一种治疗年龄相关性黄斑变性的中药组合物的制备方法与流程

技术领域：

本发明涉及一种中药组合物的制备方法，特别涉及一种治疗年龄相关性黄斑变性的中药组合物的制备方法。

背景技术：
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年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)多发于55岁以上老年人。amd是以黄斑区视网膜色素上皮(rpe)、bruch′s膜、脉络膜毛细血管的变性疾病，amd分为干性与湿性两种类型。尤其是湿性amd显示于黄斑部视网膜下脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，cnv)的形成，是本病致盲的根本原因。

amd为眼科疑难病，其发病机制至今尚不清楚，目前的治疗方法均为探索性疗法。主要包括：光动力疗法、经瞳孔温热疗法、激光光凝、放射疗法、手术治疗、药物治疗、基因疗法、中医药治疗等。光动力学疗法是目前证实比较有效的治疗方法，但其疗效是以视力不继续降低为评价标准，且此疗法价格昂贵，且需重复治疗；激光疗法对黄斑中心凹下面的新生血管光凝，通常会导致中心视力的直接下降，并且激光光凝治疗新生血管的复发率亦高；西药药物疗法目前的焦点在抗新生血管内皮生长因子抑制剂的研发上，如eylea(阿柏西普)、lucentis(诺适得)、conbercept(康柏西普)等。

中国专利cn102058845a公开了一种治疗黄斑变性的中药组合物，该组合物的原料药组成为：

黄芪10-40重量份当归10-40重量份

茯苓10-40重量份浙贝母5-20重量份

三七3-18重量份大黄炭1-10重量份

生蒲黄10-40重量份郁金10-40重量份。

优选的，该药物组合物的原料药组成为：

黄芪10-30重量份当归10-30重量份

茯苓12-30重量份浙贝母6-15重量份

三七4-14重量份大黄炭2-4重量份

生蒲黄10-30重量份郁金10-30重量份。

最优选的，该药物组合物的原料药组成为：

黄芪20重量份当归20重量份

茯苓20重量份浙贝母10重量份

三七9重量份大黄炭3重量份

生蒲黄20重量份郁金20重量份

或

黄芪15重量份当归25重量份

茯苓28重量份浙贝母8重量份

三七6重量份大黄炭4重量份

生蒲黄24重量份郁金15重量份

或

黄芪26重量份当归16重量份

茯苓18重量份浙贝母12重量份

三七12重量份大黄炭2重量份

生蒲黄15重量份郁金25重量份

该中药组合物具有治疗湿性年龄相关性黄斑变性以及脉络膜新生血管膜病变的用途。

该专利实施例中还公开了该中药组合物的制备方法：

取上述原料药，加水煎煮提取，或者加入乙醇浸渍或渗漉提取，加入常规辅料，按照常规工艺，制成各种制剂。

然而上述制备方法过于简单，没有考虑中药成分的复杂性，使用一种提取方法，并不能将处方中各种药材的有效成分完全提取出来，需根据各药味的化学成分种类，分别有针对性的设计提取方法，以药效结果筛选最佳工艺路线，并需确定相关工艺参数，保证产品的稳定性，因此有必要找到一种更加完善的制备方法。

技术实现要素：
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本发明提供一种中药组合物的制备方法，所述中药组合物，由以下中药为原料药制备而成：

黄芪10-40重量份当归10-40重量份

茯苓10-40重量份浙贝母5-20重量份

三七3-18重量份大黄炭1-10重量份

生蒲黄10-40重量份郁金10-40重量份。

优选的，所述中药组合物，由以下中药为原料药制备而成：

黄芪10-30重量份当归10-30重量份

茯苓12-30重量份浙贝母6-15重量份

三七4-14重量份大黄炭2-4重量份

生蒲黄10-30重量份郁金10-30重量份。

所述的中药原料药，各味药的功能主治如下：

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根。其功能主治为补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌。主要成分包括黄酮、皂苷类及黄芪多糖等成分，例如黄芪皂苷甲、乙、丙，大豆皂苷i、异黄芪皂苷ii，芒柄花素、毛蕊异黄酮等等。

