本发明涉及免疫学
技术领域：
，特别涉及一种免疫组合物以及包括该免疫组合物的疫苗。
背景技术：
：目前，对于油性佐剂疫苗而言，已知这种疫苗不仅在免疫强化作用方面，而且在疫苗的稳定性方面，都在相当大的程度上受到乳剂类型、所用油性成分以及其所结合的表面活性剂种类等因素的影响。尤其就灭活疫苗来说，制备出一种具有在较长时间内能诱导产生充分免疫保护作用，并有着良好再现性的疫苗，是非常困难的。疫苗佐剂被用于达成二个目的：其一是减缓抗原从注射部位释出，其二是刺激免疫系统。传统疫苗通常由灭活或被杀死或经修饰的活致病微生物的粗制备物组成。与这些致病微生物的培养物相关的杂质可作为增强免疫应答的佐剂。然而加入佐剂可容许使用较小剂量的抗原来刺激类似的免疫应答，从而减少疫苗的制造成本。因此，当将疫苗与佐剂组合时可显著增加某些可注射疫苗的效力。在选择疫苗佐剂时必须考虑许多因素。疫苗佐剂应该以有效方式使抗原的释出和吸收速率缓慢，且对宿主的毒性、变应原性、刺激及其它不想要的作用最小。为了使人满意，佐剂应为非杀病毒性、可生物降解、可持续产生高水平的免疫力、能刺激交叉保护作用、可与多种抗原兼容、在多种物种中有效、对宿主无毒且安全(如：无注射部位反应)。其它期望的佐剂特征为可微量给药、剂量节省、具有优良的货架稳定性、可承受干燥、可制成不含油、可作为固体或液体存在、为等张性、容易制造且其制造并不昂贵。最后，高度期望能够根据疫苗接种方案的需要而将佐剂配置成诱导体液或细胞免疫应答或二者兼有。然而，可符合上述条件的佐剂的数量有限。多数疫苗只有与免疫增强剂或免疫佐剂配合应用才能发挥良好的防疫效果。但是，目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制开发高效、安全的新型免疫佐剂成为亟待解决的问题。但是尚无名副其实的中药免疫增强剂产品问市，一些具有增强免疫作用的传统方剂多为大复方，传统剂型多为汤剂、散剂，给药不便。技术实现要素：通过发明人的多年研究，筛选出中药刺五加的提取物可用于免疫组合物中，因此，本发明之一提供了一种免疫组合物，所述组合物包括刺五加提取物和无致病力的抗原以及药学上可接受的载体。通过将刺五加提取物应用于免疫组合物中，克服了目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。并且将刺五加提取物应用于免疫组合物中，能够显著的改善免疫组合物的免疫效果。本发明的组合物可直接与抗原及任选地黄芪提取物制备成疫苗组合物，使用简单，可持续产生高水平免疫效果。在一个具体实施例中，所述组合物还包括黄芪提取物。在发明人研究过成中发现，黄芪提取物和刺五加提取物的配合使用具有协调增效的作用，因而进一步提高了抗原的免疫效果。在一个具体实施例中，所述无致病力的抗原为灭活形式的抗原。灭活形式的抗原具有的优点是安全、不存在散毒的危险；便于贮存和运输；受母源抗体的影响小；并且灭活形式的抗原产生的抗体水平高。在一个具体实施例中，所述无致病力的抗原选自细菌性抗原和/或病毒性抗原；优选自禽用病毒性抗原、猪用细菌性抗原以及猪用病毒性抗原中的至少一种；进一步优选禽用病毒性抗原选自新城疫抗原、禽流感抗原、鸡传染性支气管炎抗原以及鸡法氏囊抗原中的至少一种，猪用抗原选自猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪繁殖与呼吸系统综合征抗原、猪流感抗原、伪狂犬病毒抗原和猪细小病毒抗原中的至少一种；最优选禽用抗原为禽流感抗原和新城疫抗原，猪用抗原为猪圆环病毒抗原。在现有技术中，传统的新流二联灭活疫苗用于肉鸡时抗体滴度产生较慢。而在本发明中，通过刺五加提取物和/或黄芪提取物与灭活的新流二联抗原组合物用于鸡的免疫中，出乎意料的增加了抗原的免疫效果。鸡新城疫和禽流感抗体水平最高分别提高了1.6、1.2个滴度，同时降低了料肉比。传统的猪用圆环病毒灭活疫苗使用时疫苗产生的应激反应。