干细胞介导的磁力刀及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种干细胞介导的磁力刀，本发明还涉及干细胞介导的磁力刀的制备方法和应用，属于生物医学领域。

背景技术：

靶向治疗以其特异性杀灭肿瘤细胞的特点成为了一种极具临床应用前景的肿瘤治疗手段。它是以细胞受体、关键基因和调控分子为靶点，利用具有一定特异性的载体，将治疗药物或其他活性物质选择性地运送到靶点，不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种治疗方案。近年来，人们运用抗体、多肽、核酸适配体等生物分子对脑胶质瘤细胞的识别构建了种类繁多的生物分子靶向策略，通常是通过全身给药的方式，经血液循环输送，运用靶向分子对肿瘤的选择性，以提高药物在肿瘤部位的富集浓度。一系列生物分子靶向药物相继开发出来，有的逐渐应用于临床试验。

然而，目前使用的靶向治疗策略存在诸多问题，初步的临床研究结果仍不理想，并未取得突出的疗效。以脑胶质瘤为例，主要有以下几方面问题：单一的靶向药物难以满足脑胶质瘤细胞高度异质性而将其杀灭；靶向分子自身存在亲和力较低和特异性不高等问题；在静脉给药的输送过程中靶向药物易被网状内皮系统捕获；以及由于血脑屏障和血脑胶质瘤屏障的存在使物质不能有效进入脑胶质瘤等因素，这使得靶向药物无法完全满足靶向治疗的要求。因此，针对这些问题，设计和研制新型靶 向治疗方法成为当务之急。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种干细胞介导的磁力刀，以解决上述问题。

本发明采用了如下技术方案：

一种干细胞介导的磁力刀，其特征在于，包括：磁力刀、以及神经干细胞；所述磁力刀位于所述神经干细胞的内部；其中，所述磁力刀包括，纳米盘本体，由铁镍合金制成；金层，分别位于所述纳米盘本体的两侧，所述纳米盘本体为正方形，其边长为2微米。

优选的，本发明的磁力刀，还可以具有这样的特征：其中，所述纳米盘和所述镀金层的总厚度为44-96纳米。

优选的，本发明的磁力刀，还可以具有这样的特征：其中，所述金层的厚度是2-8nm。

优选的，本发明的磁力刀，还可以具有这样的特征：其中，所述纳米盘本体的厚度是40-80nm。

本发明还提供一种制备干细胞介导的磁力刀的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、在硅片上旋涂光刻胶；

步骤二、将掩膜板放置在前烘过的光刻胶上层，使用紫外光照射，然后使用有机溶剂溶解和去除未暴露在此外光下的光刻胶；

步骤三、利用磁控溅射法沉积一层2nm-8nm的金，形成金层，然后沉积一层40-80nm的铁镍合金，最后沉积另一层2nm-8nm的金，形成另一个金层，从而形成中间一层为铁镍合金，两面具有金层的磁力刀；

步骤四、在丙酮中进行剥离操作，将磁力刀从所述硅片上剥离；

步骤五、将磁力刀与神经干细胞共培养，使神经干细胞吞噬磁力刀，从而使磁力刀进入神经干细胞内，形成干细胞介导的磁力刀。

优选的，本发明的制备干细胞介导的磁力刀的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述磁力刀与神经干细胞共培养时，磁力刀的添加量为10-100颗粒/细胞。

本发明还提供一种干细胞介导的磁力刀的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将权利要求1中所述的磁力刀与神经干细胞共培养，形成干细胞介导的磁力刀；