当归，为伞形科植物当归的干燥根。其功能主治为补血活血，调经止痛，润肠通便。当归含挥发油成分。挥发油中的中性油成分有亚丁基苯酞、β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯、对聚伞花素、β-水芹烯、月桂烯等，其他成分还含有豆甾醇、谷甾醇、豆甾醇-d-葡萄糖甙、十四醇-1、钩吻萤光素等。此外，还含有蔗糖、果糖、葡萄糖；维生素a、维生素b12、维生素e，17种氨基酸以及钠、钾、钙、镁等20余种无机元素。

茯苓，为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。其功能主治为利水渗湿，健脾，宁心。主要成分含有多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等。多糖类如β-茯苓聚糖、茯苓次聚糖、木糖醇、羟甲基茯苓多糖等。三萜类包括羊毛甾-8-稀型三萜类化合物、羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜类化合物等。其他成分还有辛酸、十一酸、月桂酸、十二酸、组氨酸、甲壳素、胆碱等。

浙贝母，别名浙贝、象贝、大贝母、珠贝，为百合科植物浙贝母的鳞茎。主要功效为宣肺清热，化痰止咳，开郁散结。主治风热或痰热咳嗽，咽喉肿痛，肺痈，瘿瘤，疮痈肿毒。主要成分为生物碱，如含有浙贝母碱，去氢浙贝母碱，浙贝母碱苷，异浙贝母碱，贝母尼丁碱，异贝母尼丁碱，贝母固醇，胆碱等。

三七，为五加科植物三七的干燥根和根茎。其功能主治为散瘀止血、消肿定痛。主要成分为三七总皂苷，包括20(s)原人参二醇型、20(s)原人参三醇型、齐墩果酸型。此外还含有黄酮类化合物、三七素、糖类成分、氨基酸及挥发油等。

大黄炭，中药材大黄的炮制加工品。其功能主治为泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经，利湿退黄。主要成分为蒽醌类衍生物如芦荟大黄素、土大黄素、大黄酚、大黄素、大黄二蒽酮、掌叶二蒽酮等，苷类化合物如土大黄甙、3,5,4’‐三羟基芪烯‐4’‐o‐β‐d‐(6’‐o‐没食子酰)葡萄糖甙等，以及鞣质类和有机酸等成分。

蒲黄，为香蒲科植物水烛香蒲、东方香蒲或同属植物的干燥花粉。其功能主治为止血、化瘀、通淋。主要含黄酮类成分如香蒲新甙、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、柚皮素等，还含有甾醇类成分，β-谷甾醇、β-谷甾醇葡萄糖甙、β-谷甾醇棕榈酸酯等，以及多糖及氨基酸等成分。

郁金，姜科植物温郁金、姜黄、广西莪术或蓬莪术的干燥块根。用于胸胁刺痛，胸痹心痛，经闭痛经，乳房胀痛，热病神昏，癫痫发狂，血热吐衄，黄疸尿赤。主要含有挥发油类成分如姜黄烯、姜黄酮、芳姜酮等，姜黄素类化合物，如姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱家氧基姜黄素等。本发明在于，提供一种新的制备方法，本发明根据上述处方中各药味中化学成分性质的差异，同时考虑药性以及生产成本，采用不同的溶媒分别提取有效成分，尽可能保留提取物中的有效成分，除去无效成分，以获得药效最佳的药物组合物。

本发明所述制备方法，包括以下步骤：

①浙贝母、当归、郁金2～8倍量50～95％乙醇提取，提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.10-1.40(50～80℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)6～12倍量水提取，提取1～3次，每次0.5～2.5h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.05-1.25(50～80℃)，加入95％乙醇至50-90％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.10-1.40(50～80℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过50～150目筛，生粉入药。

优选的，本发明的的制备方法，包括以下步骤：

①浙贝母、当归、郁金3～6倍量70～95％乙醇提取，提取1～3次，每次1～2h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.10-1.40(50～80℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)8～11倍量水提取，提取1～3次，每次0.5～1.5h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.05-1.25(50～80℃)，加入95％乙醇至70-90％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.10-1.40(50～80℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过60～120目筛，生粉入药。

最优选的，本发明的的制备方法，包括以下步骤：

①浙贝母、当归、郁金4倍量80％乙醇提取，提取3次，每次1.5h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.28-1.30(60℃)，70℃减压干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)10倍量水提取，提取3次，每次1h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.16-1.18(60℃)，加入95％乙醇至80％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.28-1.30(60℃)，70℃减压干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过80-100目筛，生粉入药。