而在本发明中，通过刺五加提取物和/或黄芪提取物与猪用圆环病毒灭活用于猪的免疫中，出乎意料的降低猪的料肉比，和提高机体抗体滴度。在一个具体实施例中，所述刺五加提取物的终含量为0.005-0.8mg/ml，优选所述刺五加提取物的终含量在使用状态下为0.05-0.1mg/ml。并且在一般情况下，药物组合物在家禽中的用量为0.2ml，所述家禽例如可以是鸡、鸭或鹅等；在家畜中的用量为2ml，所述家 畜例如可以是猪、牛或羊等。也就是说，刺五加提取物在家禽中的用量为0.001-0.16mg/只。刺五加提取物在家畜中的用量为0.01-1.6mg/头。在一个具体实施例中，所述黄芪提取物的终含量为0.005-0.4mg/ml，优选所述黄芪提取物的终含量在使用状态下为0.2-0.4mg/ml。在一个具体实施例中，所述无致病力的新城疫抗原和禽流感抗原的终滴度分别为1×107.0EID50/0.1ml-2×108.0EID50/0.1ml，所述的无致病力的猪圆环病毒抗原的终滴度为1×105.0TCID50/ml-1×106.0TCID50/ml。同上，在一般情况下，药物组合物在家禽中的用量为0.2ml，所述家禽例如可以是鸡、鸭或鹅等；在家畜中的用量为2ml，所述家畜例如可以是猪、牛或羊等。也就是说，刺五加提取物在家禽中的用量为(2×107.0EID50-4×108.0EID50)/只。刺五加提取物在家畜中的用量为2×105.0TCID50-2×106.0TCID50/头。其中，本发明中的“终浓度”以及“终滴度”分别指所述物质在使用状态下的浓度或滴度。也就是说，当以其成倍浓缩的形式形成产品后，只要经过简单适当的稀释即可达到“终浓度”或“终滴度”，也就是所述物质在使用状态下的浓度或滴度。因此，通过简单稀释而获得使用状态下的浓度的产品同样在本发明的保护范围之内。在一个具体实施例中，所述药学上可接受的载体包括聚丙烯酸；优选地，所述聚丙烯酸商品名为卡波姆；更优选为卡波姆940、卡波姆974P、卡波姆934P和卡波姆971P，最优选为卡波姆934P。在一个具体实施例中，所述聚丙烯酸的终含量为0.001mg/ml-10mg/ml，优选为0.05-0.5mg/ml，最优选为0.1mg/ml。本发明之二提供了一种如上的组合物的疫苗。本发明之三提供了上述组合物和/或疫苗在动物中的应用。优选在家畜和/或家禽中的应用，特别是在猪、鸡、鸭、鹅和鹌鹑等中的应用。具体实施方式为了更清楚地说明本发明的技术实施步骤方案，下面结合具体应用情况，作简单介绍。本发明的实施例无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。实施例1-81.试验材料卡波姆；0.01mol/L的PBS溶液。新流二联灭活疫苗(即鸡的新城疫和禽流感二联灭活疫苗)：普莱柯生物工程股份有限公司提供。ND标准抗原购自中国兽药监察所(批号：201411)。鸡新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)血凝抑制试验(HI)阳性血清购自中国兽药监察所(批号：201410)。20×PBS，购自上海生物工程股份有限公司(批号：140119081Z)。鸡的禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)标准抗原(H9)购自哈尔滨维科生物技术开发公司(批号：201401)。禽流感病毒H9亚型阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：201401。90只1日龄的817肉鸡。2.抗原的制备按照CN101607084A中生产用毒种的制备疫苗用病毒液的制备方法制备，取病毒液测定NDVLaSota株，每0.1ml病毒含量≥8×108.0EID50/0.1ml。取病毒液测定AIVHL株，每0.1ml病毒含量≥8×108.0EID50/0.1ml。