发明领域
本发明涉及具有免疫调节性质的新颖益生菌和新颖生物标志物。
发明背景
近年来，人们已普遍接受的是，人类免疫系统行使充分功能依赖于微生物群(microbiota)与人体粘膜的复杂相互作用(belkaid等，2014；cao等，2014)。在正常健康状况下，非病原细菌激活免疫系统以诱导对于在能量获得和免疫发生方面至关重要的微生物群的耐受性(dekivit等，2014；geuking等，2014；walker等，2014)。然而，在特定条件下，针对有助于疾病(例如ibd)发生的微生物可发生免疫应答(meijerink等，2010)。更深入地研究微生物如何作用于免疫应答的体内平衡以及如何预防炎症可有益于人类健康。希望这能够引导定制的干预的设计。
通过引导t细胞朝向调节性t(treg)细胞极化并抑制变态反应相关的th2应答，共生的lactobacilli种可在维持免疫应答的体内平衡中发挥积极作用(smelt等，2013)。这被认为是通过与人粘膜中的免疫细胞或上皮细胞相互作用的细菌细胞壁组分或分泌的细菌产物的相互作用来实现的(walker等，2014)。然而，这些相互作用似乎不仅仅有助于对有益微生物的耐受性。在许多研究中，已显示lactobacilli对免疫应答有积极影响，如一些疫苗接种研究中所示(meijerink等，2012；wells等，2011)。此外，如最近所示，lactobacilli激活人类中更普遍的致耐受性细胞通路(vanbaarlen等人，2010；vanbaarlen等人，2009)。
lactobacillusplantarum是被充分表征的食源性细菌(vanbaarlen等，2009)。以前的研究已显示，lactobacillusplantarum菌株对人树突细胞和人外周血单核细胞有不同效果(meijerink等，2010；meijerink等，2012；wells等，2011；vanbaarlen等，2010；vanbaarlen等，2009；vanhemert等，2010)。通过应用比较基因组杂交，已经鉴定出了一些与这些差异效果相关的参与细胞壁磷壁酸糖基化的细菌素和细胞壁组分(meijerink等，2010；meijerink等，2012；wells等，2010；vanbaarlen等，2010；vanbaarlen等，2009；vanhemert等，2010；smet等，2013)。人们推测lactobacillusplantarum基因的这种差异表达有助于观察到的toll样受体(tlr)2–4、cd14抗原和含核苷酸结合寡聚结构域2(nod2)的活化的差异(meijerink等，2010)。由于tlr结合的差异，lactobacillusplantarum菌株在与单核细胞或树突细胞一起孵育时，诱导不同量的促炎细胞因子il12和调节性细胞因子il10(meijerink等，2010；meijerink等，2012；wells等，2011；vanbaarlen等，2010；vanbaarlen等，2009；vanhemert等，2010；smet等，2013；smelt等，2013)。
胃肠屏障可能几乎每天都会被例如非甾体抗炎药物(naisd)、运动或酒精摄入破坏，并因此引起(轻微的)肠道炎症。西方社会中非常普遍的一个轻微应激源细胞因子是nsaid(例如吲哚美辛)的消耗。数百万人正在使用nsaid来治疗肌肉骨骼疼痛。这些nsaid的副作用是胃肠免疫屏障破坏所引起的轻微肠道炎症(schoultz等，2012)。由于nsaid被全球数百万人使用，因此迫切需要治疗这种(轻微的)肠道炎症。
食源性抗原可发挥作用的另一个问题是维持疫苗接种的疗效。众所周知，对在过去(几十年前)遇到的抗原的免疫记忆可随着时间的推移而减弱。当个体再次遇到抗原或与该抗原相关的病原体时，这种减弱的免疫记忆可能导致对该抗原或与抗原相关的病原体的应答不足(deasy等，2013；kerneis等，2014；poorolajal等，2010；schure等，2012)。
因此，迫切需要保存、维持和/或重新激活免疫记忆。这不仅能够恢复减弱的免疫应答，还能够使宿主免疫系统对疫苗接种方案更加敏感，从而可特别有益于免疫受损的个体，例如年长者。此外，缺乏适当的生物标志物和试验来确定和证明免疫调节产品的效果。因此，迫切需要这种生物标志物和/或试验。
发明描述
出乎意料地，现在已证明特定的lactobacillus具有免疫调节性质。这种特定的lactobacillus优选地还具有抗炎性质。
因此，在第一方面，本发明提供益生菌制剂，其包含至少一种食品级物质和至少一种益生细菌菌株，所述益生细菌菌株与lactobacillusplantarumtifn101(保藏在真菌菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures),乌普萨兰8号,3584ct，荷兰，保藏号为cbs138100)的基因组具有至少50％序列同一性。所述益生菌制剂在本文中被称为根据本发明的益生菌制剂。所述益生细菌菌株在本文中被称为根据本发明的益生细菌菌株，其具有免疫调节性质，且优选地还具有抗炎性质。
一种优选的根据本发明的益生细菌菌株包含至少一种多核苷酸，所述多核苷酸与选自seqidno:1–seqidno:174的多核苷酸序列具有至少50％序列同一性。优选地，根据本发明的益生细菌菌株包含至少2种、更优选地3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或最优选地100种多核苷酸，所述多核苷酸各自与选自seqidno:1–seqidno:174的多核苷酸序列具有至少50％序列同一性。
一种进一步优选的根据本发明的益生细菌菌株包含至少一种多核苷酸，所述多核苷酸与选自seqidno:176–seqidno:256的多核苷酸序列具有至少50％序列同一性。优选地，根据本发明的益生细菌菌株包含至少2种、更优选地3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或最优选地100种多核苷酸，所述多核苷酸各自与选自seqidno:176–seqidno:256的多核苷酸序列具有至少50％序列同一性。
一种进一步优选的根据本发明的益生细菌菌株包含至少一种多核苷酸，所述多核苷酸与编码下述多肽的多核苷酸具有至少50％序列同一性，所述多肽具有选自seqidno:260–seqidno:340的序列。优选地，根据本发明的益生细菌菌株包含至少2种、更优选地3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或最优选地100种多核苷酸，所述多核苷酸各自与编码下述多肽的多核苷酸具有至少50％序列同一性，所述多肽具有选自seqidno:260–seqidno:340的序列。
可以在体内和体外评估免疫调节性质。对于一种优选的体外评估，从血中分离外周血单核细胞(pbmc)，并用抗原和益生细菌菌株或其部分或提取物刺激。
根据本发明的益生细菌菌株的一种免疫调节性质优选地是保存、维持和/或重新激活由先前免疫引起的免疫应答的能力，其优选地被定义为维持或增加pbmc群体内pbmc亚群的量的能力。优选地，所述亚群是抗原特异性cd45ro+群体，优选地选自cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+细胞(细胞毒性t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。进一步优选的亚群是cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)，以及产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)。优选地，在被施用根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的受试者中，cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)和/或cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)的亚群被维持。优选地，在被施用根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的受试者中，产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)的亚群增加。