经本发明的方法制备的药物成分，经过混合后得到药物活性物质，进一步可以用制剂学常规技术制备成药物制剂组合物。本发明的药物制剂组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，颗粒剂每袋等。本发明的中药制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂。适用的填充剂包括淀粉、蔗糖、纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁、。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。常用的辅料成分包括：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素c、edta二钠、edta钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的制剂在使用时根据研制情况定用法用量，可以每日服1-3次，每次服用单剂量或多剂量。

本发明的制备方法中，浙贝母、当归、郁金的主要有效成分如生物碱、挥发油、姜黄素等化合物的极性较小，比较适合醇提取；炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄的主要成分为皂苷、多糖、黄酮等类化合物，极性较大，适合水提取，同时经过醇沉纯化，又能除去果胶、粘液质等杂质成分，进一步提高有效成分的含量；三七为名贵中药材，其主要成分为皂苷类、黄酮类和多糖类化合物，这些化合物的药理活性较强，适宜保留全成分，同时避免浪费资源。采用该制备方法获得的产品具有最佳的药效作用。

经试验证明，通过本发明的制备方法制得的中药组合物治疗黄斑变性的效果明显优于专利cn102058845a中公开的方法。且与专利cn102058845a中的工艺制得的中药组合物相比，本发明的治疗amd的中药组合物可明显减少日服用生药量。

以下通过实验数据说明本发明的有益效果。

实验1：

试验目的

通过采用脉络膜新生血管大鼠模型，观察通过不同方法制备得到的治疗amd的中药组合物的样品对大鼠脉络膜新生血管的防治作用，为今后选择合适的工艺开发治疗黄斑变性的药物提供实验依据。

实验材料

1、受试药和剂量设计：

1.1治疗amd的中药组合物样品信息

1)样品1：按照本发明实施例1的方法进行制备，含量4.13g生药/g粉，批号2014061501

2)样品2：按照专利cn102058845a中实施例1的方法(全方水提)进行制备，含量3.34g生药/g粉，批号2014061502

3)样品3：按照专利cn102058845a中实施例2的方法(全方醇提)进行制备，含量4.54g生药/g粉，批号2014061503

1.2阳性药

1)诺适得(雷珠单抗注射液)，批号：s0018，规格10mg/ml，0.2ml/瓶，novartispharmaschweizag。

1.3剂量设计：

1)样品1、样品2、样品3，人体重以70kg计算，大鼠等效剂量为10g生药/kg，采用大鼠等效剂量为中剂量(临床等效剂量)，1/2为低剂量组，2倍等效剂量为高剂量，本次设计剂量20、10g、5g生药/kg。

2)诺适得，本品经玻璃体内注射给药，临床推荐剂量为每次0.5mg(相当于0.05ml的注射量)，每月一次给药。大鼠以200g计，人70kg，等效剂量50μg/kg，合计5μl/kg，大鼠250g左右，每只眼玻璃体内注射1.25μl。

2、药物配制：

本实验的3个样品均称取适量，分别用蒸馏水研磨配成所需浓度，供动物灌胃给药，给药体积：样品1、样品3分别为1ml/kg体重，样品2为1.5ml/kg体重，给药次数：每天灌胃给药一次。

激光光凝后1周诺适得玻璃体腔注射给药1.25μl，给药1次。

3、试剂：

戊巴比妥钠，批号：120505，merck公司。

盐酸奥布卡因滴眼液，批号：b1026，参天制药株式会社。

复方托吡卡胺滴眼液，批号：131201，沈阳兴齐眼药股份有限公司。

荧光素钠，批号：f8140，sigma公司。

fitc-d，批号：slbb6384v，sigma公司。

多聚甲醛，批号：20130415，天津市化学试剂供销公司。

实验仪器

多波长氩离子激光机，型号：novusomni，厂家：日本olympus公司

荧光素眼底血管造影仪，日本topcon公司

ts100荧光倒置显微镜型号，激光发射波长：488nm，收集荧光信号波长：530nm，日本nikon公司

ml203电子天平：梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司。

e3000-0.5电子天平：常熟市双杰测试仪器厂。

显微镜：olympusbx51，日本奥林巴斯光学株式会社。

显微摄影：olympusdp71，日本奥林巴斯光学株式会社。

脱水机：樱花全封闭组织脱水机vip5j-f2，日本樱花检验仪器株式会社。

包埋机：leicaeg-1150h+c组织石蜡包埋机，德国leica公司。

切片机：樱花ivs-410型推拉式切片机，日本大和光机工业株式会社。

染色机：樱花自动染色装置drs-2000j-d2，日本樱花检验仪器株式会社。

封片机：樱花自动封片机glas-j2，日本樱花检验仪器株式会社。

hpx-90502mbe数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

实验动物

bn大鼠，spf级，雄性，体重180—200g，98只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产单位许可证编号：scxk(京)2012-0001，实验动物质量合格证编号：11400700063232，发票号：01073883，接收日期：20140926。