取灭活的浓缩两倍的NDVLaSota株病毒液和AIVHL株病毒液等量混合后进行4倍浓缩，备用。3.中药提取物的制备3.1刺五加提取物的制备向装有刺五加中药饮片的容器中加入刺五加中药饮片10倍质量的水浸泡1.5小时，回流提取2h，滤过，保留滤液；然后向装有滤渣的容器中再加入滤渣10倍量质量的水，常压回流提取2h。合并滤液，并对合并的滤液浓缩至相对密度1.10(在60-70℃下的相对密度，含义是某种物质的密度与水的相对密度之比)，加入乙醇使含醇量为40％，静置12-24h，过滤，取上清液，回收乙醇，上清液减压浓缩至相对密度1.20(60-70℃)，真空喷雾干燥机喷雾，干燥备用，即得刺五加提取物。用高效液相色谱法测定其含紫丁香苷的含量为1.1mg/g。并检验合格。3.2黄芪提取物的制备将黄芪药材用粉碎机(睿核高速多功能粉碎机，型号：TQ-300Y)粉碎5s后，向装有黄芪的容器中加入黄芪10倍质量的水浸泡1小时后，回流提取3次，每次回流的加水量依次为黄芪药材量的10倍、8倍和6倍，每次回流提取的时间依次为2小时、1.5小时、1.5小时，然后合并3次提取液，将合并后的提取液冷却至室温，然后用高速离心机以8000转/分钟离心20分钟，之后上清液浓缩至相对密度为1.15-1.20，加无水乙醇至含醇量为70％，4℃静置12小时，弃去上清液，沉淀加水溶解，使浓度成1g生药/ml的溶液，加无水乙醇至醇体积含量为35％，高速离心机离心，8000转/分钟离心20分钟，取上清液，然 后向上清液中加无水乙醇至醇醇体积含量为70％，4℃静置12小时，弃去上清液，沉淀依次用80％，95％、无水乙醇洗涤脱水后，80℃真空干燥12小时，即得黄芪提取物。用硫酸-苯酚比色法测得黄芪多糖的含量以葡萄糖计为90wt％，用高效液相色谱法测定其含黄芪甲苷为0.01wt％。并检验合格。4.疫苗的制备4.1配制储备液4.1.1PBS缓冲溶液的配制；pH＝7.20，01MPBS2000ml。a：配制甲液：0.2M的Na2HPO4缓冲溶液1000ml，Na2HPO4.12H2O71.625g，注射用水1000ml，于1000ml容量瓶中定容。b：配制乙液：0.2M的NaH2PO4缓冲溶液1000ml，NaH2PO4.2H2O31.202g，注射用水1000ml，在1000ml容量瓶中定容。c：甲液∶乙液＝72∶28(体积)。d：甲液和乙液混合，并用注射用水将其20倍体积稀释后，按终浓度0.85％加入NaCl即得0.01MpH＝7.2的PBS。分装后，121℃30min高压灭菌。然后室温放置。4.1.2黄芪刺五加提取物溶液的配制将按上述3.1和3.2的方法分别制备的刺五加提取物和黄芪提取物，并分别溶解在去离子水中，制成刺五加50mg/ml(质量/体积)的储备溶液，100mg/ml(质量/体积)黄芪提取物的储备溶液，115℃，30min高压灭菌，4℃保存。4.1.3卡波姆溶液的配制将卡波姆Carbomer934P(青岛天力源生物科技有限公司)溶解在去离子水中，制成25mg/ml的储备溶液121℃30min高压灭菌，4℃保存。4.2含本发明的免疫组合物的新流二联疫苗的制备使用上述配制的刺五加提取物溶液、黄芪提取物溶液、卡波姆溶液，按照下面的方法制备新流二联灭活疫苗：A)取标题2中制备好的鸡新城疫(LaSota株)和禽流感病毒(H9亚型：HL株)抗原液10ml，备用。B)将刺五加提取物，以及任选地黄芪提取物加入A)步骤制得的溶液中。详见表1。C)任选地将卡波姆溶液加入B)步骤制得的溶液中。详见表1。D)向步骤C)中补加PBS液至最终体积20ml。表1新流二联免疫组合物配方组成E)分别取8份10.0ml的油相加入到200ml洁净烧杯中，打开乳化机开关，200rpm/min低速搅拌。将8份取自实施例1-8的步骤D)制得的溶液10.0ml分别缓慢加入到上述8份油相中，缓慢加速到400rpm/min，充分乳化10min，从而制得本发明的鸡的新流二联灭活疫苗。