Gpx7制备骨髓抑制预防和/或治疗药物的用途的制作方法

本发明涉及蛋白药物领域，具体公开了一种Gpx7在制备骨髓抑制预防和/或治疗药物中的用途。

背景技术：

骨髓抑制是肿瘤放疗、化疗的常见副作用，主要表现是外周血白细胞数和血小板数明显下降，可导致感染、出血甚至死亡，因此寻找保护骨髓使其免受抑制的药物是肿瘤治疗领域的研究热点。一些细胞因子，如促红细胞生成素、集落刺激因子、白细胞介素1β(IL-1β)等已经或正在成为能缓解这一副作用的有效药物。另外,各种抗氧化剂对肿瘤放疗、化疗副作用的防护效应也得到认可，比如目前市场上各种保健品的功效说明中，都无一例外的标示自己是强抗氧化剂，能够促进放化疗后机体造血功能的恢复，但其确切疗效仍然有待考证。

谷胱甘肽过氧化物酶-7(glutathione peroxidase 7,Gpx7)属于谷胱甘肽过氧化物抗氧化酶家族中的一员，该家族成员具有在还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)存在条件下，将过氧化氢或脂质过氧化物分解为水或相应的有机醇的功能，但该成员与家族里其它成员不一样，为不含硒半胱氨酸的抗氧化酶，且体外该蛋白的谷胱甘肽过氧化物酶样活性很低。已知存在的8个谷胱甘肽过氧化物酶家族成员，GPx1到4是含硒半胱氨酸的抗氧化蛋白，GPx5到8是不含硒半胱氨酸的抗氧化蛋白；其中，GPx1到3蛋白都是一种同源四聚体结构，GPx1主要分布在细胞浆，GPx2主要分布在胃肠道细胞，GPx3则主要分布在血浆，而GPx4是一种单体蛋白，但位于细胞膜上，主要分布在睾丸，在精子发生和成熟过程中至关重要；而GPx5和6也是同源四聚体，GPx7和8是单体蛋白；GPx5仅在附睾细胞存在，GPx6则存在于嗅上皮细胞，GPx7和8均存在于细胞浆内。不含硒半胱氨酸的GPx蛋白与含硒半胱氨酸的蛋白不同之处在于，含硒GPx酶似乎只是单纯的清除自由基作用，而不含硒GPx酶还有感受细胞内氧化应激作用。

研究资料显示：Gpx7基因缺失的细胞显示活性氧水平和错误折叠的蛋白都会增高， Gpx7基因完全敲除的动物试验也表明容易引发系统性的氧化应激，肿瘤发生率增高，寿命缩短。进一步研究表明：细胞内新表达出来的蛋白都要经过正确的折叠才能具有功能，而这种蛋白折叠需要蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)，过氧化氢，和Gpx7或Gpx8蛋白三者共同存在情况下才能迅速完成；Gpx7蛋白存在情况下反应的速率比Gpx8蛋白存在情况下快速。从酶动力学上看，GPX7蛋白表现出比其它不含硒蛋白更强的结合PDI的能力。此外GPx7蛋白还是一种直接过氧化氢中和剂，它中和过氧化氢的速度是GPx8的30倍。

目前研究中，对谷胱甘肽过氧化物酶-7(glutathione peroxidase 7,Gpx7)的研究多集中在肿瘤疾病方面。我们研究发现，Gpx7具有促进化疗后骨髓抑制恢复的功能，而目前国内外尚没有关于此功能的报道，这一新的功能可能为骨髓抑制防治提供新方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有促进化疗后骨髓抑制恢复功能，并能预防和/或治疗骨髓抑制的蛋白Gpx7(谷胱甘肽过氧化物酶-7)，并将其应用于骨髓抑制预防和/或治疗药物的制备。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面公开了一种Gpx7在制备骨髓抑制预防和/或治疗药物中的用途。

