本发明涉及多肽，尤其是表现出对因子VIII改进的结合亲和力的修饰的vonWillebrand因子。本发明还涉及包含所述多肽和FVIII的复合物，涉及编码本发明的多肽的多核苷酸和产生所述多肽的方法。进一步地，本发明涉及本发明的多肽或复合物用于治疗出血障碍的治疗性或预防性用途。发明背景存在由凝血因子的缺乏导致的多种出血障碍。最常见的障碍是血友病A和B，分别由凝血因子VIII和IX的缺乏导致。另一种已知的出血障碍是vonWillebrand病。在血浆中，FVIII主要以与VWF的非共价复合物存在，并在膜结合的活化的因子X生成复合物中作为用于活化的因子IX的辅因子起作用。已经进行了若干尝试以延长未活化的FVIII的半衰期，通过减少其与细胞受体的相互作用(WO03/093313A2、WO02/060951A2)，通过共价地附连聚合物于FVIII(WO94/15625、WO97/11957和US4970300)，通过包封FVIII(WO99/55306)，通过引入新的金属结合位点(WO97/03193)，通过由肽键(WO97/40145和WO03/087355)或二硫键(WO02/103024A2)共价地附连A2结构域于A3结构域，或通共价地附连A1结构域于A2结构域(WO2006/108590)。增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通过FVIII的PEG化(WO2007/126808、WO2006/053299、WO2004/075923)。VWF的PEG化(WO2006/071801)也已被尝试以试图间接增强血浆中存在的FVIII的半衰期。还已描述了FVIII的融合蛋白(WO2004/101740、WO2008/077616和WO2009/156137)。在不同形式的vonWillebrand病(VWD)中丢失、功能上缺陷或仅以减少的量可得的VWF是在血浆中存在的多聚粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在原发性止血期间，VWF作为血小板表面上的特定受体与细胞外基质的组分诸如胶原之间的介体起作用。而且，VWF作为促凝血的FVIII的载体和稳定蛋白起作用。VWF在内皮细胞和巨核细胞中作为2813个氨基酸的前体分子合成。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列在Collins等1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397中公开。前体多肽前-原-VWF(pre-pro-VWF)由22-残基信号肽、741-残基原肽(pro-peptide)和血浆中发现的2050-残基多肽组成(Fischer等,FEBSLett.351:345-348,1994)。在内质网中裂解信号肽之后，在VWF的两个单体之间形成C-末端二硫键桥。在经由分泌途径的进一步转运期间，加入12N-连接的和10O-连接的糖类侧链。重要地，VWF二聚体经N-末端二硫键桥被多聚化，且741个氨基酸的原肽在晚期高尔基器中被酶PACE/弗林蛋白酶裂解掉。原肽以及VWF的高分子量多聚体(VWF-HMWM)储存在内皮细胞的Weibel-Pallade小体中或在血小板的α-颗粒体中。在被分泌到血浆中后，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A1结构域内裂解VWF。血浆VWF由一个范围的多聚体组成，范围从500kDa的单个二聚体到分子量超过10,000kDa的由多于20个二聚体组成的多聚体。通常VWF高分子量多聚体(VWF-HMWM)具有最强的止血活性，其可以以瑞斯托菌素辅因子活性(VWF:RCo)测量。VWF:RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。VWF中的缺陷是vonWillebrand病(VWD)的原因，vonWillebrand病(VWD)的特征为或多或少明显的出血表型。VWD3型是最严重的形式，其中VWF完全丢失，VWD1型涉及VWF的量的损失且其表型可以是非常轻微的。VWD2型涉及VWF的量的缺陷且可以与VWD3型一样严重。VWD2型具有许多亚型，其中一些与高分子量多聚体的损失或减少相关。VonVWD2a型的特征为中等和大的多聚体的损失。VWD2B型的特征为最高分子量的多聚体的损失。VWD是人类中最常见的遗传性出血障碍，并可用包含血浆或重组来源的VWF的浓缩物的替代疗法治疗。VWF可从人类血浆制备，如例如在EP05503991中描述的。EP0784632描述了用于产生和分离重组VWF的方法。在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，这保护其免于过早分解代谢并因此除了其在原发性止血中的作用以外，在调节FVIII的血浆水平中起重要作用，因此也是次级止血的调控中的重要因子。结合于VWF的未活化的FVIII在血浆中的半衰期是约12至14小时。在其中无或几乎无VWF存在的vonWillebrand病3型中，FVIII的半衰期是仅约6小时，导致此类患者中轻度至中度血友病A的症状(由于FVIII的浓度减少)。VWF对FVIII的稳定效应也已被用来帮助FVIII在CHO细胞中的重组表达(Kaufman等1989,MolCellBiol)。发明概述在第一方面，本发明提供了一种结合因子VIII的修饰的多肽，其中所述修饰的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中该序列包括在位置1或3处的至少一个修饰，使得修饰的多肽以比包含未修饰的SEQIDNO:3的参考多肽低至少5倍的解离速率结合因子VIII。在第二方面，本发明提供了一种结合因子VIII的修饰的多肽，其中所述修饰的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中该序列包括在至少位置3处的修饰，使得修饰的多肽以比包含未修饰的SEQIDNO:3的参考多肽低的解离速率结合因子VIII。在第三方面，本发明提供了一种结合因子VIII的修饰的多肽，其中所述修饰的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中该序列包括在至少位置1处的修饰，使得修饰的多肽以比包含未修饰的SEQIDNO:3的参考多肽低的解离速率结合因子VIII，其中在位置1处的残基选自由G、P、E、Y、A和L组成的组。本发明还提供了包含因子VIII分子和本发明的修饰的多肽的复合物和编码所述修饰的多肽的多核苷酸。本发明还提供了增加VWF的因子VIII结合亲和力的方法，所述方法包括向VWF氨基酸序列的D'结构域引入至少两个突变，使得在SEQIDNO:3的位置1和3或位置3和9或位置3和43的残基被改变。详细描述VWF如本文使用的术语“vonWillebrand因子”或“VWF”是指具有野生型VWF的生物活性，特别是结合因子VIII的能力的任何多肽。编码野生型VWF的基因被转录为9kbmRNA，该9kbmRNA被翻译为2813个氨基酸的前-原多肽，估计分子量为310,000Da。前-原多肽包含22个氨基酸的信号肽、741个氨基酸的原-多肽和成熟亚基。741个氨基酸的原多肽从N-末端裂解产生由2050个氨基酸组成的成熟VWF。VWF前-原多肽的氨基酸序列示于SEQIDNO:2中。除非另外指出，否则本申请中VWF残基中的氨基酸编号是指SEQIDNO:2，尽管VWF分子不必包含SEQIDNO:2的所有残基。成熟VWF的氨基酸序列示于SEQIDNO:4中。除非另外指出，否则如本文使用的术语“VWF”是指VWF的成熟形式。野生型VWF的原多肽包含多个结构域，其以以下顺序排列：D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CKD1和D2结构域代表原肽，其被裂解掉以产生成熟VWF。