优选地，抗原是通过目的性免疫或非目的性免疫的回忆抗原，即个体以前遇到的抗原；更优选地，回忆抗原选自破伤风毒素、乙型肝炎抗原和流感。优选地，特定的pbmc亚群的量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即，增加1倍)、增加2倍、增加3倍、增加4倍、增加6倍、增加10倍、增加50倍、增加100倍、增加1000倍或增加至少10000倍。这种增加可通过本领域技术人员已知的任何试验来测量，优选地用本文所述的试验来测量。
一种进一步优选的免疫调节性质是记忆t辅助细胞、更优选地激活的记忆t辅助细胞的细胞因子产生增强；优选地，与未施用根据本发明的益生菌的对照相比，产生il-17的(激活的)记忆th细胞的百分比和/或产生ifnγ的(激活的)记忆th细胞的百分比增加。百分比增加优选地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即1倍增加)、2倍增加、3倍增加、4倍增加、6倍增加、10倍增加、50倍增加。
根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的一个进一步优选的免疫调节性质是：根据meijerink等,2010检测时，通过树突细胞诱导il10/il12比例的变化，优选地变为相对高的il10/il12比例。比例的增加优选地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即1倍增加)、2倍增加、3倍增加、4倍增加、6倍增加、10倍增加、50倍增加。
一个进一步优选的免疫调节性质是在十二指肠粘膜中诱导差异转录应答。优选地，编码选自以下的化合物的基因上调：免疫球蛋白λ可变6-57、推定的v-集合(v-set)和含免疫球蛋白结构域的蛋白质6样(immunoglobulindomain-containingprotein6-like)、免疫球蛋白λ可变7-46、干扰素调节因子4、gdnf家族、cd27、cd79a和纤溶酶原激活物。上调优选地为表达水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即增加1倍)、增加2倍、增加3倍、增加4倍、增加6倍、增加10倍、增加50倍。
一个进一步优选的免疫调节性质是在十二指肠粘膜中上调mhc-iiα。上调优选地为增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即增加1倍)、增加2倍、增加3倍、增加4倍、增加6倍、增加10倍、增加50倍。
根据本发明的免疫调节性质可以是根据本发明的益生细菌菌株的组合性质。
根据本发明的益生菌制剂可以包含至少一种其它细菌菌株，所述其它细菌菌株优选地是益生细菌菌株。
根据本发明的益生菌制剂至少包含根据本发明的益生细菌菌株和至少一种食品级物质。食品级物质在本文中被另外称为根据本发明的食品级物质，其是适合于受试者、优选地人或动物、更优选地人摄取的物质。食品级物质可以是植物或动物来源的，并且可以含有必需营养物，例如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素和/或矿物质。食品级物质可旨在用于被生物体摄入，随后被生物体的细胞同化以产生能量、维持生命和/或刺激生长。根据本发明的食品级物质包括但不限于选自基于乳制品、谷物、蔬菜、水果、鱼或肉的产品的物质。术语“基于……的产品”在本文中被定义为：食品级物质由特定原料(例如，乳制品、谷物、蔬菜、水果、鱼或肉)制成。食品级物质可以基于不同原料的混合物，例如乳制品与谷物的混合物或肉与水果的混合物。
益生细菌菌株可以是任何益生细菌菌株。益生菌是活的微生物，当以足量施用时，其赋予宿主健康益处(fao/who,evaluationofhealthandnutritionalpropertiesofpowdermilkwithlivelacticacidbacteria.reportoffao/whoexpertconsultation1-4十月.2001)。应用最广泛的益生菌属于lactobacillus和bifidobacterium属(marco等，2006)。它们的有益效果通过一些机制发挥，包括调节肠道微生物群、产生抗细菌物质、改善上皮屏障功能、减少肠道炎症(corr等，2009；saulnier等，2009；saxelin等，2005)。最通常通过摄入新鲜发酵的食品或干燥细菌制品来提供益生菌。益生细菌菌株的生存力被视为益生菌功能的重要特征；因此，活着到达肠道中其作用部位被视为益生菌菌株的重要特征(ma等，2004；gobbetti等，2010)。本发明提供益生细菌菌株。一种优选的根据本发明的益生细菌菌株是选自以下的细菌菌株：lactobacillus、lactococcus、leuconostoc、carnobacterium、streptococcus、bifidobacterium、bacteroides、eubacterium、clostridium、fusobacterium、propionibacterium、enterococcus、staphylococcus、peptostreptococcus和escherichia属，优选地由lactobacillus和bifidobacterium组成。lactobacillus、bifidobacterium、streptococcus、leuconostoc和pediococcus的优选物种为lactobacillusreuteri、l.fermentum、l.acidophilus、l.crispatus、l.gasseri、l.johnsonii、l.plantarum、l.paracasei、l.murinus、l.jensenii、l.salivarius、l.minutis、l.brevis、l.gallinarum、l.amylovorus、streptococcusthermophilus、leuconostocmesenteroides、pediococcusdamnosus、p.acidilactici、p.parvulus、bifidobacteriumbifidum、b.longum、b.infantis、b.breve、b.adolescente、b.animalis、b.gallinarum、b.magnum和b.thermophilum。lactobacillus细菌优选地是lactobacillusplantarum，更优选地是选自lactobacillusplantarumjdm1、st-iii、f9up33、eitr17、d7v971(atcc14917)和c6vq24的lactobacillusplantarum，甚至更优选地lactobacillusplantarumwcfs1，最优选地lactobacillusplantarumtifn101。
应当理解，本发明包括根据本发明的保藏菌株或任何其它菌株的复制物和/或衍生物。术语“复制物”是指代表材料的基本上未改变的拷贝的生物材料，例如通过微生物生长例如培养基中的细菌生长而产生的材料。术语“衍生物”是指从生物材料生成且被实质性改变以具有新特性的材料，例如由遗传物质的可遗传变化引起的。这些变化可以自发发生，也可以是应用的化学和/或物理试剂(例如诱变剂)和/或本领域已知的重组dna技术的结果。当提及“衍生自”另一种菌株的菌株时，应该理解为包括该菌株的“复制物”以及该菌株的“衍生物”二者，只要衍生的菌株仍然保留其所衍生自的菌株的免疫调节能力即可。
优选地，在根据本发明的益生菌制剂中，相对于所述制剂的总重量，益生细菌菌株的浓度范围为约1至约99重量％，更优选地约5至约90重量％，更优选地约5至约80重量％，更优选地约5至约70重量％，更优选地约5至约60重量％，更优选地从约10重量％、20重量％、30重量％或40重量％至约50重量％，和/或约1e+4、1e+5或1e+6至约1e+8、1e+9、1e+10、1e+11或1e+12个菌落形成单位/ml制剂，甚至更优选地约1×10e+6至约1×10e+12个菌落形成单位/ml制剂。
更优选地，在根据本发明的益生菌制剂中，相对于所述制剂的总重量，益生细菌菌株的浓度范围为1至99重量％，更优选地5至90重量％，更优选地5至80重量％，更优选地5至70重量％，更优选地5至60重量％，更优选地从10重量％、20重量％、30重量％或40重量％至50重量％，和/或1e+4、1e+5或1e+6至1e+8、1e+9、1e+10、1e+11或1e+12个菌落形成单位/ml制剂，甚至更优选地1×10e+6至约1×10e+12个菌落形成单位/ml制剂。菌落形成单位是本领域技术人员已知的术语，一个单位通常是指在培养板上形成一个菌落的细菌的量；这个术语是指有生存力的细菌。
甚至更优选地，在根据本发明的益生菌制剂中，相对于所述制剂的总重量，益生细菌菌株的浓度为约10至约50重量％，和/或约1e+6至约1e+12个菌落形成单位/ml制剂。