实验动物设施及饲养管理

1.动物设施

设施名称：天津市新药安全评价研究中心动物实验楼(屏障环境)。

设施地址：天津市滨海高新区滨海科技园惠仁道308号。

实验动物使用许可证号：syxk(津)2011‐0005。

签发单位：天津市科学技术委员会。

2.动物饲料

饲料名称：spf大小鼠维持饲料。

灭菌方式：⁶⁰co辐照。

供应单位：天津市华荣实验动物科技有限公司提供。

动物饲料生产许可证：scxk(津)2012-0001。

大鼠饲料批号：2014108。

签发单位：天津市科学技术委员会。

饲料检测：每批饲料均有质量合格证和饲料供应单位提供的自检报告，每季度由饲料供应单位提供一份近期第三方饲料检测报告，检测项目包括饲料营养成分和理化指标，检测标准参照gb14924.2‐2001《实验动物配合饲料卫生标准》、gb14924.3‐2010《实验动物配合饲料营养成分》。

饲料检测结果：各项检测指标均符合要求。

3.饮用水

饮用水来源：1t/h型多重微孔滤膜过滤系统制备的无菌水(四级过滤紫外灭菌)。

饮水方式：用饮水瓶直接灌装供应，动物自由饮水。

饮用水检测：屏障环境动物饮用水每季度由本中心自检微生物指标，每年送天津市疾病预防控制中心进行卫生学评价检测，包括微生物指标和生化指标检测。中心自检参照标准为gb14925‐2010《实验动物环境及设施》，送检参照标准为gb‐5749‐2006《生活饮用水卫生标准》。

饮用水检测结果：各项检测指标均符合要求。

4.饲养条件

大鼠饲养于聚丙烯鼠盒中，鼠盒规格为长×宽×高＝48cm×35cm×20cm，雌雄分养，每盒饲养同性别5只动物。

温度：温度范围20℃‐26℃。

湿度：湿度范围40％～70％。

换气次数：不少于15次全新风/小时

光照：12小时明12小时暗交替

5.饲养管理

除特殊要求(如禁食)外，动物自由采食，自由饮水。饮水瓶和瓶中动物饮用水每天更换，不能重复使用，使用后饮水瓶经脉动真空灭菌器高压消毒后再次使用。

动物饲养笼具底盘每天更换1次，饲养笼具每周更换1次，笼盖每2周更换1次，所有动物饲养笼具均通过脉动真空灭菌器高压消毒后进入屏障环境使用；动物饲养笼架每周清洁、消毒擦拭1次。动物饲养观察室每天进行清洁消毒，范围包括：地面、台面、桌面、门窗和进排风口。屏障环境使用的消毒液包括：0.1％新洁尔灭溶液、0.1％过氧乙酸溶液和1:250的84消毒液，三种消毒液轮流使用，每周使用一种。

6.动物接收与检验

实验动物到来后，试验人员、兽医和动物保障部门一同接收。接收时首先查看运输工具是否符合要求，再查看动物供应单位提供的动物合格证明，并确认合格证内容与申请购买的动物种属、级别、数量和性别一致。然后检查外包装是否符合要求及动物外包装是否有破损。动物外包装经第三传递柜传入检疫室。试验用具和实验记录经第四传递柜传入。

在检疫室打开动物外包装，核对动物性别及数量与动物合格证明所载事项是否一致。用记号笔在鼠尾标记动物检疫号，然后逐一对动物进行外表检查(包括性别、体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神、活动等)，并填写《试验动物接收单》和《动物接收检验单》。动物检验后放入动物饲养笼中，在笼具上悬挂检疫期标签，然后放在检疫室中进行适应期饲养。不合格动物处死后经缓冲区移出放入尸体暂存冰柜中等待处理。

动物适应饲养期限为7天。每天对动物进行观察，包括体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神、活动等。适应期未发现异常动物。