D'结构域涵盖SEQIDNO:2的氨基酸764至865。野生型VWF的D'结构域的氨基酸序列示于SEQIDNO:3中。羧基末端90个残基构成“CK”结构域，其与蛋白的“半胱氨酸结(cysteineknot)”超家族同源。这些家族成员具有经由二硫键二聚化的趋势。优选地，野生型VWF包含成熟VWF的氨基酸序列，如SEQIDNO:4中所示的。还涵盖了VWF的添加、插入、N-末端、C-末端或内部缺失，只要VWF的生物活性、特别是结合FVIII的能力被保留。如果具有缺失的VWF保留野生型VWF的生物活性的至少10％、优选地至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％，在本发明的意义上，生物活性被保留。野生型VWF的生物活性可由技术人员利用以下方法确定：瑞斯托菌素辅因子活性(FedericiAB等2004.Haematologica89:77-85)，VWF对血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GPIb的结合(Sucker等2006.ClinApplThrombHemost.12:305-310)，或胶原结合测定(Kallas&Talpsep.2001.AnnalsofHematology80:466-471)。当VWF的生物活性是结合FVIII的能力时，这可以多种方式测量，然而，优选地如本文实施例1中描述的测量。因子VIII术语“凝血因子VIII”、“因子VIII”和“FVIII”在本文可互换地使用。“凝血因子VIII”包括野生型凝血FVIII以及具有野生型凝血FVIII的促凝血活性的野生型凝血FVIII衍生物。与野生型FVIII的氨基酸序列相比，衍生物可具有缺失、插入和/或添加。术语FVIII包括FVIII的蛋白水解加工形式，例如活化前的形式，其包括重链和轻链。术语“FVIII”包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％的任何FVIII变体或突变体。作为非限制性实例，FVIII分子包括阻止或减少APC裂解的FVIII突变体(Amano1998.Thromb.Haemost.79:557-563)、进一步稳定A2结构域的FVIII突变体(WO97/40145)、具有增加的表达的FVIII突变体(Swaroop等1997.JBC272:24121-24124)、具有减少的免疫原性的FVIII突变体(Lollar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)、从不同地表达的重链和轻链重构的FVIII(Oh等1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)、具有对受体的结合减少，导致FVIII的分解代谢如HSPG(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白)的FVIII突变体(Ananyev等2001.TCM,11:251-257)、二硫键稳定的FVIII变体(Gale等,2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)、具有改进的分泌特性的FVIII突变体(Miao等,2004.Blood103:3412-3419)、具有增加的辅因子特异性活性的FVIII突变体(Wakabayashi等,2005.Biochemistry44:10298-304)、具有改进的生物合成和分泌、减少的ER陪伴分子相互作用、改进的ER-高尔基体转运、增加的活化或对失活的抗性和改进的半衰期的FVIII突变体(由Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237概括)。另一个特别优选的实例是FVIII的重组形式，如在Zollner等2013,ThrombosisResearch,132:280-287中描述的。所有这些FVIII突变体和变体通过引用全文并入本文。优选地，FVIII包括如SEQIDNO:13中所示的FVIII的全长序列。还涵盖了FVIII的添加、插入、取代、N-末端、C-末端或内部缺失，只要FVIII的生物活性被保留。如果具有修饰的FVIII保留野生型FVIII的生物活性的至少10％、优选地至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％，在本发明的意义上，生物活性被保留。FVIII的生物活性可由技术人员如以下描述的确定。确定FVIII的生物活性的合适的测试是例如一阶段式或二阶段式凝血测定(Rizza等1982.CoagulationassayofFVIII:CandFIXainBloomed.TheHemophilias.NYChurchchillLivingston1992)或发色底物FVIII:C测定(S.Rosen,1984.ScandJHaematol33:139-145,suppl.)。这些参考文献的内容通过引用并入本文。人类凝血FVIII的成熟野生型形式的氨基酸序列示于SEQIDNO:13中。对特定序列的氨基酸位置的提及是指FVIII野生型蛋白中所述氨基酸的位置，且不排除所提及的序列中存在其他位置处的突变例如缺失、插入和/或取代。例如，提及SEQIDNO:13的“Glu2004”中的突变不排除，在修饰的同系物中，在SEQIDNO:13的位置1至2332的一个或更多个氨基酸丢失。以上定义中的“FVIII”和/或“VWF”还包括天然等位基因变异，其可在一个个体与另一个之间存在并出现。以上定义中的“FVIII”和/或“VWF”还包括FVIII和/或VWF的变体。此类变体的一个或更多个氨基酸残基不同于野生型序列。此类差异的实例可包括保守氨基酸取代，即具有相似特征的氨基酸组内的取代，例如(1)小的氨基酸、(2)酸性氨基酸、(3)极性氨基酸、(4)碱性氨基酸、(5)疏水氨基酸、和(6)芳香族氨基酸。此类保守取代的实例在表1中示出。表1(1)丙氨酸甘氨酸(2)天冬氨酸谷氨酸(3)天冬酰胺谷氨酰胺丝氨酸苏氨酸(4)精氨酸组氨酸赖氨酸(5)异亮氨酸亮氨酸甲硫氨酸缬氨酸(6)苯丙氨酸酪氨酸色氨酸修饰的VWF本发明的修饰的VWF具有不同于野生型VWF的氨基酸序列。根据本发明，与如SEQIDNO:3中所示的野生型VWF的D'结构域的氨基酸序列相比，修饰的VWF在其D'结构域中具有至少一个氨基酸取代。修饰的VWF的D'结构域的氨基酸序列可具有相对于SEQIDNO:3的一个或更多个氨基酸取代。修饰的VWF的D'结构域的氨基酸序列优选地具有相对于SEQIDNO:3的一个或2个氨基酸取代。优选地，在SEQIDNO:3的位置1处的S被选自由以下组成的组的氨基酸取代：G、P、V、E、Y、A和L。优选地，在SEQIDNO:3的位置3处的S被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Y、I、M、V、F、H、R和W。优选的取代组合包括S764G/S766Y、S764P/S766I、S764P/S766M、S764V/S766Y、S764E/S766Y、S764Y/S766Y、S764L/S766Y、S764P/S766W、S766W/S806A、S766Y/P769K,S766Y/P769N、S766Y/P769R和S764P/S766L。根据本发明的一个方面，本发明的多肽对FVIII的结合亲和力比参考多肽高，所述参考多肽除了SEQIDNO:3中的修饰以外，具有相同的氨基酸序列。VWF分子对因子VIII分子的结合亲和力可由本领域中使用的结合测定确定。例如，可将VWF分子固定在固体支持物上，施加递增浓度的因子VIII，孵育某一时间段，和在洗涤后，用发色测定确定结合的VIII。然后亲和力常数或解离常数可通过Scatchard分析或另一合适的方法确定。