对血清中的TGFβ1和TIMP-1也呈降低趋势(见表1)。其他提取物组也可在一定程度上降低模型动物血清中的TGFβ1和TIMP-1，但作用强度较本发明提取物差。上述结果说明本发明提取物具有较理想的抗肝纤维化作用，是较有前途的候选药物。
具体实施方式
本发明是一种红背叶根提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)红背叶根药材用6-12倍量乙醇提取1-2小时，提取1-3次，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩。优选的，步骤(1)中乙醇浓度为60％-90％，更优选的，乙醇浓度为70％-80％。红背叶根是双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.–Arg.的根。
(2)将步骤(1)所得浓缩液离心，上清液减压浓缩备用。
(3)将步骤(2)得到的浓缩液，以1.3-1.7柱体积/小时的流速，上中等极性或非极性的大孔吸附树脂柱。
(4)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇洗脱，洗脱流速为2.3-2.7柱体积/小时。优选的，步骤(4)中乙醇浓度为20％-60％，更优选的，乙醇浓度为30％-50％。
(5)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后即得到红背叶根有效部位提取物，该红背叶根有效部位提取物是以生物碱类及黄酮类为主要活性成分的提取物。
上述所得到的红背叶有效部位根提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实施例。最优选实施例1。
实施例1
将红背叶根药材，用乙醇回流提取2次，乙醇浓度75％，加醇量为药材重量的10倍，提取时间90min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30-50％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.38％。
实施例2
将红背叶根药材，用乙醇回流提取3次，乙醇浓度90％，加醇量为药材重量的12倍，提取时间120min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30-60％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.29％。
实施例3
将红背叶根药材，用乙醇回流提取1次，乙醇浓度60％，加醇量为药材重量的6倍，提取时间60min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用20-40％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.31％。
实施例4
将红背叶根药材，用乙醇回流提取3次，乙醇浓度70％，加醇量为药材重量的7倍，提取时间80min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用40-50％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.35％。
实施例5
将红背叶根药材，用乙醇回流提取1次，乙醇浓度120％，加醇量为药材重量的10倍，提取时间60min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。
取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用40-60％乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.27％。
实施例6药理实验例
为评价红背叶根提取物的抗肝纤维化效果进行其抗肝纤维化的实验研究。
1实验材料
1.1实验动物 普通级SD大鼠，雌雄各半，体质量约220±10g。
1.2药物 红背叶根提取物为实验例1制备的提取物(HE)；秋水仙碱片，西双版纳药业有限公司；按常规方法制备红背叶根3种不同提取物：石油醚提取物(PE)，乙酸乙酯提取物(EE)，正丁醇提取物(BE)。
1.2试剂 TGFβ1试剂盒，上海森雄科技实业有限公司；TIMP-1试剂盒，上海森雄科技实业有限公司。分析纯CCL4，汕头光华试剂厂；花生油(100％)，山东鲁花集团有限公司；胆固醇，中国惠光生化试剂有限公司。
2.实验方法
2.1造模 肝纤维化模型组及各给药组大鼠上午皮下注射40％四氯化碳花生油(第1次0.5mL/100g体质量，后每隔3日皮下0.3mL/l00g体质量)，下午给药物组予相应药物，模型组予生理盐水灌胃(每日1次，每次lmL/100g体质量)。模型及给药组均给予高脂饮食(79.5％玉米粉+20％猪油+0.5％胆固醇)，正常组予正常饮食，实验共进行6周。
2.2动物分组 从造模之日起将动物随机分为15组：正常对照组、肝纤维化模型组、秋水仙碱组(灌胃给药，0.9×10-5g/kg)及红背叶根4种不同提取物组：本发明提取物(HE)，石油醚提取物(PE)，乙酸乙酯提取物(EE)，正丁醇提取物(BE)均分高(high)、中(middle)、低剂量(low)组(简写h,m,l)，共12组。红背叶根4种提取物高、中、低剂量组则分别按12g·kg-1、6g·kg-1、3g·kg-1生药量与蒸馏水混合制成水溶液，每天一次性灌胃。模型对照组以等体积生理盐水灌胃。每周复测体重一次，调整药量灌胃，共灌胃l4d。
2.3指标检测 实验期满后，动物禁食不禁水12h，用10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，用真空负压采血管收集，室温静置1.5h，离心15min 2500r/min，取上层血清，分装于离心管中；用AU5400全自动生化分析仪测定血清ALT、AST；用放免法测定血清HA、LN、PCIII；用ELISA法测定血清TGFβ1和TIMP-1(均按试剂说明书进行)。
2.4统计方法 上述各项指标均计算均数与标准差，用统计软件SPSS 11.5进行方差分析及非参数检验。
3.实验结果 结果见表1
3.1肝功(血清中ALT、AST)的变化及比较本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的ALT和AST(p<0.01)，秋水仙碱对血清中的ALT和AST也呈一定程度的降低趋势(p<0.05)。其他提取物组也可降低模型动物血清中的ALT和AST(p<0.05)，但作用强度较本发明提取物差。
2.2.2肝纤维化指标(血清中HA、LN、Ⅲ前胶原)的变化及比较本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的HA、LN、Ⅲ前胶原(p<0.01)，秋水仙碱对血清中的HA、LN、Ⅲ前胶原、Ⅳ型胶原也呈一定程度的降低趋势(p<0.05)。其他提取物组也可在一定程度上降低模型动物血清中的ALT和AST，但作用强度较本发明提取物差。
2.2.3血清中TGFβ1和TIMP-1的变化及比较本发明药物3个剂量组显著可降低模型动物血清中的TGFβ1和TIMP-1，秋水仙碱对血清中的TGFβ1和TIMP-1也呈降低趋势(见表1)。其他提取物组也可在一定程度上降低模型动物血清中的TGFβ1和TIMP-1，但作用强度较本发明提取物差。