其中油相为纯度98％白油(重量/体积)，疫苗的滴度见表2。5.试验方法表25日龄鸡试验分组及疫苗中各成分含量注：mg/ml是指制备好的新流二联灭活疫苗中每毫升疫苗中所含有的刺五加或黄芪用量。选择健康的100只1日龄817肉鸡，随机分为10组，每组10只，鸡腿部标记牌标记。鸡5日龄时，对其进行免疫前采血。向1-8组中的每只5日龄的鸡的颈背部皮下注射0.2ml的实施例1-8制备的鸡新流二联灭活疫苗。并且于免疫后10天、20天和30天时分离血清，按照中国兽药典附录血凝抑制标准检测方法测定ND和AI(H9亚型)HI抗体水平，记录并计算出平均抗体水平。5.1测定指标：新城疫和禽流感抗体水平。5.2整个饲养时期料肉比、存活率。试验分组与处理表见表2。6试验结果6.1鸡新城疫和禽流感抗体水平不同实施例制备的疫苗对鸡新城疫抗体水平和禽流感抗体水平影响分别见表3和表4。表3对鸡新城疫抗体水平的影响组别疫苗来源免疫前免疫后10d免疫后20d免疫后30d1实施例16.2±0.743.1±1.374.1±1.354.2±1.322实施例26.6±0.824.0±1.415.0±1.025.1±1.023实施例36.4±1.234.6±0.76*5.2±0.75*5.8±1.31*4实施例45.8±0.954.0±0.655.0±1.115.1±0.935实施例56.2±0.824.4±1.51*5.4±0.72*5.9±0.68*6实施例66.9±1.134.3±1.38*5.6±0.68*5.7±0.81*7实施例76.7±1.334.1±0.734.8±1.054.4±0.798实施例86.2±0.924.1±0.815.2±1.08*5.3±0.939新流二联灭活疫苗6.3±0.843.2±1.454.0±0.824.3±1.0310空白对照组7.2±1.064.3±0.712.9±1.462.2±1.37注，*表示和新流二联灭活疫苗相比差异显著(P<0.05)，**表示和新流二联灭活疫苗对照组相比差异极显著(P<0.01)。由表3可知，免疫后10天，即15日龄时，实施例3、5、6与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了新城疫抗体水平(P<0.05)，分别提高1.4、1.2和1.1个抗体滴度，其它组别与新流二联灭活疫苗对照组相比差异不显著(P>0.05)。免疫后20天，实施例3、实施例5、实施例6和实施例8与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了新城疫抗体水平(P<0.05)，分别提高1.2、1.4、1.6和1.2个抗体滴度。免疫后30天，实施例3、 实施例5和实施例6与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了新城疫抗体水平(P<0.05)，分别提高1.5、1.6和1.4个抗体滴度。由表4可知，免疫后10天，实施例6组与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了禽流感的抗体水平(P<0.05)。免疫后20天，实施例3和实施例6与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了禽流感的抗体水平(P<0.05)。免疫后30天，实施例2、3、5和6的疫苗与新流二联灭活疫苗对照组相比，显著的提高了禽流感的抗体水平(P<0.05)。其中，抗体水平反映鸡免疫疫苗后特异性体液免疫反应。在免疫后6-10天血液中产生抗体，因此选择免疫后10天进行检测。抗体水平的高低直接反映机体的体液免疫状态，且抗体简单易测，结果准确。新城疫和禽流感抗体水平均升高，整个阶段都有较高水平，有助于提高机体抵抗新城疫和禽流感病毒。因而实施例2、3、5和6的疫苗取得了显著的有益效果。