根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株可以是本领域技术人员已知的任何构成状态或形式。根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株可以是(压缩的)片剂或丸剂的一部分，或者可以包含在另一种载体(例如容器或胶囊、凝胶或滴剂)中。优选的载体是适于包含、优选地包含根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的液体体积为0.5-50ml的容器。
根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株也可以方便地包含在食物中。因此，在第二方面，本发明提供包含根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的食品、用于食物富化的制剂、食物补充剂、营养制剂或药物制剂。根据本发明的食品优选地是如本文中之前所述的食品级物质。
根据本发明的食物、食物组合物、营养制剂、用于食物富化的制剂、食物补充剂和药物制剂在本文中被理解为包括用于人或动物摄取的液体，即饮品(drink)或饮料(beverage)。食物、食物组合物、营养制剂、用于食物富化的制剂、食物补充剂和药物制剂可以是固体、半固体、半液体和/或液体食物或食品，特别地可以是乳制品，例如发酵乳制品，包括但不限于酸乳、酸乳基饮品、酸乳样饮品、奶酪或酪乳。这种食物可以以本身已知的方式制备，例如，通过将根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株以合适的量加入合适的食品或食品级物质中。这样做时，根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株可以以本身已知的方式用于制备这种(发酵的)食品或食品级物质，例如，以本身已知的方式用于制备使用根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的发酵乳制品。在这种方法中，根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株可以在通常使用的微生物的基础上另外使用，和/或可以代替通常使用的一种或多种或部分微生物。例如，在制备发酵乳制品(例如，酸乳或酸乳基饮品)时，根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株可被加入或用作起子培养物的一部分，或者可以在这种发酵期间适当地加入。
包含根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株的药物制剂(或药物组合物)可在人用药和兽药中用于人或动物使用，特别地用于人类疗法，其至少包含根据本发明的益生菌制剂或益生细菌菌株和药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是本领域技术人员已知的任何此类赋形剂，例如药学上或营养上可接受的载剂或稀释剂。用于本文所述的药物制剂的这种合适的赋形剂的实例可以在"handbookofpharmaceuticalexcipients”,第2版,(1994),awade和pjweller编中以及“remington'spharmaceuticalsciences”,mackpublishingco.(a.r.gennaro编,1985)中找到。合适载剂的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适稀释剂的实例包括盐水、甘油、水及其混合物。
根据本发明的食物、食物组合物、营养制剂、用于食物富化的制剂、食物补充剂和药物制剂优选地存在于液体体积为0.5-1000ml的容器中。因此，本发明提供液体体积为0.5-1000ml的容器，其包含根据本发明的食物、食物组合物、营养制剂、用于食物富化的制剂、食物补充剂和药物制剂。
根据本发明的益生菌制剂和/或与lactobacillusplantarumtifn101的基因组具有至少50％序列同一性的益生细菌菌株可以方便地用作药物，优选用于治疗或预防肠道炎症。
因此，在第三方面，本发明提供根据本发明的益生细菌菌株和/或根据本发明的益生菌制剂或药物制剂(优选地如本发明的第一方面和/或第二方面中所限定)被用作药物，优选地用于治疗或预防肠道炎症。
本发明还提供治疗肠道炎症的方法或预防肠道炎症的方法，所述方法包括：施用根据本发明的益生细菌菌株和/或根据本发明的益生菌制剂或药物制剂，优选地如本发明的第一方面和/或第二方面中所限定。
本发明范围内的肠道炎症可以是本领域技术人员已知的任何肠道炎症，例如但不限于由非甾体抗炎药物(naisd)、运动、酒精摄入、肠易激综合征、变态反应、乳糜泻、炎性肠病、克罗恩病、胃肠道相关的自身免疫性疾病(例如，i型糖尿病)引起的炎症。
根据本发明的益生菌制剂和/或根据本发明的益生细菌菌株可以方便地用于免疫系统的调节，其中免疫系统的调节优选地如上文所述。因此，在第四方面，本发明提供根据本发明的益生细菌菌株和/或根据本发明的益生菌制剂或根据本发明的药物制剂被用作药物，包括施用有效量的根据本发明的益生细菌菌株和/或根据本发明的益生菌制剂或药物制剂用于调节免疫系统，其中免疫系统的调节优选地如上文所述。
本发明还提供调节患肠道炎症的受试者的免疫系统的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的根据本发明的益生细菌菌株和/或有效量的根据本发明的益生菌制剂或根据本发明的药物组合物。
优选地，在本发明该方面，有效量为约1e+4、1e+5或1e+6至约1e+8、1e+9、1e+10、1e+11或1e+12个菌落形成单位/ml制剂，更优选地约1×10e+6至约1×10e+12个菌落形成单位/ml制剂。更优选地，有效量为1e+4、1e+5或1e+6至1e+8、1e+9、1e+10、1e+11或1e+12个菌落形成单位/ml制剂，甚至更优选地1×10e+6至1×10e+12个菌落形成单位/ml制剂。
优选地，根据本发明该方面的免疫系统的调节包括：如上文所述的，维持和/或重新激活由先前免疫引起的免疫应答和/或增加先前通过免疫产生的记忆t细胞。
为了确定和证明免疫调节产品(例如，本发明先前方面中所述)的效果，本文展示了合适的生物标志物和试验。
提供了检测对试剂的应答的方法，所述方法包括：
a.利用至少一种抗原刺激来自受试者样品的pbmc，
b.鉴定pbmc的亚群，
c.将来自(b)的数据与(优选地来自同一受试者的)未用(a)的至少一种抗原刺激的参照样品(优选地以除此以外相同的方式进行检测)的数据进行比较，
其中(c)中确定的数据差异是对试剂的应答的度量。该方法在本文中还被称为本文所示的试验或方法。本文所示的试验优选地涉及流式细胞术，优选地是荧光激活细胞扫描或分选(facs)试验。facs(参见例如themolecularprobeshandbook.aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies(i.johnson和m.spence(编)第11版,lifetechnologies,2010)是这样一种方法：当样品的各个细胞在窄流中以单列的形式通过激光束时，根据它们的光学性质(即光吸收、光散射、荧光性质等)对其进行分析和分选。bonner、sweet、hulett、herzenberg和其它人在20世纪60年代末发明了荧光激活细胞分选仪以进行活细胞的流式细胞术和细胞分选。bectondickinsonimmunocytometrysystems在20世纪70年代初引入了商业机器。荧光激活细胞分选(facs)是一种特殊类型的流式细胞术。基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，它提供了一次一个细胞地分选生物细胞的异质混合物到两个或更多的容器中的方法。因为它提供了来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量的记录以及特定感兴趣的细胞的物理分离，所以它是有用的科学仪器。
细胞悬浮液被夹带在窄的、快速流动的液体流的中心。流动被布置成使得细胞之间相对于其直径存在大的间隔。振动机构导致细胞流分散成单个液滴。调整系统以使得每个液滴含有多于一个细胞的概率低。就在流分散成液滴之前，流通过测量每个细胞的感兴趣荧光特征的荧光测量站。充电环正好放置在流分散成液滴的点上。基于不久前的荧光强度测量，将电荷置于环上，并且当流分散成液滴时，液滴上捕获相反的电荷。带电液滴然后通过静电偏转系统下落，所述系统基于液滴的电荷将其转移到容器中。在一些系统中，向流直接施加电荷，并且释放的液滴保留与流符号相同的电荷。然后，在液滴释放之后，流返回到中性。