确定人类因子VIII对vonWillebrand因子的结合亲和力的方法在Vlot等(1995),Blood,Volume85,Number11,3150-3157中描述。然而，优选地，VWF对因子VIII的亲和力如本申请实施例1中描述的确定。本文对亲和力的任何提及，包括解离常数，优选地是指本发明的修饰的VWF或本发明的多肽对FVIII的结合。FVIII的单链的氨基酸序列示于SEQIDNO:14中。由于VWF与FVIII的相互作用通常具有高的结合速率(on-rate)，解离常数的变化很大地依赖于解离速率(off-rate)的变化。因此，增加VWF与FVIII的缔合的主要焦点包括降低FVIII与VWF之间的解离速率。优选地，与野生型VWF与FVIII的解离速率相比，修饰的VWF与FVIII的解离速率低至少二倍、更优选地低至少5倍、优选地低至少10倍和更优选地低至少20倍。由VWF和FVIII组成的复合物的解离常数优选地是0.2nmol/L或更少，更优选地0.175nmol/L或更少，更优选地0.15nmol/L或更少，更优选地0.125nmol/L或更少，更优选地0.1nmol/L或更少，更优选地0.05nmol/L或更少，最优选地0.01nmol/L或更少。本发明的多肽与SEQIDNO:13的因子VIII的复合物的解离常数KD通常是参考多肽(例如SEQIDNO:4的多肽)与SEQIDNO:13的因子VIII的复合物的解离常数KD的小于90％。本发明的多肽与SEQIDNO:13的因子VIII的复合物的解离常数KD优选地是参考多肽(例如SEQIDNO:4的多肽)与SEQIDNO:13的因子VIII的复合物的解离常数KD的小于75％、更优选地小于50％、更优选地小于25％、更优选地小于10％、更优选地小于5％。参考多肽是这样的多肽：除了VWF的D'结构域内的突变以外，其氨基酸序列与本发明的多肽的相同。即，参考多肽优选地具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，条件是，参考多肽中的D'结构域由如SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列组成。换言之，本发明的多肽与参考多肽之间序列的仅有差异在于D'结构域的氨基酸序列。优选地，参考多肽在与本发明的多肽相同的条件下制备。本发明的多肽可由修饰的VWF组成。在另一实施方案中，本发明的多肽包括另一氨基酸序列、优选地异源氨基酸序列。该异源氨基酸序列通常天然地不与VWF融合。本发明在其中使用具有改进的半衰期的VWF变体的情形中特别有用。这可例如通过融合VWF于人类血清白蛋白来实现。此类融合体的详细讨论在US8,575,104中提供，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，本发明的多肽包括修饰的VWF和半衰期增强蛋白(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白。一种或更多种HLEP可融合到VWF的C-末端部分，优选地以使得不干扰VWF例如对FVIII、血小板、肝素或胶原的结合能力。在一个实施方案中，修饰的VWF具有以下结构：N–VWF–C–L1-H,[式1]其中N是VWF的N-末端部分，L1是化学键或接头序列H是HLEP，且C是VWF的C-末端部分L1可以是化学键或由一个或更多个氨基酸例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸组成的接头序列，且其可彼此相同或不同。通常，接头序列在野生型凝血因子的相应位置不存在。L1中存在的合适的氨基酸包括Gly和Ser。优选的HLEP序列在以下描述。本发明类似地涵盖对各自HLEP的准确“N-末端氨基酸”的融合体、或对各自HLEP的包括HLEP的一个或更多个氨基酸的N-末端缺失的“N-末端部分”的融合体。修饰的VWF或FVIII与本发明的修饰的VWF的复合物可包括多于一种HLEP序列，例如两种或三种HLEP序列。这些多个HLEP序列可成串地例如作为连续的重复段融合于VWF的C-末端部分。接头序列根据本发明，治疗性多肽部分可通过肽接头偶联到HLEP部分。接头应该是非免疫原性的并可以是不可裂解的或可裂解的接头。不可裂解的接头可包括交替的甘氨酸和丝氨酸残基，如在WO2007/090584中示例的。在本发明的另一实施方案中，VWF部分与白蛋白部分之间的肽接头由用作人类蛋白中的天然结构域间接头的肽序列组成。优选地，此类肽序列在其天然环境中位于接近蛋白表面且对免疫系统可接近，使得人们可假定针对这一序列的天然耐受。实例在WO2007/090584中给出。可裂解的接头应足够柔性以允许被蛋白酶裂解。在优选的实施方案中，如果融合蛋白是修饰的FVIII，接头的裂解与融合蛋白内的FVIII的活化同等快地进行。优选地，可裂解的接头包括源自以下的序列(a)待施用的治疗性多肽本身，如果其包含在治疗性多肽的活化期间被蛋白水解裂解的蛋白水解裂解位点，(b)被蛋白酶裂解的底物多肽，所述蛋白酶通过治疗性多肽的参与被活化或形成，或(c)参与凝血或纤维蛋白溶解的多肽。在更优选的实施方案中，接头区域包括VWF的序列，其应导致表达的融合蛋白的新抗原(neoantigenic)性质的风险降低。优选地，接头肽可由凝血系统的蛋白酶例如FIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa和FVIIa裂解。治疗性多肽、可裂解的接头和HLEP的示例性组合包括WO2007/090584(例如在表2和图4中)和WO2007/144173(例如在表3a和3b)中所列的构建体，但不限于这些。半衰期增强多肽(HLEP)如本文使用的“半衰期增强多肽”选自由以下组成的组：白蛋白、白蛋白家族的成员、免疫球蛋白G的恒定区及其片段、在生理条件下能够结合白蛋白、结合白蛋白家族的成员以及结合免疫球蛋白恒定区的部分的区域和多肽。其可以是本文描述的全长半衰期增强蛋白(例如白蛋白、白蛋白家族的成员或免疫球蛋白G的恒定区段)或能够稳定或延长凝血因子的治疗活性或生物活性的其一种或更多种片段。此类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或可包括来自HLEP序列的至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、或更多个连续氨基酸，或可包括各自HLEP的特定结构域的部分或全部，只要HLEP片段提供与野生型VWF相比至少25％的功能半衰期延长。本发明的提议的凝血因子插入构建体的HLEP部分可以是正常HLEP的变体。术语“变体”包括插入、缺失和取代(保守或非保守的)，其中此类变化大致上不改变赋予修饰的VWF的生物活性的活性位点或活性结构域。特别地，本发明的提议的VWFHLEP融合构建体可包括HLEP的天然存在的多态变体和HLEP的片段。HLEP可来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人类、猴、牛(cow)、绵羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡(hen)和鲑鱼。作为HLEP的白蛋白术语“人类血清白蛋白”(HSA)和“人类白蛋白”(HA)和“白蛋白”(ALB)在本申请中可互换地使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更宽，并涵盖人类血清白蛋白(和其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(和其片段和变体)。