表4对鸡的禽流感抗体水平的影响组别疫苗来源免疫前免疫后10d免疫后20d免疫后30d1实施例17.7±1.034.2±1.235.3±1.384.8±1.062实施例27.2±1.265.2±1.366.1±1.136.6±2.23*3实施例36.3±0.974.9±0.746.7±2.01*6.9±0.82*4实施例48.1±1.084.4±0.925.4±1.255.8±0.645实施例57.5±0.865.1±1.356.3±1.206.7±094*6实施例66.8±1.245.4±1.16*6.8±1.47*7.1±1.08**7实施例78.2±1.354.8±1.675.2±1.385.4±1.218实施例86.7±0.924.3±1.036.0±1.206.3±1.279新流二联灭活疫苗6.9±1.294.1±1.375.6±0.655.2±1.1410空白对照组7.3±1.064.8±0.683.4±1.302.3±1.23注，*表示和新流二联灭活疫苗相比差异显著(P<0.05)，**表示和新流二联灭活疫苗对照组相比差异极显著(P<0.01)。6.2鸡只料肉比、存活率整个时期的总采食量与总增重量及料肉比见表5。表5不同实施例组鸡只的总采食量、总增重量与料肉比组别疫苗来源总采食量(g)总增重量(g/只)料肉比1实施例13465.21526.52.272实施例23825.31793.12.133实施例33929.21812.42.174实施例43703.41763.52.105实施例53203.61659.91.936实施例63562.11826.71.957实施例73813.71765.62.168实施例83609.81733.62.089新流二联灭活疫苗3647.21628.22.2410空白对照组3541.21526.42.32由表5可知，实施例2、3、4、5、6、7和8料肉比分别为2.13、2.17、2.10、1.93、1.95、2.16和2.08，其与新流二联灭活疫苗对照组相比料肉比分别降低了0.11、0.07、0.14、0.31、0.29、0.08和0.16。结果表明，在整个饲养期间，实施例2到实施例8的料肉比低于新流二联灭活疫苗对照组，尤其以实施例4、5、6和8料肉比较低，这表明试验组是在增强机体免疫力的前提下达到促进生长的作用的。由以上结果可知，抗原量10ml、刺五加提取物0.8mg或1.6mg时，刺五加提取物0.2mg和刺五加提取物3.2mg分别加上卡波姆0.4ml时、黄芪和刺五加提取物混合各1.6mg时，该免疫组合物中实施例2、3、5、6和8可以提高新城疫和禽流感抗体水平并降低料肉比，因此该免疫组合物为最优组方。实施例9-161.试验材料按照实施例1-8的方法制备刺五加提取物和黄芪提取物，并检验合格。卡波姆；0.01mol/L的PBS溶液。5周龄左右健康雌性清洁级Balb/c小鼠，从北京市维通利华实验动物技术有限公司购入(有北京市实验动物质量合格证)。小鼠血清PCV2ELISA抗体试剂盒。2.猪圆环病毒疫苗的制备2.1生产用菌(毒)种的制备猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)SH病毒株的制备：将毒种用DMEM培养基(Invitrogen公司)作10倍稀释，按5％体积接种于PK15(ATCC，保藏号为CCL-33)细胞，37℃吸附30分钟，加入含4％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液，37℃培养4日后收获细胞和细胞液，然后对所述收获的细胞和细胞液进行冻融2-3次，收获病毒，病毒滴度为106.0TCID50/ml。