多种荧光团可被用作流式细胞术中的标签。荧光团(fluorophores，或简单地写为fluors)通常连接到识别细胞上或细胞中的靶特征的抗体；它们也可以附着于对细胞膜或另一细胞结构具有亲和力的化学实体。每个荧光团均具有特征峰激发和发射波长，发射谱通常重叠。因此，可以根据用于激发荧光染料的灯或激光的波长和可用的检测器使用的标签的组合。荧光激活细胞分选提供了从细胞的异质混合物中分离大量荧光标记的细胞的快速方法。
如上所述的流式细胞术试验中对试剂的应答的阳性检测优选地依赖于如上所述的用抗原刺激的样品与未用所述抗原刺激的参照样品之间特定pbmc亚群的差异、优选地定量差异。
本领域技术人员熟知刺激试验和使用facs作为读出工具。优选地，本文所示的方法中使用实施例中描述的试验。
优选地，差异是特定pbmc亚群的量的增加或维持。如果未受刺激的参照样品中亚群未变化，则差异优选地是受刺激样品中特定pbmc亚群的量的增加。如果未受刺激的参照样品中亚群未变化，则差异优选地是受刺激样品中特定pbmc亚群的量的维持(无变化)或增加。
优选地，亚群是选自以下的群体：cd3+/cd4+(t辅助细胞(thelpercells))、cd3+/cd4+/cd45ro-(初始t辅助细胞(
更优选地，亚群是抗原特异性cd45ro+群体，优选地选自cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+细胞(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。进一步优选的亚群是cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)以及产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)。
优选地，在本文所示的试验中，应答是免疫应答，优选地现有免疫应答的调节，更优选地现有免疫应答的增强，所述现有免疫应答优选地如上文所述。
优选地，在本文所示的方法中，试剂是食品、优选地益生菌，更优选地，试剂或其一部分包含益生菌的膜。
优选地，在本文所示的方法中，样品包含体液；优选地，样品是血液样品。
本发明上下文中的血液样品优选地为全血或全血细胞亚群的样品。全血细胞亚群包括但不限于pbmc或其亚群，例如淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。pbmc是抵抗感染和适应入侵者的免疫系统的关键组分。
优选地，在本文所示方法中，(a)中的至少一种抗原选自一般性t细胞刺激物(generaltcellstimulator)例如超抗原、蛋白激酶a(pka)刺激物例如凝集素、回忆抗原(即个体以前遇到的抗原)，优选地选自破伤风毒素、乙型肝炎抗原和流感，或者试剂或其一部分。
优选地，在本文所示方法中，(a)中的至少一种抗原至少包含：
a.回忆抗原例如破伤风毒素、乙型肝炎抗原或流感抗原，和
b.试剂或其一部分。
优选地，在本文所示方法中，亚群是选自以下的群体：cd3+/cd4+(t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro-(初始t辅助细胞)、cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro-(初始cd8+细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+(激活的cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。
更优选地，亚群是抗原特异性cd45ro+群体，优选地选自cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+细胞(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。进一步优选的亚群是cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)以及产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)。
优选地，在本文所示方法中，pbmc亚群的鉴定包括如上所述的流式细胞术分析；优选地，pbmc亚群的鉴定包括定量。本文所示试验中的定量优选地涉及测定一种或多种pbmc亚群的百分比，优选地至少一种选自以下的亚群的百分比：cd3+/cd4+(t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro-(初始t辅助细胞)、cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro-(初始cd8+细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+(激活的cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。
更优选地，亚群是抗原特异性cd45ro+群体，优选地选自cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+细胞(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。进一步优选的亚群是cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)以及产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)。
还提供了pbmc亚群作为免疫调节试剂功效检测的生物标志物的用途。术语生物标志物(biomarker或biologicalmarker)是指作为特定生物学条件或过程的指示物的独特的生物化学、遗传或分子表征或物质。在本发明的上下文中，使用本文所限定的pbmc亚群作为生物标志物。
优选地，免疫调节试剂是食品，优选地益生菌，例如上文所述。优选地，pbmc亚群例如上文所述；优选地，亚群是选自以下的群体：cd3+/cd4+(t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro-(初始t辅助细胞)、cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro-(初始cd8+细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+(激活的cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。
更优选地，亚群是抗原特异性cd45ro+群体，优选地选自cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t辅助细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+细胞(cd8+记忆t细胞)、cd3+/cd8+/cd45ro+/cd69+细胞(激活的记忆t细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7+/cd62l+细胞(中央记忆t辅助细胞)、cd3+/cd4+/cd45ro+/ccr7-/cd62l-细胞(效应物记忆t辅助细胞)。进一步优选的亚群是cd3+/cd4+/foxp3+细胞(foxp3+t辅助细胞)以及产生ifnγ和/或il17的cd3+/cd4+/cd45ro+细胞(产生ifnγ和/或il17的记忆t辅助细胞)。
定义
lactobacillusplantarumtifn101的基因组是保藏在真菌菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures),乌普萨兰8号,3584ct荷兰，保藏号为cbs138100的菌株的基因组。seqidno:175表示tifn101的174个重叠群(contig)的支架(scaffold)，并且在本发明的上下文中被解释为tifn101的优选基因组序列。