如本文使用的，“白蛋白”共同地指白蛋白多肽或氨基酸序列或具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人类白蛋白或其片段，尤其是如本文SEQIDNO:15中所示的人类白蛋白的成熟形式，或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的类似物或变体或其片段。特别地，本发明的提议的VWF融合构建体可包括人类白蛋白的天然存在的多态变体和人类白蛋白的片段。一般来说，白蛋白片段或变体将长至少10个、优选地至少40个、最优选地多于70个氨基酸。白蛋白变体可优先地由以下组成或可选地包括以下：白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段，例如结构域1(SEQIDNO:15的氨基酸1-194)、2(SEQIDNO:15的氨基酸195-387)、3(SEQIDNO:15的氨基酸388-585)、1+2(SEQIDNO:15的1-387)、2+3(SEQIDNO:15的195-585)或1+3(SEQIDNO:15的氨基酸1-194+SEQIDNO:15的氨基酸388-585)。每个结构域本身由两个同源子结构域，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585，以及柔性子结构域-间接头区域构成，柔性子结构域-间接头区域包括残基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511。本发明的提议的VWF融合构建体的白蛋白部分可包括HA的至少一个子结构域或结构域或其保守修饰。在优选的实施方案中，白蛋白的N-末端融合到修饰的VWF的氨基酸序列的C-末端。即，本发明的多肽可具有以下结构：N-mVWF-C-L1-A，其中N是VWF的N-末端部分，mVWF是如本文以上定义的修饰的VWF，C是VWF的C-末端部分，L1是化学键或接头序列且A是如本文以上定义的白蛋白。作为HLEP的免疫球蛋白本领域中已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)增加治疗性蛋白的半衰期(DumontJA等2006.BioDrugs20:151-160)。重链的IgG恒定区由3个结构域(CH1–CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可来源于任何哺乳动物，或分别来自亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。无抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可被用作HLEP。治疗性多肽部分优选地经由抗体的铰链区或肽接头(其甚至可以是可裂解的)连接于IgG或IgG片段。数种专利和专利申请描述治疗性蛋白对免疫球蛋白恒定区的融合以增强治疗性蛋白的体内半衰期。US2004/0087778和WO2005/001025描述Fc结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与生物活性肽的融合蛋白，其增加该肽的半衰期，否则该肽将在体内快速被消除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性、延长的循环半衰期和更大的溶解度(WO2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内功效的Fc-EPO蛋白(WO2005/063808)以及与G-CSF(WO2003/076567)、胰高血糖素-样肽-1(WO2005/000892)、凝固因子(clottingfactor)(WO2004/101740)和白介素-10(US6,403,077)的Fc融合物，它们都具有半衰期增强特性。在另一实施方案中，相比于野生型VWF的功能半衰期或与野生型VWF或与如以上定义的参考多肽复合的FVIII的功能半衰期，本发明的多肽或与本发明的多肽复合的FVIII的功能半衰期延长。该增加可以是多于15％，例如至少20％或至少50％。再次地，此类功能半衰期值可在血液样品中体外测量，所述血液样品在施用修饰的VWF或FVIII与修饰的VWF的复合物后在不同时间间隔从所述哺乳动物获取。在另一实施方案中，相比于野生型VWF或与野生型VWF或与如以上定义的参考多肽复合的FVIII，本发明的多肽或与本发明的多肽复合的FVIII表现出改进的体内回收。体内回收可体内确定，例如在正常动物中或在血友病A的动物模型如FVIII敲除小鼠中，其中人们将预期与对应的野生型VWF或以上定义的参考多肽相比，在i.v.施用后短时间(5至10min.)在循环中通过抗原或活性测定发现FVIII的百分比增加。与与野生型VWF复合的或与如以上定义的参考多肽复合的FVIII相比，体内回收优选地增加至少10％，更优选地至少20％，和甚至更优选地至少40％。在本发明的又另一实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分用作HLEP。优选地，使用包括IgG、更优选地IgG1或其片段或变体的CH2和CH3结构域和铰链区的Fc区，变体包括增强对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的突变。多核苷酸本发明还涉及编码如本申请中描述的修饰的VWF或包含所述修饰的VWF的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”一般是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。多核苷酸可以是单链或双链DNA、单链或双链RNA。如本文使用的术语“多核苷酸”还包括包含一个或更多个修饰的碱基和/或不常见碱基诸如肌苷的DNA或RNA。应理解的是，可对DNA和RNA进行用于本领域技术人员已知的许多有用目的的多种修饰。如本文采用的术语“多核苷酸”包含多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括例如简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，给定的多肽可由不同的多核苷酸编码。这些“变体”被本发明涵盖。优选地，本发明的多核苷酸是分离的多核苷酸。术语“分离的”多核苷酸是指大致上不含其他核酸序列(诸如但不限于其他染色体和染色体外DNA和RNA)的多核苷酸。分离的多核苷酸可从宿主细胞纯化。本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组的多核苷酸和化学合成的多核苷酸。本发明还涉及一组多核苷酸，其一起编码本发明的修饰的VWF、或包含修饰的VWF的本发明的多肽。该组中的第一多核苷酸可编码修饰的VWF的N-末端部分，且第二多核苷酸可编码修饰的VWF的C-末端部分。本发明的又另一方面是包含根据本发明的多核苷酸的质粒或载体。优选地，该质粒或载体是表达载体。在特定实施方案中，该载体是用于人类基因疗法中的转移载体。本发明还涉及一组质粒或载体，其包含以上组的多核苷酸。第一质粒或载体可包含所述第一多核苷酸，且第二质粒或载体可包含所述第二多核苷酸。可选地，将两种编码序列克隆到一个表达载体中，利用两种单独的启动子序列或一种启动子和内部核糖体进入位点(IRES)元件，所述内部核糖体进入位点(IRES)元件可用于例如指导表达弗林蛋白酶以增强成熟VWF的生成。本发明的又另一方面是包含本发明的多核苷酸、质粒或载体、或如本文描述的一组多核苷酸或一组质粒或载体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可被用在产生修饰的VWF或包含所述修饰的VWF的多肽的方法中，所述方法是本发明的一部分。该方法包括：(a)在使得期望的修饰的蛋白被表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)任选地从该宿主细胞或从培养基回收期望的修饰的蛋白。