优选的，所述骨髓抑制预防和/或治疗药物为提高外周血白细胞和血小板数量、提高骨髓细胞总数的药物。

优选的，所述药物中，唯一有效成分是Gpx7。

优选的，所述药物为静脉注射药物、皮下注射药物或肌肉注射药物。

进一步的，所述Gpx7的氨基酸序列以及核苷酸编码序列均为现有技术。

所述Gpx7既可以为分离纯化获得的天然蛋白，也可以为通过基因技术生产的重组蛋白。

本发明经大量的实验证实，重组蛋白Gpx7具有促进化疗后骨髓抑制恢复功能，并应用于骨髓抑制的预防和/或治疗，具有较好的临床应用前景。

本发明第二方面公开了一种预防和/或治疗骨髓抑制的药物制剂，含有安全有效量的 Gpx7，余量为药学上可接受的载体。

优选的，所述预防和/或治疗骨髓抑制的药物制剂为提高外周血白细胞和血小板数量、提高骨髓细胞总数的药物制剂。

优选的，所述药物制剂中，唯一有效成分是Gpx7。

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。

较优的，所述Gpx7占所述药物制剂总质量的0.0004％～99％。

本发明的药物制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式。

优选的，本发明所述药物制剂为针剂。

较优的，本发明所述药物制剂为静脉注射、皮下注射针剂或肌肉注射针剂。

更优的，所述针剂中，药学上可接受的载体选自磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。

最优的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2～7.4。

本发明揭示了Gpx7促进化疗后骨髓抑制恢复的新功能，Gpx7能明高外周血白细胞和血小板数量、提高骨髓细胞总数，可用于骨髓抑制的治疗以及骨髓抑制预防和/或治疗药物的制备；具有使用安全、有效、稳定等优点。

附图说明

图1：重组GPx7蛋白对5-氟脲嘧啶化疗小鼠外周血白细胞数的影响。

图2：重组GPx7蛋白对5-氟脲嘧啶化疗小鼠外周血血小板数的影响。

图3：重组人GPx7对5-氟脲嘧啶化疗小鼠骨髓细胞恢复的促进作用。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 重组人Gpx7蛋白的表达和纯化方法

重组人Gpx7蛋白的表达和纯化方法为现有技术。可参见2014年05月29日提交的申请号为：201410238296.0的中国专利申请《一种GPx7C重组蛋白的用途》实施例1-2。

实施例2 5-氟脲嘧啶诱发的小鼠骨髓抑制模型建立

8周龄、体重20g左右的SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，购自上海实验动物中心，合格证书号：SCXK(沪)2007-0005。小鼠尾静脉注射5-Fu(250mg/kg)，即可构建小鼠 骨髓抑制模型。

实施例3 原核重组GPx7蛋白注射方案和观察指标

5-氟脲嘧啶注射给药当天即接受重组GPx7蛋白皮下注射，GPx7注射浓度为12mg/kg体重。在5-氟脲嘧啶注射的第0，1，3，5，7，9，11，13天进行小鼠眼眶采血，EDTA抗凝，血细胞计数仪(SYSMEX POCH 100,日本希森美康医用电子(上海)有限公司)计数外周血白细胞数和血小板数；采完眼眶血的小鼠断颈处死，取大腿骨，用预冷的PBS缓冲液冲出骨髓腔细胞，离心沉淀细胞，经预冷的氯化铵悬浮10分钟，以破碎红细胞，采用细胞计数板，在显微镜下计数单核细胞数。

外周血白细胞数和血小板数是直接反映骨髓细胞受化疗药物抑制后恢复能力的绝对指标。从图1和图2可以看出，5-氟脲嘧啶化疗后注射重组人GPx7蛋白的小鼠外周血白细胞和血小板数量分别在第7d和第5d降至最低。重组人GPx7蛋白实验组小鼠的白细胞数量在第7天、第9天、第11天，第13天与对照组相比都有显著性差异(p<0.05)；重组人GPx7蛋白实验组小鼠的血小板在第11天与对照组比有显著差异(p<0.05)。5-氟脲嘧啶化疗小鼠的骨髓细胞数在第3到7天期间处于最低点，随后骨髓细胞开始再生。如图3所示，注射重组人GPx7蛋白的小鼠在第9天、第11天和第13天时骨髓细胞数高于对照组，两者有显著差异(p<0.05)，表明重组人GPx7可显著促进5-氟脲嘧啶诱发的小鼠骨髓抑制后的再生。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。