在氨基酸序列或核酸序列的上下文中“序列同一性”或“同一性”在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(肽、多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(核苷酸、多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核苷酸序列之间的序列相关度，这根据情况可通过这类序列串之间的匹配测定。在本发明的所有实施方式中，至少50％序列同一性应被理解为：与lactobacillusplantarumtifn101的基因组或者与选自seqidno:1–seqidno:174的多核苷酸序列或者与编码具有选自seqidno:245–seqidno:327的序列的多肽的多核苷酸具有优选地至少50％，更优选地55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和最优选地至少100％的序列同一性。在本发明中，与特定序列的序列同一性优选地是指在所述特定多肽或多核苷酸序列的整个长度上的序列同一性。本文提供的序列信息不应被如此狭义地解释为需要包含错误识别的碱基。本领域技术人员能够鉴定这些错误识别的碱基，并且知道如何纠正这种错误。
通过将一种肽或多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二肽或多肽的序列进行比较来确定两种氨基酸序列之间的“相似性”。在一个优选的实施方式中，在本文鉴定的整个seqidno上计算同一性或相似性。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下中所述的方法：computationalmolecularbiology,lesk,a.m.编,oxforduniversitypress,newyork,1988；biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.编,academicpress,newyork,1993；computeranalysisofsequencedata,第i部分,griffin,a.m.和griffin,h.g.编,humanapress,newjersey,1994；sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheine,g.,academicpress,1987；sequenceanalysisprimer,gribskov,m.和devereux,j.编,mstocktonpress,newyork,1991；carillo,h.和lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988)。
确定同一性的优选方法被设计为给出所测序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编码在公众可用的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括例如gcg程序包(devereux,j.等,nucleicacidsresearch12(1):387(1984))、bestfit、blastp、blastn和fasta(altschul,s.f.等,j.mol.biol.215:403-410(1990))。blastx程序可从ncbi和其它来源(blastmanual,altschul,s.等,ncbinlmnihbethesda,md20894；altschul,s.等,j.mol.biol.215:403-410(1990))公开获得。众所周知的smithwaterman算法也可以用于确定同一性。
用于多肽序列比较的优选参数包括以下：算法：needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：来自hentikoff和hentikoff,proc.natl.acad.sci.usa.89:10915-10919(1992)的blossum62；空位罚分：12；空位长度罚分：4。这些参数可用的程序是可公开获得的“ogap”程序，得自位于威斯康星州麦迪逊市的geneticscomputergroup。前述参数是用于氨基酸比较的默认参数(对于末端空位无罚分)。
用于核酸比较的优选参数包括以下：算法：needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3。可用的是得自位于威斯康星州麦迪逊市的geneticscomputergroup的gap程序。上面给出的是用于核酸比较的默认参数。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，本领域技术人员也可虑及所谓的“保守”氨基酸取代，这是本领域技术人员清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组有：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是所公开的序列中至少一个残基已被除去并在其位置插入了不同的残基。优选地，所述氨基酸改变是保守的。每个天然存在氨基酸的优选保守取代如下：ala至ser，arg至lys，asn至gln或his，asp至glu，cys至ser或ala，gln至asn，glu至asp，gly至pro，his至asn或gln，ile至leu或val，leu至ile或val，lys至arg，gln或glu，met至leu或ile，phe至met、leu或tyr，ser至thr，thr至ser，trp至tyr，tyr至trp或phe，以及val至ile或leu。
多核苷酸由核苷酸序列表示。多肽由氨基酸序列表示。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”、“包含”及其变体在其非限制意义上被用来表示该词语后面的项目被包括在内，但不排除未明确提及的项目。另外，不使用数量词提及元素时，不排除可以存在多于一种该元素，除非上下文明确要求仅存在一种该元素。因此，不使用数量词通常表示“至少一种”。
当与数值(例如，约10)相关联地使用时，词语“约”或“近似”优选地表示该值可以是比给定值(10)多或少0.1％的值。
本说明书中引用的所有专利和文献均通过引用整体并入本文。
附图说明
图1.三种l.plantarum菌株对体循环中不同的cd4+(a-f)和cd8+(g-j)t-细胞群体的频率的影响(n＝9)。使用studentt检验计算统计学显著性。
图2.三种l.plantarum菌株对产生il21(a)、il17(b)、il4(c)和ifnγ(d)的超抗原(seb)刺激的记忆th细胞的频率的影响(n＝9)。使用studentt检验计算统计学显著性。
图3.三种l.plantarum菌株对产生il21(a)、il17(b)、il4(c)和ifnγ(d)的staphylococcusaureus肠毒素b超抗原(seb)刺激的记忆-cd45ro+th细胞的频率的影响(n＝9)。使用studentt检验计算统计学显著性。
图4.三种l.plantarum菌株对产生il21(a)、il17(b)、il4(c)和ifnγ(d)的破伤风类毒素(tt)刺激的记忆-cd45ro+th细胞的频率的影响(n＝9)。使用studentt检验计算统计学显著性。
图5.微阵列分析流程图(a)和在三种不同的l.plantarum菌株(l.plantarumwcfs1(wcfs1)、l.plantarumcip104448(cip48)、l.plantarumtifn101)的人类摄取者的肠道活检中的被调节的独特基因的数目。在至少5个阵列上强度>20，四分位数范围>0.2，每个基因至少7个探针。摄取l.plantarum和吲哚美辛之后，肠道活检中(b)上调基因数目的维恩图和(c)下调基因数目的维恩图。
实施例
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、病毒学、微生物学或生物化学的标准常规方法。这种技术描述于：sambrook等(1989)molecularcloning,alaboratorymanual(第2版),coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress；sambrook和russell(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborlaboratorypress,ny；ausubel等(1994)currentprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols,usa的第1卷和2卷；brown(1998)molecularbiologylabfax,第2版,academicpress(uk)的第i卷和ii卷；oligonucleotidesynthesis(n.gait编)；nucleicacidhybridization(hames和higgins编)。