优选地，纯化本发明的修饰的VWF或包含该修饰的VWF的多肽至≥80％纯度、更优选地≥95％纯度，且特别优选的是药学纯的状态，其对于污染性大分子尤其是其他蛋白和核酸是大于99.9％纯的，且不含传染性和致热性因子。优选地，本发明的分离的或纯化的修饰的VWF或本发明的多肽大致上不含其他、无关的多肽。本发明的各种产物可作为药物有用。因此，本发明涉及包含修饰的VWF或如本文描述的包含所述修饰的VWF的多肽、本发明的多核苷酸、或本发明的质粒或载体的药物组合物。本发明还涉及治疗患有凝血障碍诸如血友病A或B或VWD的个体的方法。该方法包括向所述个体施用有效量的以下：(i)FVIII和修饰的VWF或包含修饰的VWF的多肽或(ii)FVIII与修饰的VWF的复合物或(iii)FVIII与如本文所述地包含修饰的VWF的多肽的复合物。在另一实施方案中，该方法包括向所述个体施用有效量的本发明的多核苷酸或本发明的质粒或载体。可选地，该方法可包括向所述个体施用有效量的本文描述的本发明的宿主细胞。提议的突变体的表达重组的突变体蛋白以高水平在合适的宿主细胞中的产生要求将上述的修饰的cDNA与合适的调节元件一起组装为重组表达载体中的有效的转录单元，该重组表达载体可根据本领域技术人员已知的方法在各种表达系统中繁殖。有效的转录调节元件可来源于以动物细胞作为其天然宿主的病毒或来源于动物细胞的染色体DNA。优选地，可使用来源于猿猴病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人类巨细胞病毒、或Rous肉瘤病毒的长末端重复的启动子-增强子组合、或包括动物细胞中强组成型转录基因如β-肌动蛋白或GRP78的启动子-增强子组合。为了实现从cDNA转录的mRNA的稳定高水平，转录单元应在其3’-近端部分包含编码转录终止-多腺苷酸化序列的DNA区域。优选地，该序列来源于猿猴病毒40早期转录区域、兔β-珠蛋白基因、或人类组织纤溶酶原激活物基因。然后将cDNA整合到合适的宿主细胞系的基因组中用于修饰的FVIII和/或VWF蛋白的表达。优选地，该细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系，以确保正确折叠、二硫键形成、天冬酰胺-连接的糖基化和其他翻译后修饰以及分泌进入培养基。其他翻译后修饰的实例是酪氨酸O-硫酸化和新生多肽链的蛋白水解加工。可以使用的细胞系的实例是猴COS-细胞、小鼠L-细胞、小鼠C127-细胞、仓鼠BHK-21细胞、人类胚胎肾293细胞和仓鼠CHO-细胞。编码相应的cDNA的重组表达载体可以数种不同方式被引入到动物细胞系中。例如，重组表达载体可从基于不同动物病毒的载体产生。这些的实例是基于杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、和优选地牛乳头状瘤病毒的载体。编码相应的DNA的转录单元也可与另一重组基因一起被引入动物细胞，所述另一重组基因可在这些细胞中作为显性选择标志起作用，以帮助分离在其基因组中已整合了重组DNA的特定细胞克隆。这一类型的显性选择标志基因的实例是赋予对庆大霉素(G418)抗性的Tn5氨基糖苷磷酸转移酶、赋予对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶和赋予对嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰转移酶。编码此类选择标志的重组表达载体可与编码期望蛋白的cDNA的重组表达载体驻留在同一载体上，或其可被在单独载体上编码，该单独载体被同时引入和整合到宿主细胞基因组，经常导致不同转录单元之间的紧密物理连接。可与期望蛋白的cDNA一起使用的选择标志基因的其他类型是基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的各种转录单元。将这一类型的基因引入缺乏内源dhfr活性的细胞(优先地CHO-细胞(DUKX-B11、DG-44))，其将使得这些能够生长在缺少核苷的培养基中。此类培养基的一个实例是无次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham’sF12。这些dhfr-基因可与FVIIIcDNA转录单元一起引入到以上类型的CHO-细胞中，它们被连接在同一载体上或在不同的载体上，从而创建产生重组蛋白的dhfr-阳性细胞系。如果将以上细胞系在细胞毒性dhfr-抑制剂氨甲喋呤的存在下生长，将出现对氨甲喋呤抗性的新细胞系。由于扩增量的连接的dhfr和期望蛋白的转录单元，这些细胞系可以增加的比率产生重组蛋白。当在递增浓度的氨甲喋呤(1-10000nM)中繁殖这些细胞系时，可获得以非常高的速率产生期望蛋白的新细胞系。产生期望蛋白的以上细胞系可以以悬浮培养物或在各种固体支持物上大规模生长。这些支持物的实例是基于葡聚糖或胶原基质的微载体、或呈中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体支持物。当在细胞悬浮培养中或在微载体上生长时，以上细胞系的培养可作为浴式培养或作为灌注培养进行，并经长时间的持续产生条件培养基。因此，根据本发明，以上细胞系充分适合于用于产生期望的重组突变体蛋白工业方法的开发。纯化和配制在以上类型的分泌细胞的培养基中累积的重组修饰的VWF蛋白，可由多种生化和色谱方法浓缩和纯化，所述方法包括利用期望蛋白与细胞培养基中的其他物质之间在尺寸、电荷、疏水性、溶解度、比亲和性等方面的差异的方法。此类纯化的一个实例是将重组突变体蛋白吸附到被固定于固体支持物上的单克隆抗体，所述抗体是针对例如HLEP、优选地人类白蛋白，或针对各自的凝血因子。在将修饰的VWF吸附到支持物、洗涤和解吸后，蛋白可基于以上性质由多种色谱技术进一步纯化。根据例如步骤的能力和选择性、支持物的稳定性或其他方面，选择纯化步骤的顺序。优选的纯化步骤包括但不限于离子交换色谱步骤、免疫亲和色谱步骤、亲和色谱步骤、疏水作用色谱步骤、染料色谱步骤、羟基磷灰石色谱步骤、多峰色谱步骤、和尺寸排阻色谱步骤。为了使病毒污染的理论风险最小化，可在方法中包括允许有效灭活或消除病毒的另外的步骤。此类步骤例如是以液态或固态的热处理，用溶剂和/或去垢剂处理，以可见光谱或UV光谱放射，γ-放射或纳米过滤。本发明的修饰的多核苷酸(例如DNA)还可被整合到转移载体中，用于在人类基因疗法中使用。本文描述的各种实施方案可彼此组合。本发明将在以下其实施例中更详细地进一步描述。本发明的具体实施方案的这一描述将联合附图进行。如本发明描述的修饰的VWF可被配制成用于治疗用途的药物制品。可将纯化的蛋白溶解在常规的生理相容的含水缓冲溶液中，任选地可向其加入药物赋形剂以提供药物制品。此类药物载体和赋形剂以及合适的药物制剂是本领域公知的(参见例如“PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins”,Frokjaer等,Taylor&Francis(2000)或“HandbookofPharmaceuticalExcipients”,3rdedition,Kibbe等,PharmaceuticalPress(2000))。标准的药物配制技术是本领域技术人员公知的(参见例如，2005Physicians’DeskThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thed.,Gennaro等,Eds.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。特别地，包含本发明的多肽变体的药物组合物可配制为冻干或稳定的液体形式。多肽变体可由本领域已知的多种程序冻干。冻干的制剂在使用前通过加入一种或更多种药学上可接受的稀释剂诸如无菌的注射用水或无菌的生理盐水溶液来重构。