试验方法及结果

1、试验方法

1.1、模型建立

雄性bn大鼠98只，体重200‐220g，观察室饲养7天，预留10只为对照组，其余大鼠戊巴比妥钠麻醉，复方托品卡胺充分散瞳，盐酸奥布卡因表麻后，置于氪激光器前，将三面镜放在散瞳眼上，通过裂隙灯显微镜将瞄准光斑聚焦于视网膜上，避开大血管，用氪激光(功率300mw，直径50μm，光凝时间0.1秒)，距视盘外2‐3pd做环形光凝，光凝10点，以击破bruch膜为度。每只大鼠2只眼睛均进行光凝造模。

1.2、分组情况

随机将造模大鼠分为模型组、样品1高剂量组、样品1中剂量组、样品1低剂量组、样品2高剂量组、样品2中剂量组、样品2低剂量组，样品3高剂量组、样品3中剂量组、样品3低剂量组、阳性药诺适得组，每组8只动物，造模后连续给药4周。诺适得组在激光光凝后1周玻璃体腔注射给药1次。

1.3、检测方法

1.3.1眼底血管荧光造影：给药4周后，麻醉大鼠并散瞳，腹腔注射10％荧光素钠(l.0ml/kg)，拍摄造影后5分钟照片1张。

1.3.2脉络膜血管铺片：给药4周后，用高分子量异硫氰酸荧光素葡聚糖(fitc‐d)，对脉络膜血管进行灌注。灌注方法：麻醉大鼠后，将大鼠胸腔剪开，把23g头皮针刺入左心室，缓慢持续经心脏注入0.1mpbs(ph7.4)。当多数血液已流出、流出液不见血色后，改成用fitc‐d乳酸盐林格氏液20ml(内含fitc‐d100mg，明胶2g)缓慢灌流固定大鼠。灌注固定后，冰块冷冻眼球10min，立即摘除左眼球、固定、取材，获得rpe‐脉络膜‐巩膜复合体标本。利用激光共聚焦显微镜对其观察和测量。以488mn激光激发样品，收集530nm荧光信号，计算机采集数字图像。图像输入image‐proplus6.0专业图像处理软件进行分析。

1.3.3he染色光镜观察：给药4周后，对进行脉络膜血管灌注后的大鼠，摘取右侧眼球、固定、组织经修块、脱水、包埋、连续切片、he染色、封片，光镜下进行组织学检查。

2、试验结果

2.1对眼底血管荧光造影的影响

结果显示(图1)，正常大鼠视网膜血管放射状走行，视网膜血管管径均匀、管壁完整、管腔内荧光素充盈，脉络膜血管充盈并融合成弥漫的背景荧光，无荧光素渗漏。

光凝后4周，模型光凝区均出现圆盘状荧光素渗漏，给药各组光凝区均可见有荧光素渗漏，荧光渗漏范围明显小于模型组；通过对光凝区荧光素渗漏评分显示(表1)，样品1高、中、低剂量组、样品2高剂量组能够显著减少眼底血管荧光素渗漏，其作用不低于阳性药诺适得；样品2中、低剂量组未见明显减少眼底血管荧光素渗漏的作用。

表1对眼底血管造影荧光素渗漏的影响(n＝16)

与正常对照组比较^δδδp<0.001

给药组与模型组比较*p<0.05**p<0.01***p<0.001

图1眼底血管荧光造影照片

2.2对脉络膜血管铺片的影响

结果显示(表2图2)，荧光显微镜下光凝区可见模型组新生血管如花朵样以激光斑为基底向上长出，形成明显的新生血管网，给药各组光凝区均可见网状荧光斑，样品1高、中、低剂量组、样品2高剂量组荧光强度及范围明显小于模型组。

表2对脉络膜血管铺片cnv的影响(n＝8)

给药组与模型组比较*p<0.05**p<0.01***p<0.001

图2脉络膜血管消化铺片

2.3对脉络膜、视网膜组织病理学的影响

眼球组织经修块，梯度酒精脱水，石蜡包埋，he染色，镜下检查发现，对照组：各只动物视网膜内界膜、神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、外界膜视细胞层、视网膜色素上皮(rpe)层、bruch膜及脉络膜结构完整，层次清晰，各层细胞结构、形态未见明显改变。与对照组比较本试验模型组光凝区主要病变为视网膜外核层及rpe层局部破坏，并见少量移行的rpe细胞，其中少量或部分动物内核层排列紊乱、可见早期cnv形成及少量色素性巨噬细胞和成纤维细胞，表明氪激光对bn大鼠眼球的视网膜和脉络膜有轻度损伤。样品1、2、3高、中、低剂量组及阳性药诺适得组亦有上述病变，但病变的动物数量和程度与模型组比较及各组间比较差别不明显(见表3、图3‐14)。