实施例1.对三种益生菌株的差异性人粘膜转录组学和免疫应答；研究益生菌如何促进健康个体的免疫力。
材料和方法
细菌菌株和生长条件
在37℃下在man、rogosa和sharpe(mrs)培养基(merck)中培养lactobacillusplantarumwcfs1(kleerebezem等,2003)、lactobacillusplantarumcip104448(cip48)和lactobacillusplantarumtifn101。为了获得静止期培养物，过夜培养细菌。加入麦芽糖糊精和葡萄糖至终浓度分别为20％和2％(重量/体积)，以获得细菌制品(wcfs1,2.6x109cfu；cip48,2.4x109cfu；tifn101,5.6x109cfu)；安慰剂对照仅含两种糖。制备细菌和安慰剂材料，使得它们含有相似的最终糖浓度。培养、收获、冷冻干燥、储存和活菌计数确定lactobacillus种的详细方案可在smelt等2012中找到。
志愿者和干预
本研究由马斯特里赫特大学医院伦理委员会批准，并按照赫尔辛基宣言的原则进行。所有受试者在纳入研究之前均已给出了书面知情同意书。在随机化的安慰剂对照的交叉研究中，在4个分开的场合(3个细菌干预和1个安慰剂对照，随机选择)下检验没有胃肠道症状病史且无任何形式的药物的10名健康志愿者：7名女性和3名男性(26.3±10.1岁，bmi为21.8±2.40kg/m2)。志愿者在研究期间摄取习惯性饮食，并被要求填写胃肠道症状日记。在干预前3天，采集血样以获得基线值。补充剂摄入期开始前一天晚上，志愿者摄取75mg吲哚美辛。在开始日，志愿者摄取另外一剂50mg吲哚美辛，这符合以前建立的建立轻微胃肠道应激的方案(troost等，2003)。随后，志愿者在午餐期间和晚餐期间摄取益生菌或安慰剂补充剂持续7天；l.plantarumwcfs1(2.610个菌落形成单位(cfu)/份)、l.plantarumcip104448(2.410个cfu/份)、l.plantarumtifn101(5.910个cfu/份)或安慰剂。志愿者和研究人员都不知道哪个受试者接受了l.plantarum菌株或安慰剂(双盲研究)；含有细菌或安慰剂对照的小瓶不透明。在第七天，在幽门远端约15cm处，通过标准的柔性胃十二指肠镜检查从十二指肠水平部获取组织样品。选择十二指肠粘膜是因为其是与细菌接触的第一个肠段，从而使微生物在通过肠道期间可能经受的适应性改变最小化。此外，对于粘膜组织取样，十二指肠容易接近。最后，十二指肠含有最低的内源性微生物群定殖水平，从而确保测量的应答尽可能特异。干预以4周的间隔进行以允许洗脱期并允许活检取样区的愈合。
细胞染色
用于细胞染色的抗体和其它试剂的各种稀释度列于表1中。
将血液收集在含edta的管中并进行facs分析。使用以下抗体对t细胞亚群进行染色：pacificblue缀合的抗-cd3(克隆ucht1；bdpharmingen)、percp缀合的抗-cd8(克隆sk1,biolegend)、apc-cy7缀合的抗-cd69(克隆fn50,bdpharmingen)、apc-缀合的抗-foxp3(克隆206d,ebioscience)、生物素缀合的抗-cd45ro(uchl1,biolegend)和pacificorange缀合的链霉亲和素(invitrogen)。同种型对照购自与抗体相同的公司，并以与抗体相同的稀释度使用。
对于t细胞的细胞内细胞因子染色，我们使用：pe-cy7缀合的抗-il4(mp4-25d2,biolegend)、alexa488缀合的抗-il-17a(克隆ebio64dec17；ebioscience)、pe-缀合的抗-il-21(克隆ebio3a3-n2；ebioscience)、alexa700缀合的抗-ifnγ(克隆b27；bdpharmingen)。
对于nk细胞群的染色，我们使用：apc缀合的抗-cd56(克隆mem-188,ebioscience)、efluor450缀合的抗-cd16(克隆cb16,ebioscience)、pe-缀合的抗-cd335(克隆9e2,biolegend)、pe-cy7缀合的抗-cd161(克隆hp-3g10,ebioscience)。在三种类型的t细胞刺激之后，研究t细胞极化。通过下述进行：(i)用pma/ca2+或超抗原(seb)非特异性刺激以研究总应答性是否受益生菌处理的影响，(ii)用特定l.plantarum菌株的细胞提取物刺激以研究是否刺激针对益生菌的特异性免疫应答，和(iii)用所有志愿者均接种的抗原(即，破伤风类毒素(tt))刺激以研究特异性记忆应答的可能刺激。
取血样之后，将200μl血用200μl补充有10％胎牛血清(fcs)的rpmi1640稀释，并与pma(豆蔻酸佛波醇乙酸酯；80nmsigma-aldrich,steinheim,德国)和ca2+(4μm)(4小时)、staphylococcusaureus肠毒素bseb(5μg/mlsigma,deisenhofen,德国)(24小时)、tt(破伤风类毒素；1.5lf/ml)(24小时)或细菌裂解物(30μg/ml)(24小时)一起孵育。根据施用的菌株用细菌裂解物刺激，并在处理一周后进行。用l.plantarumwcfs1处理一周之后，用l.plantarumwcfs1的细胞提取物刺激样品；用l.plantarumcip104448处理一周之后，用l.plantarumcip104448的细胞提取物刺激样品；用l.plantarumtifn101处理一周之后，用l.plantarumtifn101的细胞提取物刺激样品。这些细胞提取物是通过反复冻融益生菌制成的。
刺激后，用氯化铵裂解红细胞。洗涤后(含2％fcs的pbs)，将细胞与不同的抗体混合物一起孵育。
t细胞和t细胞子集的染色：将细胞与由抗-cd3、抗-cd8和抗-cd45ro组成的抗体混合物一起于暗处在冰上孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，将细胞与链霉亲和素pacificorange(1：100invitrogen)一起在冰上孵育15分钟。洗涤和离心后，在冰上将沉淀的细胞重新悬浮于固定/透化溶液(ebioscience，0.1％皂角苷和0.009％叠氮化钠)中持续45分钟。在perm溶液(ebioscience)中洗涤后，在小鼠血清中孵育细胞15分钟以防止非特异性结合，随后与细胞因子抗体混合物(抗il-4、抗-ifnγ、抗-il-17和抗-il21)或同种型细胞因子混合物一起在冰上孵育30分钟。用透化溶液洗涤(3次)后，将细胞重新悬浮于洗涤缓冲液中，并在24小时内通过流式细胞术测量。
nk细胞的染色：将细胞与由抗-cd3、抗-cd16、抗-cd56、抗-cd335和抗cd161组成的抗体混合物(nk细胞染色)，或与由抗-cd3、抗-cd16、抗-cd56以及抗-cd335和cd161同种型对照组成的nk细胞的同种型对照混合物一起于暗处在冰上孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，在冰上于facs裂解溶液(bdbiosciences，含有2％热灭活胎牛血清(fcs)的磷酸盐缓冲盐水(pbs))中固定细胞30分钟。洗涤后，将细胞悬浮在洗涤缓冲液中，并在24小时内在becton和dickinsonlsrii上通过流式细胞术测量；每个样品记录至少500.000次事件。
表1：抗体稀释度
rna分离和微阵列
通过使用trizol试剂(1ml)(invitrogen,breda,nl)从十二指肠活检中分离总rna。此后使用qiagenrneasymicro试剂盒(qiagen,venlo,nl)纯化rna。在nanodropnd-1000分光光度计(isogenlifescience,demeer,荷兰)上定量rna。使用agilent2100生物分析仪(agilenttechnologies,amsterdam,nl)检验rna质量。仅当样品展示出对应于18s和28s核糖体亚基的完整带并且不显示染色体峰或rna降解产物时，rna才被判断为适合于阵列杂交。
使用ambionwt表达试剂盒(lifetechnologies,bleiswijk,荷兰)将总rna(100ng)用于全转录cdna合成，随后使用affymetrixgenechipwt末端标记试剂盒(affymetrix,santaclaraca)进行标记。将样品与人类全基因组affymetrixgenechiphumangene1.1st阵列杂交，洗涤，染色并在affymetrixgenetitan仪器上扫描。有关阵列处理的详细信息可在affymetrixgenetitaninstrumentuserguideforexpressionarrayplates(p/n702933rev.2)中找到。