步骤二、将干细胞介导的磁力刀对脑肿瘤部分进行原位注射；

步骤三、静置24-72小时后，检测磁力刀的分布范围；

步骤四、向肿瘤部位施加旋转磁场。

优选的，本发明的干细胞介导的磁力刀的使用方法，还可以具有这样的特征：其中，所述旋转磁场具有20赫兹的旋转频率和1特斯拉的强度。

本发明还提供上述的干细胞介导的磁力刀在制备杀死脑胶质瘤细胞的试剂中的应用。

发明的有益效果

根据本发明的干细胞介导的磁力刀，由于采用神经干细胞作为靶向载体，因此本发明的磁力刀对脑肿瘤的趋向性更强。

另外，干细胞介导的磁力刀，具有良好的组织整合性。结构上易于宿主细胞整合，不会损伤正常组织。

第三，干细胞介导的磁力刀，具有极低免疫源性。神经干细胞不表达成熟细胞抗原，不被免疫系统识别，有利于其存活。

第四，与多肽和抗体介入等常规的靶向策略相比，神经干细胞载体具有主动定向脑肿瘤和远距离迁移的能力等其它载体无法比拟的优势。

与传统的放射疗法和化学疗法相比，这种磁性药物介入的机械力治疗手段有以下优点：1.细胞对机械力敏感度高，易被破坏，避免了药物对异质性肿瘤细胞作用的局限性；2.磁场对生物体有良好穿透性且对正常的生物组织的伤害极小，可重复治疗；3.通过磁场定位作用局部物理靶向治疗脑肿瘤，时间和空间上可控；4.磁性药物可作为造影剂用于核磁共振成像来定位治疗脑肿瘤。这种物理治疗既能单独应用，也可与化疗和影像等手段结合使用，具有广泛的应用前景。如何使磁性药物靶向进入肿瘤细胞是磁诱导机械力治疗脑肿瘤的关键问题。

附图说明

图1是制备磁力刀的示意图；

图2是电镜下磁力刀的形态；

图3是磁力刀从干细胞中释放的情况；

图4是划痕实验的结果图；

图5是荧光素酶报告基因实验的结果；

图6是在动物体中干细胞介导的磁力刀对胶质瘤细胞的靶向图。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式：

磁力刀的制备：

以Ni80Fe20合金为原料，通过光学平板刻法制备边长为2微米的钠米盘本体。Ni80Fe20合金中铁的含量为20％，镍的含量为80％。制作步骤如图1所示，

步骤一、在硅片12上旋涂光刻胶11。

步骤二、将掩膜板放置在前烘过的光刻胶11上层，使用紫外光照射，然后使用有机溶剂溶解和去除未暴露在此外光下的光刻胶。掩膜板上漏光区域应与磁力刀的形状相符，在本实施方式中，磁力刀为边长2微米的正方形，因此膜板上的漏光区域也为边长2微米的正方形。

步骤三、利用磁控溅射法沉积一层5nm的金，然后沉积一层60nm的铁镍合金作为纳米盘本体，最后沉积另一层5nm的金，从而形成中间一层为铁镍合金，两面具有金层的磁力刀13。磁力刀13为边长2微米的正方形。

步骤四、在丙酮中进行剥离操作，将磁力刀13从硅片上剥离。

制备完成后，为确认磁力刀的尺寸处于所需的范围内，运用扫描透射电镜确定材料的尺寸。如图2所示，为电镜下磁力刀的形态。

在其它的实施方式中，金层的厚度可以在2-8nm的范围内进行选择。铁镍合金层的厚度可以在40-80nm的范围内进行选择。

磁力刀与神经干细胞的结合：

使用DMEM培养液对神经干细胞进行培养，DMEM培养液中加2％的青霉素和链霉素作为抗生素(Cellgro,Mediatech,Inc.,Manassas,VA,USA)，以及10的胎牛血清。培养时间大于等于2小时后，磁力刀100％进入神经干细胞。本发明所使用的人神经干细胞购自Millipore(Temecula,CA)，

磁力刀的释放：

如图3所示，向神经干细胞施加旋转交变磁场后，磁力刀从神经干细胞中释放出来。磁场的条件控制在20赫兹的旋转频率和1特斯拉的强 度下。旋转交变磁场使用环形电磁铁进行施加。通过磁场调控“磁力刀”在干细胞内的机械转动，产生机械力作用于干细胞，引发细胞的凋亡，从而释放“磁力刀”。