2.2猪圆环病毒2型病毒液培养制备猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)的培养容器中的细胞培养液倒掉，将毒种液按0.1-0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2次，37℃吸附30分钟，然后加入细胞维持液，再置于37℃旋转(10-12转/小时)培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，37℃培养4日后收获细胞和细胞液，然后对所述收获的细胞和细胞液进行冻融3次，置-20℃以下保存收获病毒，病毒滴度为106.0TCID50/ml，浓缩4倍，备用。2.3猪圆环病毒2型病毒液处理猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理：将病毒液用中空纤维滤柱(孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。2.4猪圆环病毒2病毒液灭活猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将上述标题2.3处理的检验合格的病毒液按常规方法加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，以灭活猪圆环病毒2型SH株，随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时，灭活完毕后加入0.2％(w/v)的焦亚硫酸钠终止灭活，然后将灭活猪圆环病毒2型SH株病毒液置2-8℃保存。3.含本发明的免疫组合物的猪圆环疫苗的制备使用实施例1-8配制的黄芪提取物溶液、刺五加提取物溶液、卡波姆溶液，按照下面的方法配制猪圆环疫苗组合物：A)在10mlPBS液中加入标题2.1中制备的猪圆环病毒2型SH株病毒抗原液。B)将刺五加提取物，以及任选地黄芪提取物加入A)步骤中制得的溶液中；详见表6。C)任选地将卡波姆溶液加入B)步骤制得的溶液中；详见表6。D)向步骤C)中补加PBS液至最终体积20ml。表6猪圆环病毒免疫组合物配方组成E)先后取8份20.0ml的油相加入到200ml洁净烧杯中，打开乳化机开关，200rpm/min低速搅拌。将取自实施例9-16的步骤D)制得的溶液10.0ml分别缓慢加入到上述8份油相中，缓慢加速到400rpm/min，充分乳化10min，从而制得本发明的猪圆环病毒2型灭活疫苗。其中油相为纯度98％白油(重量/体积)，疫苗的滴度见表7。其它同实施例1-8。4.试验用动物及分组用5-6周龄PCV2ELISA抗体阴性健康雌性清洁级Balb/c小鼠(PCV2ELISA抗体效价不高于1∶50)100只，分成10组，每组10只。按照表7进行免疫，每只颈部皮下注射0.2ml的免疫原，两周(14天)后按相同途径和剂量进行第2次接种；空白对照不免。各组小鼠均隔离饲养观察。在二免的免后3周(21天)采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体效价。取血清参照《中华人民共和国农业部公告第1448号猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)质量标准》中小鼠免疫试验ELISA方法测定血清中PCV2抗体效价。将阴、阳性血清和免疫组小鼠血清分别用PBS缓冲液做1:100倍稀释，然后再做2倍系列稀释，稀释至1:25600，分别加入到包被好的ELISA板中，每孔100μl(置37℃下作用1h；用PBS液洗涤3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000倍稀释)，每孔l00μl，置37℃作用1h；洗涤3次，每次5min；加底物液TMB，每孔l00μl，避光显色l0min；加终止液，每孔l00μl，立刻在酶标仪上读取450nm波长处的OD值。表75周龄小鼠试验分组及疫苗中各成分含量5.判定标准判定同稀释度待检血清OD450值/阴性血清0D450值(P/N值)不低于2.1时判为阳性。