综上所述，氪激光可致bn大鼠眼球的视网膜和脉络膜轻度损伤；样品1、样品2、样品3高、中、低剂量组给药4周后对氪激光所致的bn大鼠视网膜、脉络膜损伤与模型组比较及各组间比较，病变的动物数量及程度未见明显差别。

表3：病变统计给药4周

注：—未见病变；±轻微病变；+轻度病变；++中度病变；+++重度病变下同

附图说明：

图1眼底血管荧光造影照片

图2脉络膜血管消化铺片

图3给药4周对照组大鼠之眼球(he20x)

正常眼球的视网膜、脉络膜组织

图4给药4周模型组大鼠之眼球(he20x)

光凝区外核层、rpe层局部破坏，可见移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、少量成纤维细胞及早期cnv形成

图5给药4周样品1高剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见少量色素性巨噬细胞、成纤维细胞及cnv形成

图6给药4周样品1中剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内、外核层、rpe层局部破坏，正常结构消失，cnv明显增生，纤维组织增生将新生血管包绕，另见少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞

图7给药4周样品1低剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见cnv形成及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞

图8给药4周样品2高剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见少量cnv形成及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞

图9给药4周样品2中剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内、外核层局部破坏，可见cnv形成、纤维组织增生及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞

图10给药4周样品2低剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区外核层、rpe层局部破坏，可见少量移行的rpe细胞

图11给药4周样品3高剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见少量cnv形成及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞

图12给药4周样品3中剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见少量cnv形成及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞

图13给药4周样品3低剂量组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内核层排列紊乱，外核层、rpe层局部破坏，可见cnv形成及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞

图14给药1次阳性药诺适得组大鼠之眼球(he20x)

光凝区内、外核层、rpe层局部破坏，可见少量cnv形成、纤维组织增生及少量移行的rpe细胞、色素性巨噬细胞

具体实施方式：

实施例1

①浙贝母、当归、郁金4倍量80％乙醇提取，提取3次，每次1.5h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.28-1.30(60℃)，70℃减压干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)10倍量水提取，提取3次，每次1h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.16-1.18(60℃)，加入95％乙醇至80％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.28-1.30(60℃)，70℃减压干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过100目筛，生粉入药。

实施例2

①浙贝母、当归、郁金8倍量50％乙醇提取，提取2次，每次2.5h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.35-1.40(70℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)12倍量水提取，提取3次，每次0.5h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.20-1.25(50℃)，加入95％乙醇至90％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.35-1.40(50℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过150目筛，生粉入药。

实施例3

①浙贝母、当归、郁金2倍量95％乙醇提取，提取1次，1h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.10-1.15(50℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)6倍量水提取，提取3次，每次0.5h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.15-1.25(60℃)，加入95％乙醇至50％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.20-1.30(70℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

③三七粉碎，过50目筛，生粉入药。

实施例4

①浙贝母、当归、郁金3倍量70％乙醇提取，提取2次，每次2h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.25-1.30(70℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)8倍量水提取，提取3次，每次1h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.20-1.25(80℃)，加入95％乙醇至90％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.35-1.40(70℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

④三七粉碎，过80目筛，生粉入药。

实施例5

①浙贝母、当归、郁金6倍量85％乙醇提取，提取1次，2h，提取液滤过，滤液70℃浓缩至相对密度d＝1.10-1.40(50℃)，70℃干燥，得醇提干浸膏，粉碎，过80目筛。

②炙黄芪、茯苓、大黄炭、生蒲黄(包煎)11倍量水提取，提取2次，每次1.5h，提取液滤过，滤液浓缩至相对密度d＝1.15-1.25(50℃)，加入95％乙醇至70％，静置12h以上，上清液浓缩至相对密度d＝1.10-1.20(70℃)，70℃干燥，得水提干浸膏，粉碎，过80目筛。

⑤三七粉碎，过120目筛，生粉入药。