微阵列数据分析
应用用于统计学分析的madmax(lin等2011,jintegrbioinform,pmid21778530)进行微阵列分析。进行质量控制。所有阵列均符合标准。基于ncbientrez数据库(cdf版本15.1)，根据dai等(2005,nucleicacidsrespmid16284200)重新定义humangene1.1st阵列上的探针。以这种方式，humangene1.1st阵列靶向19682个独特基因。通过使用affyplm库中可用的稳健多阵列分析预处理算法并使用默认设置，由原始强度值获得归一化表达值(irizarry等,biostatistics,2003,pmid12925520)。过滤微阵列数据，选择具有至少5个探针、至少5个阵列上的表达值高于20且所有样品的四分位数范围>0.2(log2标度)的探针集合用于进一步的统计学分析。此外，使用0.2的四分位数范围(iqr)截止值来过滤在各种条件之间不显示变化的基因。如下鉴定差异表达的基因：使用线性模型，并应用实施了limma库中标准误差的经验贝叶斯正则化的矫正的t统计学(smyth等，2004)。为了调节相对于同一度方差的独立程度以及方差与信号强度之间的关系二者，通过贝叶斯分层模型扩展矫正的t统计学以限定基于强度的矫正的t统计学(sartor等,2006,bmcbioinformaticspmid17177995)。对于成对比较，当p值<0.05时，基因被定义为显著变化。
通路分析
使用madmax进行基因集合富集分析(gsea；在万维网：broad.mit.edu/gsea/)，错误发现率(fdr)<0.2的基因集合被视为显著富集。gsea考虑了更广泛的基因产物作用环境，即物理相互作用网络，例如生物化学、代谢或信号转导途径，并且具有无偏倚的优点，这是因为没有使用基因选择步骤(subramanian等,2005)。使用ingenuity通路分析中的upgenregulator分析(ipa；ingenuitysystems,redwoodcity,ca)鉴定在激活和抑制基因中起作用的可能的转录因子。
基因组测序和注释
l.plantarum菌株cip104448获自nizo培养物保藏(meijerink等，2010)。对于dna制备，沉淀2ml过夜培养物，洗涤并重新悬浮于tes缓冲液(n-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)中。利用溶菌酶(360mg/ml)和变溶菌素(140u/ml)，通过在37℃下孵育2小时来裂解细胞。随后加入300μl水和80μl20％sds溶液。使用苯酚/氯仿(3×)进行dna提取。用异丙醇沉淀dna，然后用70％乙醇洗涤。在37℃下用100μg/mlrna酶(sigma)处理样品1小时。利用illumina技术(baseclearleiden，nl)制备带有条形码的dna配对末端文库并进行测序。重叠群序列被提交给提供orf召集(calling)和自动注释的rast自动注释服务器。通过以下方法对cip48和tifn101的注释重叠群进行排序：将其与l.plantarumwcfs1的环状模板基因组进行比较，然后将其相互比较。使用blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)更详细地注释与wcfs1基因组不匹配的重叠群/基因。使用orthomcl(www.orthomcl.org/)确定3个基因组中的直接同源组(og)。
统计
流式细胞术的数据结果被表示为平均值±平均标准误差(sem)。通过kolmogorov-smirnov检验确认数据集的正态分布。使用双侧学生t检验来确定益生菌治疗后免疫细胞群体的变化。基因表达数据被描绘为中间物(范围)。使用双侧mannwhitneyu检验来确定体内益生菌治疗后表达谱的变化。p值<0.05(*)被视为具有统计学显著性。
结果
人体试验
在7天的摄取期过程中或之后，没有一个志愿者感到任何不适。在试验开始前(第0天)和第7天，采集血样以研究益生菌摄取对t细胞极化的影响。此外，在第7天，通过标准的柔性胃十二指肠镜检查采集活检，并分离总rna，然后与全基因组表达微阵列杂交。按照严格的标准进行杂交和原始数据分析的质量控制以确保阵列数据的质量尽可能高。
由l.plantarum诱导的差异性外周应答
从检测了由树突细胞诱导的il-10和il12的水平的一系列42种单独的l.plantarum菌株(meijerink等,2010)中选择l.plantarumwcfs1、l.plantarumcip104448和l.plantarumtifn101。l.plantarumwcfs1的特征为相对低的il10/il12比率，其被归类为促炎的；与培养基对照相比，l.plantarumcip104448的比率il10/il12不变，因此其被归类为中性的；l.plantarumtifn101诱导相对高的il10/il12比率，因此其被归类为抗炎的(meijerink等,2010)。
用l.plantarum处理6天后的细胞频率
用任一l.plantarum菌株处理之后，我们没有观察到cd3+细胞、cd3+/cd4+细胞(初始细胞或记忆细胞)或激活的记忆cd3-/cd4+细胞的总百分比的频率差异。然而，在安慰剂和cip48处理之后，cd4+/foxp3阳性细胞的百分比显著降低，但在wcfs1和tifn101处理之后并非如此(图1a-f)。此外，虽然我们没有发现处理对cd3+/cd8+初始细胞和记忆细胞的影响，但是仅cip48处理使激活的记忆细胞在统计学上显著降低(p<0.01)(图1g-j)。
处理不影响总nk细胞数或nkt数。nk细胞亚型(即cd56hi和cd56dim)的百分比也没有变化，而介导细胞毒性(jacobs等，2001；tarazona等，2002)的cd161(klrb1)的表达也不受l.plantarum处理的影响。
在三种类型的t细胞刺激之后研究t细胞极化。这通过下述进行：(i)用pma/ca2+或超抗原(seb)非特异性刺激以研究总应答性是否受l.plantarum处理的影响，(ii)用特定l.plantarum菌株的细胞提取物刺激以研究是否刺激针对l.plantarum的特异性免疫应答，和(iii)用先前施用的疫苗抗原(tt)刺激以研究特异性记忆应答的可能刺激。
用pma/ca-离子载体或seb非特异性刺激之后，我们研究了ifnγ、il-4、il-17或il-21阳性th细胞和记忆th细胞的百分比。用pma/ca-离子载体非特异性刺激之后，用安慰剂或施用的l.plantarum菌株处理不影响th细胞或th记忆细胞总群体的细胞因子产生(结果未示出)。虽然seb刺激之后，没有发现三种l.plantarum处理后总th细胞群体的细胞因子产生的差异(结果未示出)，但我们确实观察到l.plantarum处理后th记忆细胞的细胞因子产生的差异。用seb刺激(图2a-d)之后，我们观察到用cip48处理后产生il-17的激活的记忆th细胞的百分比降低，以及用tifn101处理后产生il-17的激活的记忆th细胞的百分比增加(图2b)。此外，tifn101处理后，产生ifnγ的激活的记忆th细胞的百分比也增加(图2d)。
通过tt更特异性地刺激之后，用l.plantarum菌株处理也影响细胞因子产生(图3a-d)。我们研究了记忆th细胞的细胞因子产生以研究l.plantarum处理对记忆t细胞的影响。tifn101处理后，产生il-17的激活的记忆th细胞的百分比和产生ifnγ的激活的记忆th细胞的百分比显著增加(分别图为3b和3d)；而tt刺激后，没有观察到其它l.plantarum对记忆th的细胞因子产生的影响。
最后，我们用研究中个体摄取的l.plantarum菌株的细胞提取物刺激个体的血样(图4a-d)。我们观察到：经wcfs1处理的受试者在用wcfs1细胞提取物刺激后显示出增强的il-17应答(图4b)。其它细胞因子不受这种处理的影响。在用cip48处理受试者的情况下，用cip48细胞提取物刺激受试者的血液时，受试者的细胞因子产生没有差异。用tifn101处理受试者时，其激活的记忆细胞在用tifn101细胞提取物刺激后显示出增加的il-17和ifnγ产生(分别为图4b和d)。
暴露于三种l.plantarum菌株后十二指肠粘膜中的差异性转录应答