以P/N值不低于2.1时血清最大稀释度作为该血清的ELISA抗体效价。效价在1:400以上者为PCV2抗体阳性。6.试验结果小鼠抗体效价测定结果见表8。表8小鼠抗体效价测定结果由表8可知，猪圆环病毒2型灭活疫苗、实施例9到实施例16小鼠均呈现抗体阳性，而空白对照组小鼠抗体均为阴性。实施例11、12、14、15和16与猪圆环2型灭活疫苗组疫苗相比，免疫效果优于灭活疫苗组。并且均显著地高于“猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)”的效力标准。因此，刺五加提取物组成的免疫组合物，以及刺五加和黄芪组成的免疫组合物具有良好的免疫原型。实施例17-21不同免疫组合物对猪免疫应激效果的影响免疫疫苗为实施例9-16制备的疫苗。1.仔猪饲养管理试验前，充分消毒，将试验仔猪饲喂在保育舍内，室内温度保持在28℃左右，自由采食，自由饮水，保持舍内清洁，每周消毒两次，预试7天后正式进入试验阶段，试验期间，每天仔细观察并记录仔猪的各种临床症状，如体温、采食情况、精神状况及各种疾病，饲喂猪场保育猪全价饲料。2.试验设计与分组根据实施例9-16结果，选择实施例11、12、14、15和16进行免疫组合物对猪免疫应激效果的影响。用14日龄PCV2ELISA抗体阴性、PCV2抗原阴性和PRRSVELISA抗体阴性(IDEXX-ELISA抗体试剂盒)的健康仔猪70头，随机分成7组，每组10头，按照实施例9-16中制备的疫苗，2ml/头，免疫一次。试验设计见表9。表914日龄猪试验分组及处理情况表免疫组合物接种后21d称体重，记录各组仔猪的耗料量，计算料肉比，称重后，各组仔猪采血，采血部位为前腔静脉，采血时间为下午4点，将所采血液离心，取血清，用圆 环ELISA试剂盒测抗体水平。3试验结果3.1免疫组合物免疫后对猪群临床反应和料肉比的影响免疫组合物免疫后对猪群临床反应和料肉比的影响见表10。表10不同组别料肉比组别疫苗来源平均始重(kg)平均末重(kg)净增重(kg)平均耗料量料肉比31实施例114.79.65.37.11.3432实施例124.510.45.97.41.2533实施例145.010.55.57.01.2734实施例154.610.15.58.21.4935实施例164.710.05.37.21.3636猪圆环灭活疫苗4.69.24.67.51.6037空白对照组4.89.74.97.51.53注射免疫组合物和生理盐水后，实施例12、实施例14组和空白对照组当天和第二天没有明显变化；实施例11、实施例15和实施例16猪注射疫苗后有明显临床反映，仔猪精神沉郁，倦怠，晚上喂食时明显食欲减退，呈现一过性精神倦怠，第二天恢复正常，但吃食速度比圆环疫苗对照组快。不同组别料肉比见表10。实施例12、实施例14可降低机体料肉比，与圆环疫苗对照组相比，分别降低了0.35、0.33，其他不同组别也有降低，说明包括刺五加，以及刺五加与黄芪的免疫组合物的疫苗取得了显著的有益效果。3.2猪圆环病毒的抗体水平检测结果用酶标仪测定96孔板上各孔OD630值。PCV2样品OD630值>0.42，判为阳性；样品OD630值介于0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD630值<0.38，判为阴性。检测结果见表11。由表11可知，试验31组到35组相对于疫苗对照(阳性对照)均不同程度的提高了机体抗体水平，特别是32组(实施例12)、33组(实施例14)、35组(实施例16)与猪圆环灭活疫苗对照组相比显著提高机体抗体水平(P<0.05)。试验31组(实施例11)和34组(实施例15)与猪圆环灭活疫苗组相比，提高了机体抗体水平但差异不显著(P>0.05)结论：不同免疫组合物使机体阳性率都达到了100％，说明免疫均达到了非常好效果。表11圆环抗体水平检测结果注：“*”表示不同实施例与疫苗对照组相比差异显著(P<0.05)。当前第1页1 2 3