组合物的制剂通过任何药学上合适的施用方式递送至个体。各种递送系统是已知的并可用于通过任何方便的途径施用组合物。优先地，本发明的组合物系统地施用。对于系统使用，将本发明的蛋白配制成根据常规方法肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或经皮)或肠内(例如口、阴道或直肠)递送。最优先的施用途径是静脉内和皮下施用。制剂可通过输注或通过弹丸注射连续施用。一些制剂包含缓释系统。本发明的蛋白以治疗有效剂量施用至患者，治疗有效剂量是指这样的剂量：足以产生期望的效应、阻止或减轻被治疗的状况或适应症的严重度或扩散，而不达到产生不可忍受的不利副作用的剂量。准确剂量依赖于许多因素如例如适应症、制剂和施用方式，并必须在临床前和临床试验中对每种各自的适应症确定。本发明的药物组合物可单独或与其他治疗剂联合施用。这些剂可被掺入作为同一药物的一部分。此类剂的一个实例是修饰的VWF和FVIII的组合。在本文提到的序列的概述在表2中列出。表2SEQIDNO:描述1编码SEQIDNO:2的DNA的核苷酸序列2人类VWF前-原多肽的氨基酸序列3人类VWF的D'结构域的氨基酸序列4成熟人类VWF的氨基酸序列5S764G/S766Y6S764P/S766I7S764P/S766M8S764V/S766Y9S764E/S766Y10S764Y/S766Y11S764L/S766Y12S764P/S766W13S766W/S806A14S766Y/P769K15S766Y/P769N16S766Y/P769R17S764P/S766L18人类因子VIII的氨基酸序列19成熟单链因子VIII的氨基酸序列20人类血清白蛋白的氨基酸序列实施例实施例1具有改进的FVIII结合的vWF点突变体背景如以上讨论的，循环FVIII的大部分与VWF复合。在人类中，在VWF的不存在和存在下，FVIII分别以大约2hr和16hr的t1/2从血液清除。尽管VWF给予FVIII半衰期的增加，其还对t1/2设置了由其自身的半衰期规定的上限。US8,575,104公开了VWF-白蛋白融合蛋白。这一融合蛋白在啮齿动物模型中具有比野生型VWF长五倍的半衰期。这一融合蛋白与FVIII之间的稳定复合物可为FVIII赋予另外的半衰期益处。尽管FVIII/vWF相互作用的平衡结合常数是高的，结合动力学是快速的且与VWF-白蛋白融合蛋白复合的任何FVIII将在输注后快速地被内源vWF更换。因此，如果FVIII与VWF-白蛋白融合物的解离速率大致上等同于FVIII与天然VWF的解离速率，则VWF-白蛋白融合物的使用将不提供FVIII的半衰期方面的任何实质增加。因此，为了利用VWF-白蛋白融合物的较长半衰期来延长FVIII的半衰期，降低FVIII与VWF-白蛋白融合物的解离速率是必需的。从利用在2N型vonWillebrand病患者(其中VWF的水平正常但VWF与FVIII缔合的能力严重减小)中进行测量的建模研究，已经估计，需要解离速率的至少五倍减少以提供FVIII的临床相关改进。FVIIIVWF-白蛋白融合物解离速率的减少与FVIII半衰期的增加之间的假定关系在表3中列出。表3在减少FVIIIVWF-白蛋白融合物解离速率的试图中，进行了实验以评估突变的VWF-白蛋白融合蛋白是否可提供显著减慢的FVIII解离速率，从而提供经由与VWF-白蛋白融合蛋白的稳定缔合，延长FVIII的半衰期的可行选项。在vWF的大约氨基酸位置764、765、766、768、769、773、806和809构建了一系列突变体，意图是减慢结合的FVIII的解离速率。在这些实验中，使用了FVIII的重组形式。这一FVIII描述在Zollner等2013,ThrombosisResearch,132:280-287中。最初，对vWF构建体测量FVIII结合，所述vWF构建体有以上提到的残基之一被突变为所有遗传编码的氨基酸(半胱氨酸除外)。鉴定改进的结合物之后，产生包括突变的组合的变体的另外的组。此外，由于由白蛋白融合物提供的半衰期延长依赖于FcRn介导的再循环，还在pH5.5测试了许多突变体。各种突变的结果在表4至19中示出。方法编码人类vonWillebrand因子的D'和D3结构域(vWF；氨基酸(aa)764-1270；基于GenBank登录号NP_000543和由Zhou等2012Blood120:449-458阐述的结构域边界)的合成的、密码子优化的cDNA从GeneARTAG(Regensberg,Germany)获得。其在5'末端被修饰以编码其自身的信号肽(aa1-22)且在3'末端被修饰以编码C-末端8xHis-标签。将该构建体(Hu-vWF[764-1270]-8His)定向地克隆到pcDNA3.1哺乳动物表达载体(Invitrogen,USA)中，该载体具有在起始甲硫氨酸的上游的Kozak共有序列(GCCACC)和在开放阅读框的3'端的双终止密码子(TGA)，并通过自动测序证实质粒序列。然后将这一表达质粒用作模板，利用标准PCR技术制造在Ser764、Leu765、Ser766或Lys773处的单残基、双残基或三残基改变，将构建体克隆到pcDNA3.1并如以上所述地测序。还合成了编码Hu-vWF的D1和D2结构域(aa1-762)、具有C-末端FLAG标签(DYKDDDDK)的第二密码子优化的cDNA并从GeneArt获得；将其如以上地克隆到pcDNA3.1中并测序。对于瞬时哺乳动物表达，将FreestyleTM293悬浮细胞(Invitrogen)在5mlFreestyle表达培养基(Invitrogen)中生长至1.1x106细胞/ml。将7μL293Fectin(Invitrogen)转染试剂与167μLOpti-MEMI培养基(Invitrogen)预孵育5分钟,然后加入到2.5μg编码野生-型/突变体u-vWF[764-1270]-8His的质粒DNA加2.5μg编码Hu-vWF[1-762]-FLAG的质粒DNA中，并将混合物孵育另外20分钟。将DNA-293Fectin复合物加入到细胞，将其在37℃,8％CO2在以250rpm摇动的培养箱中培养6天。通过在2000rpm离心5分钟收获培养上清液并在4℃储存用于分析。通过在37℃使用Biacore4000生物传感器通过表面等离子体共振研究结合动力学。每种突变体被从细胞培养基捕获到固定有抗His抗体(14,000RU)的CM-5传感器芯片上至40-150RU的密度。在初始筛选研究中，将FVIII以1nM注入到被捕获的突变体上持续5分钟，并监测解离5分钟。然后对相对于野生型显示kd减少的突变体，用FVIII以1、0.5和0.25nM注入持续5分钟来再次检查，并监测解离30分钟。所有传感图通过从参考点(仅包含固定的抗His抗体)和从空白注入减去信号来双重参考。通过将双重参考的传感图拟合于1:1动力学模型来确定结合动力学。结果丝氨酸764向脯氨酸的诱变生成了具有解离速率的大约3.5倍减少和亲和力的4.4倍增加的vWF变体。在位置765处的突变不产生相对于野生型vWF任何更好的结合物。在位置766处的许多突变生成具有改进的解离速率特征和比野生型vWF更高的亲和力的变体vWF分子(His、Arg、Val、Tyr、Trp、Thr、Phe、Ile、Gln、Gly&Asn)。考虑到，在位置764处的脯氨酸对解离速率赋予显著改进，且在位置766处的许多突变积极地影响结合，生成了由S764P和在位置766处除了半胱氨酸以外的所有其他遗传编码氨基酸组成的一系列突变体。产生了包含S764P和在位置765处除了半胱氨酸以外的所有其他遗传编码氨基酸的类似突变。这些双重突变体的许多具有相对于野生型vWF显著减缓的解离速率和更高的亲和力。特别是，S764P与S766I组合生成了具有大约22倍减的少解离速率和30倍增加的亲和力的vWF变体。实施例2具有点突变的人类血清白蛋白vWF融合物和FVIII结合利用标准NHS/EDC偶联化学反应将小鼠抗-HSA抗体固定在CM5芯片上。