虽然我们比较了菌株而非不同的物种，但是我们发现在暴露于三种l.plantarum菌株的受试者的应激肠中，上调基因或下调基因的数量差异很大。在用三种菌株处理后，315个基因被l.plantarumwcfs1差异调节，390个基因被cip48差异调节，多达779个基因被tifn101差异调节(图5a)。在这些基因中，wcfs1仅与cip48和tifn101分别共享35个和9个上调基因(图5b)。当cip48与wcfs1相比时，另外19个基因下调；而当cip48与tifn101相比时，另外5个基因下调(图5c)。共享基因主要涉及一般细胞功能和代谢。正如所预期的那样，在安慰剂处理的对照中的吲哚美辛应激肠中，与细胞修复相关的许多基因的表达上调。
为了更深入地研究由l.plantarum处理诱导的变化，随后根据表达的平均倍数变化对基因进行排序。表2-3中列出了10个最高诱导的基因和10个最低诱导的基因。wcfs1和cip48共享6个小核仁rna(snorna)(即snorna，(h)c/d(aca)盒6、14b、53、57、60、388)的下调。
tifn101产生了完全不同的谱(表4)。在tifn101(免疫活性最高的l.plantarum)最高诱导的基因中，10种中的8种与免疫有关，它们是免疫球蛋白λ可变体6-57、推定的v-集合和含免疫球蛋白结构域蛋白质6样、免疫球蛋白λ可变体7-46、干扰素调节因子4、gdnf家族、cd27、cd79a和纤溶酶原激活物。
基于免疫数据，我们期望发现由特异性转录因子引起的差异变化。为了鉴定这些转录因子并鉴定由不同菌株调控的通路，我们进行了ingenuity通路分析(ipa)。ipa使用文献信息结合基因表达变化来预测转录因子在数据集中的作用。在nsaid应激肠中，tifn101比cip48和wcsf1诱导更多变化。tifn101组中最显著的靶基因集合是免疫相关基因。tifn101使mhc-iiα上调，而使用cip48和wcfs1时，我们发现mhc-iiβ下调。这可解释tifn101处理组中对抗原(例如tt)的应答增强。可有助于tifn101处理组中的增强应答的另一通路是涉及白细胞外渗的基因的上调。有趣的观察是，tifn101使rapl增加，rapl是涉及调节整联蛋白亲和力和增强白细胞粘附的gtp酶。同时伴随着基本粘附分子(例如，icam-1和钙黏素(cdh-5))的上调，这说明tifn101引起的免疫细胞迁移通路的上调。此外，使用cip48和wcfs1时，观察到白细胞外渗的一些调节，但远不如tifn101组明显。
三种l.plantarum菌株之间的差异基因表达谱
由于三种l.plantarum菌株的差异作用，对l.plantarumcip104448和l.plantarumtifn101进行测序、注释并与l.plantarumwcfs1的基因组(染色体和质粒)(siezen等,2012)进行比较。基于重叠群到模板wcfs1基因组的这种排序，总共3010个直系同源组(og)被分配到染色体。三个基因组共享3010个染色体og中的2455个(＝81.5％)，其被定义为本研究的核心基因组。tifn101中的独特基因列于表5中。当包含与wcfs1染色体不匹配的重叠群和og/基因时，发现cip48和tifn101基因组的独特基因数量高得多。tifn101中许多独特基因在质粒上(见表5)。分析例如显示l.plantarumcip104448缺乏完整的植物乳杆菌素生物合成基因簇(和与该基因簇相邻的大量基因(即og334-348))，以及eps生物合成的整个基因簇。l.plantarumtifn101缺失一些与植物乳杆菌素生物合成相关的基因，以及用于胞外多糖生物合成的基因，许多糖利用盒和两个大的lpxtg锚定的粘液结合蛋白。
表2.摄取l.plantarumwcfs1(wcsf1)之后，nsaid应激的人肠道中10个上调最多的基因和下调最多的基因。
表3.摄取l.plantarumcip104448(cip48)之后，nsaid应激的人肠道中10个上调最多的基因和下调最多的基因。
表4.摄取l.plantarumtifn101之后，nsaid应激的人肠道中10个上调最多的基因和下调最多的基因。
表5.l.plantarumtifn101中主要的独特重叠群/基因簇/基因的总结；序列同一性号码示于第3栏，第一个seqidno表示多核苷酸序列，第二个seqidno表示编码的多肽[多核苷酸；多肽]。
讨论
本研究是为了探讨在体外选择的具有差异性免疫刺激能力的l.plantarum菌株是否对于经受轻微、常见的肠道免疫应激源的健康个体的局部免疫和全身免疫有不同的影响。所有三种菌株均对免疫有影响，但是这种影响高度依赖于菌株，并且在某些情况下可能不是有益的。基于通过在体外用l.plantarum菌株刺激树突细胞获得的结果，菌株wcfs1的免疫性质被视为促炎的，l.plantarumcip104448的免疫性质被视为中性的，l.plantarumtifn101的免疫性质被视为调控的。然而，体内对这些菌株的免疫应答与体外预测的免疫应答差异很大。摄取nsaid诱导cd4+/foxp3调控细胞减少，但被wcfs1和tifn101施用防止，这应该被视为有益的调控作用。cip48没有防止nsaid诱导的cd4+foxp3t细胞减少，并且具有更多负面影响。cip48使记忆细胞数量减少，从而暗示摄取这种细菌的促炎性、恶化效果。
在不同刺激后研究t细胞极化以探索细菌可能影响免疫的机制。我们假定：细菌壁成分可诱导免疫应答(smelt等，2012)，并且作为旁效应，增强全身免疫。然而，该假说作为唯一的责任机制必须被排除，这是因为在用细菌菌株挑战wcsf1摄取者的全血之后，仅wcfs1显示出il17产生升高的趋势。最明显的免疫刺激物(即tifn101)显示出对细菌提取物没有应答，但增强了针对特定致病性抗原(例如seb)和针对tt的应答。
粘膜转录组的分析显示：增强的记忆应答与tifn101增强的与t细胞和b细胞功能以及抗原呈递相关的过程的上调有关。与其它细菌相比，tifn101对摄取者的粘膜中的免疫相关通路有明显影响。特别地，tifn101增强了与抗原呈递相关的通路和基因。tifn101对cd27上调有明显影响，cd27上调是t细胞免疫的发生和长期维持所需要的(huang等，2013)。此外，tifn101提高了粘膜中的mhc-iiα和关键调控分子(例如rapl)的表达。rapl增强了t细胞的粘附和整合素亲和力(raab等，2010；zhang和wang，2012)。粘膜中的这些观察结果可以解释在tifn101摄取者中观察到的增强的记忆t细胞应答。此外，免疫球蛋白调控基因的上调和cd79a说明：粘膜中的b细胞免疫得到增强。cd79a也被称为b细胞抗原受体复合物相关蛋白α链，其与cd79b蛋白一起形成b细胞抗原受体(herren和burrows，2002)。cip48和wcfs1没有这些作用或下调过程，例如粘膜中的抗原呈递。
据我们所知，细菌能够下调肠道中的snorna这一观察现象以前尚未被报道过。snorna是代谢稳定的非编码rna，其与一组蛋白质相关联以形成小核仁rnp(snornp)。大多数snorna在rrna、小核rna(snrna)和其它细胞rna(包括mrna)中的2'-o-甲基化核苷酸和假尿苷的转录后合成中作为指导rna起作用(bratkovic和rogelj，2011；esteller，2011；williams和farzaneh，2012)。通过cip48和wcfs1的snorna53、57、60相对减少暗示核糖体rna甲基化的下调(kiss-laszlo等,1996)和rna的14b减弱的假尿苷化的下调(kiss等,2004)。这通常暗示细胞过程的去稳定化(su等,2014)，从而再次暗示cip48和wcfs1对轻微应激的肠道环境无益。
我们实施了l.plantarumcip104448和l.plantarumtifn101的基因组测序以鉴定可能负责三种l.plantarum菌株的差异生物效应的可能基因簇。与菌株wcfs1相比，在菌株cip48(340个新og)和tifn101(177个og)中发现了几百个新颖的l.plantarum基因。cip48和tifn101二者仅共享这些中的少数(47个og)。大多数这些新颖的基因似乎位于质粒上。l.plantarumtifn101部分缺乏植物乳杆菌素生物合成簇。以前的研究将这些基因与细胞因子产生的菌株差异联系在一起(meijerink等,2010；wells等,2011)，但本文显示，这些基因与体内免疫效应无关。此外，l.plantarumcip104448和l.plantarumtifn101缺乏非常大的糖代谢区域。这些适应归因于对环境因素的适应，这些因素是鉴定与益生菌效应相关基因的有趣靶标(molenaar等,2005)。基因的存在和缺乏均可增强细菌的免疫作用(smelt等,2013b)。这种比较基因组学研究中l.plantarum补充对粘膜转录组的影响与全身免疫激活参数结合，这提供了许多对后续实验工作的指导以鉴定负责或参与观察到的人受试者中的免疫效应差异的基因。
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