神经干细胞介导的磁力刀对脑胶质瘤细胞进行定向运动：

通过划痕实验，验证了神经干细胞介导的“磁力刀”可对脑胶质瘤细胞进行定向运动。

如图4所示，划痕实验分两组进行，对照组采用正常的人神经干细胞和转染了绿色荧光蛋白的U87脑胶质瘤细胞，两种细胞分别置于划痕的两边。实验组采用已融合磁力刀的人神经干细胞和转染了绿色荧光蛋白的U87脑胶质瘤细胞两种细胞也分别置于划痕的两边。对照组和实验组的划痕宽度相同。培养9小时后进行观察。如图4中右侧的图像所示，9小时后，对照组和实验组中的神经干细胞均向U87脑胶质瘤细胞方向进行了迁移。可见，在融合了磁力刀后，神经干细胞仍然具有向U87脑胶质瘤细胞方向进行定向迁移的行为。

运用荧光素酶检测(Luciferase assay)方法,证实神经干细胞介导的“磁力刀”可在磁场作用下抑制脑胶质瘤的生长。

荧光素酶检测的过程如下：

(1)U87-GFP-Luc细胞与已经装载了磁力刀的神经干细胞共培养，然后每天在磁场下处理30分钟，持续3天。

(2)共培养96小时后，细胞使用被动裂解液(Promega Corp,Madison,WI)进行裂解，然后在-80℃下放置1小时，然后置于室温下直到溶解。

(3)向96孔板的每孔中加入5μL溶解产物，然后加入50μL荧光素酶底物，然后使用GloMax 20/20光度计(Promega Corp,Madison,WI)检测发光情况。

结果如图5所示，可见在使用干细胞介导的磁力刀的处理后，脑胶质瘤细胞的存活率大幅下降。

动物实验证明干细胞介导的磁力刀对脑胶质瘤的靶向作用。

步骤一、建立脑胶质瘤裸鼠模型：将2×10⁵个脑胶质瘤细胞U87悬浮在2.5μLPBS缓冲液中，运用脑立体定位仪，经颅骨缺口，用微量注射器将肿瘤细胞注射入裸鼠右侧大脑尾状核部，待7天后分组待用。U87细胞中已预先转入荧火虫荧光素酶基因。

步骤二、将干细胞介导的磁力刀原位注射至肿瘤部位。过72小时，取出脑部组织，研究磁力刀在脑肿瘤中的分布。干细胞介导的磁力刀的用量为2×10⁵个，使用时悬浮在2.5μL PBS缓冲液中。

另外，单纯使用磁力力刀对另一组脑胶质瘤裸鼠模型的肿瘤部位进行原位注射，作为对照组。

如图6所示，单纯使用磁力刀的一组，磁力刀仅分布于注射位置的原处。而使用神经干细胞介导的磁力刀一组，磁力刀分布与肿瘤细胞分布范围一致。可见，神经干细胞介导的磁力刀对肿瘤细胞具有靶向定位的效果。

干细胞介导的磁力刀对脑胶质瘤的杀伤作用：

在上述的动物实验证明干细胞介导的磁力刀对脑胶质瘤的靶向作用实验中，还留有2组实验动物进行后续实验以考查干细胞介导的磁力刀 对脑胶质瘤的杀伤作用。

其中一组为对照组，不进行旋转磁场的处理，另一组为实验组，进行每日一次的旋转磁场处理，磁场的参数为20Hz转动频率、1特斯拉的强度，作用时间1h。连续处理7日。

胶质瘤细胞植入后21天，进行成像，以检测肿瘤情况。由于U87细胞表达荧火虫荧光素酶，因此成像时，腹腔注射D-荧光素，剂量：4.5毫克/动物，将D-荧光素溶于150μL生理盐水中进行给药。大脑内的荧光素酶活性的空间分布使用Xenogen IVIS成像系统记录。实验结果表明，实验组肿瘤细胞在脑部区域存在的面积显著缩小甚至消失。后续的生存期实验表明，实验组小鼠的生存期明显延长，至少为对照组小鼠的一倍以上。