通常，固定水平在10,000至12,000RU之间。将每批vWF-HSA(单体和二聚体)以范围从0.1-1μg/ml的不同浓度捕获在每个流通池中的单个点上持续2分钟。捕获水平范围从40-150RU。其中使用固定了抗-vWF，但未无捕获的vWF-HSA的相邻点用作参考。捕获每周期进行，随后FVIII结合分析。依赖于相互作用的亲和力和分析的pH，FVIII随机地和以一式两份对所有流通池中的所有点以不同浓度注入。对FVIII的缔合和解离监测持续最适合发生相互作用的不同时间框。解离阶段后，通过30秒钟注入25mM甘氨酸pH2.6来再生表面。期间的运行缓冲液为10mMHEPES、150mMNaCl、10mM柠檬酸Na、2.5mMCaCl2、0.1％BSA,pH7.3和pH5，而流速为30μl/min。在37℃测量每种相互作用4次(n＝4)。将对参考点结合的响应从vWF-HSA捕获点的那些响应减去。然后将来自空白注入的响应从所有其他样品的那些响应减去以产生双重参考的传感图。将双重参考的传感图拟合于1:1动力学模型，包括用于质量传递限制(masstransportlimitation)的项。将缔合和解离速率全局地拟合且Rmax局部地拟合。获得的结果在表20和表21中列出。表4表5N/D：弱的结合、差的拟合、快的解离速率表6N/D：弱的结合、差的拟合、快的解离速率表7突变体Ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)WT-K773T1.42E+076.97E-044.92E-11WT-K773A5.81E+068.83E-041.52E-10WT-K773L1.88E+071.10E-035.86E-11WT-K773R1.45E+071.23E-038.46E-11WT-K773Q8.60E+061.45E-031.68E-10WT-K773M1.57E+072.35E-031.50E-10WT-K773S1.35E+073.23E-032.40E-10WT-K773P9.58E+063.33E-033.48E-10WT-K773I7.66E+074.09E-035.35E-11WT-K773V5.39E+075.23E-039.70E-11WT-K773H1.19E+091.57E-011.32E-10WT-K773N3.61E+098.36E-012.32E-10WT-K773WN/DWT-K773EN/DWT-K773DN/DWT-K773GN/DWT-K773FN/DWT-K773YN/DWT7.33E+061.15E-031.57E-10N/D：存在结合，但不能确定准确的动力学参数表8N/D：弱的结合、差的拟合、快的解离速率表9N/D：弱的结合、差的拟合、快的解离速率表10突变体ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764P-K773R6.39E+067.42E-051.16E-11S764P-K773T4.68E+067.50E-051.60E-11S764P-K773Q4.44E+061.28E-042.88E-11S764P-K773V1.55E+071.57E-041.01E-11S764P-K773I1.79E+071.69E-049.43E-12S764P-K773M1.58E+071.70E-041.08E-11S764P-K773A6.37E+061.89E-042.97E-11S764P-K773S2.16E+073.06E-041.42E-11S764P-K773N5.50E+063.47E-046.31E-11S764P-K773P2.26E+075.01E-042.22E-11S764P-K773L4.60E+055.72E-041.24E-09S764P-K773H1.65E+076.36E-043.86E-11S764P-K773G1.75E+077.62E-044.36E-11S764P-K773F1.02E+071.23E-031.21E-10S764P-K773Y1.63E+071.36E-038.35E-11S764P-K773D1.77E+072.40E-031.36E-10S764P-K773W1.25E+073.21E-032.57E-10S764P-K773E6.73E+075.15E-037.65E-11WT7.33E+061.15E-031.57E-10表11突变体ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S766Y-K773T1.20E+072.69E-042.24E-11S766Y-K773L1.79E+073.45E-041.92E-11S766Y-K773R1.40E+074.69E-043.35E-11S766Y-K773I8.02E+065.69E-047.10E-11S766Y-K773M1.97E+076.59E-043.35E-11S766Y-K773V1.74E+078.61E-044.94E-11S766Y-K773Q2.39E+079.39E-043.93E-11S766Y-K773A1.88E+071.22E-036.51E-11S766Y-K773S1.75E+071.38E-037.85E-11S766Y-K773G6.02E+071.97E-033.27E-11S766Y-K773P2.16E+072.43E-031.12E-10S766Y-K773F2.05E+073.24E-031.58E-10S766Y-K773W2.93E+073.93E-031.34E-10S766Y-K773Y2.24E+074.04E-031.80E-10S766Y-K773E1.84E+074.81E-032.61E-10S766Y-K773N5.15E+075.07E-039.84E-11S766Y-K773H5.47E+076.20E-031.14E-10S766Y-K773D1.25E+084.27E-023.43E-10WT7.33E+061.15E-031.57E-10表12突变体ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764G/S766Y1.37E+072.69E-051.96E-12S764V/S766Y2.99E+076.41E-052.15E-12S764A/S766Y2.98E+077.21E-052.42E-12S764E/S766Y1.97E+077.64E-053.87E-12S764P-S766Y1.08E+077.71E-057.16E-12S764Y/S766Y3.19E+077.88E-052.47E-12S764L/S766Y3.52E+077.99E-052.27E-12S764N/S766Y1.28E+078.88E-056.92E-12S764R/S766Y3.23E+079.20E-052.85E-12S764F/S766Y7.68E+069.36E-051.22E-11S764I/S766Y1.03E+079.52E-059.23E-12S764W/S766Y8.88E+069.67E-051.09E-11S764M/S766Y7.15E+061.03E-041.44E-11S764Q/S766Y1.19E+071.09E-049.18E-12S764D/S766Y3.78E+071.18E-043.12E-12S764T/S766Y2.58E+071.36E-045.27E-12S764H/S766Y4.56E+072.92E-046.39E-12S764K/S766Y1.89E+078.22E-044.35E-11WT7.33E+061.15E-031.57E-10表13突变体ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764P-L765H-S766I1.56E+066.60E-054.24E-11S764P-L765V-S766I5.62E+071.16E-042.07E-12S764P-L765M-S766I5.69E+071.37E-042.41E-12S764P-L765W-S766I1.11E+061.46E-041.32E-10S764P-L765Q-S766I1.15E+062.86E-042.48E-10S764P-L765K-S766I6.88E+071.50E-032.18E-11S764P-L765Y-S766I5.17E+071.90E-033.67E-11S764P-L765T-S766I1.15E+083.31E-032.87E-11S764P-L765I-S766I6.34E+061.03E-021.62E-09S764P-L765G-S766I5.04E+071.22E-022.41E-10S764P-L765R-S766I7.96E+071.73E-022.18E-10S764P-L765E-S766I1.03E+065.50E-025.36E-08S764P-L765F-S766IN/DS764P-L765N-S766IN/DS764P-L765D-S766IN/DS764P-L765P-S766IN/DS764P-L765S-S766IN/DS764P-L765A-S766IN/DN/D：存在结合，但不能确定准确的动力学参数表14突变体ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)dupS764/S764P/S766I6.23E+061.59E-032.55E-10dupS764/S764P/S766I1.25E+072.50E-031.99E-10dS764-dL765-S766IdS764-dL765-S766YN/DdelS764-S766Y6.20E+062.07E-043.34E-11delS764-S766W6.60E+063.15E-044.78E-11delS764-S766L6.21E+065.85E-049.42E-11delS764-S766M7.25E+067.26E-041.00E-10delS764-S766I7.09E+068.27E-041.17E-10delS764-S766S7.30E+068.46E-041.16E-10N/D：存在结合，但不能确定准确的动力学参数表15N/D：存在结合，但不能确定准确的动力学参数表16表17N/D：存在结合，但不能确定准确的动力学参数表18表19表20表21序列表<110>杰特有限公司<120>修饰的VonWillebrand因子<130>A187<210>1<211>8442<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>1atgattcctgccagatttgccggggtgctgcttgctctggccctcattttgccagggacc60ctttgtgcagaaggaactcgcggcaggtcatccacggcccgatgcagccttttcggaagt120gacttcgtcaacacctttgatgggagcatgtacagctttgcgggatactgcagttacctc180ctggcagggggctgccagaaacgctccttctcgattattggggacttccagaatggcaag240agagtgagcctctccgtgtatcttggggaattttttgacatccatttgtttgtcaatggt300accgtgacacagggggaccaaagagtctccatgccctatgcctccaaagggctgtatcta360gaaactgaggctgggtactacaagctgtccggtgaggcctatggctttgtggccaggatc420gatggcagcggcaactttcaagtcctgctgtcagacagatacttcaacaagacctgcggg480ctgtgtggcaactttaacatctttgctgaagatgactttatgacccaagaagggaccttg540acctcggacccttatgactttgccaactcatgggctctgagcagtggagaacagtggtgt600gaacgggcatctcctcccagcagctcatgcaacatctcctctggggaaatgcagaagggc660ctgtgggagcagtgccagcttctgaagagcacctcggtgtttgcccgctgccaccctctg720gtggaccccgagccttttgtggccctgtgtgagaagactttgtgtgagtgtgctgggggg780ctggagtgcgcctgccctgccctcctggagtacgcccggacctgtgcccaggagggaatg840gtgctgtacggctggaccgaccacagcgcgtgcagcccagtgtgccctgctggtatggag900tataggcagtgtgtgtccccttgcgccaggacctgccagagcctgcacatcaatgaaatg960tgtcaggagcgatgcgtggatggctgcagctgccctgagggacagctcctggatgaaggc1020ctctgcgtggagagcaccgagtgtccctgcgtgcattccggaaagcgctaccctcccggc1080acctccctctctcgagactgcaacacctgcatttgccgaaacagccagtggatctgcagc1140aatgaagaatgtccaggggagtgccttgtcacaggtcaatcacacttcaagagctttgac1200aacagatacttcaccttcagtgggatctgccagtacctgctggcccgggattgccaggac1260cactccttctccattgtcattgagactgtccagtgtgctgatgaccgcgacgctgtgtgc1320acccgctccgtcaccgtccggctgcctggcctgcacaacagccttgtgaaactgaagcat1380ggggcaggagttgccatggatggccaggacgtccagctccccctcctgaaaggtgacctc1440cgcatccagcatacagtgacggcctccgtgcgcctcagctacggggaggacctgcagatg1500gactgggatggccgcgggaggctgctggtgaagctgtcccccgtctatgccgggaagacc1560tgcggcctgtgtgggaattacaatggcaaccagggcgacgacttccttaccccctctggg1620ctggcggagccccgggtggaggacttcgggaacgcctggaagctgcacggggactgccag1680gacctgcagaagcagcacagcgatccctgcgccctcaacccgcgcatgaccaggttctcc1740gaggaggcgtgcgcggtcctgacgtcccccacattcgaggcctgccatcgtgccgtcagc1800ccgctgccctacctgcggaactgccgctacgacgtgtgctcctgctcggacggccgcgag1860tgcctgtgcggcgccctggccagctatgccgcggcctgcgcggggagaggcgtgcgcgtc1920gcgtggcgcgagccaggccgctgtgagctgaactgcccgaaaggccaggtgtacc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