本发明属于生物技术领域,涉及血管生成素样蛋白4在保护内皮屏障功能中的应用。
背景技术:
血管生成素样蛋白4(angptl4)是分泌型糖蛋白,除angptl5之外,angptl1-8均在人和小鼠体内发现。人angptl4基因是高度保守的,跟小鼠有77%相似的氨基酸序列。人angptl4基因位于19p13.3,编码分子量为45-65kda的糖蛋白。与angptl家族相似,angptl4由n末端卷曲结构域和c末端纤维蛋白原结构域构成。目前,angptl4被认为是孤儿配体,目前尚未发现其受体。然而,angptl4被已知的ppar家族、糖皮质激素受体、pkc等的激活剂所激活,被血管紧张素受体阻断剂、抑制素、瘦素和胰岛素所抑制。小鼠体内angptl4主要表达在脂肪组织、肝脏、骨骼肌、心脏、皮肤和小肠。然而,人体angptl4主要表达在肝脏、血浆、胎盘、小肠、心脏和脂肪组织。angptl4的表达受到糖皮质激素受体和核受体ppars的调控。在人体和小鼠中,ppar反应元件可介导angptl4的表达。另外,在缺氧条件下心肌、内皮细胞和肿瘤组织中angptl4表达增加。原位肿瘤细胞和转移灶中tgf-β也可促进angptl4的表达。不同组织中angptl4的功能不同。原来发现肝脏中angptl4在脂代谢中起作用,现在发现angptl4在血管渗透性、血管新生和炎症信号通路中也发挥作用。足细胞在正常条件下表达angptl4水平较低,而在病理条件下足细胞表达angptl4增加。最近研究发现足细胞过表达angptl4可促进肾病综合症的发病。angptl4上调伴随着典型的病理改变,包括大量选择性蛋白尿,肾小球基底膜改变和足细胞足突广泛融合。这些结果提示angptl4可能对肾小球基底膜有破坏作用。而利用angptl4敲除和过表达小鼠,研究发现angptl4通过调控血管渗透性,抑制lewis肺癌和b16f0黑色素瘤的转移。然而,另一项研究发现肿瘤组织产生的angptl4与内皮紧密连接和粘附连接的连接蛋白整合素α5/β1、ve-cadherin、claudin-5结合,导致内皮破坏。敲除angptl4可抑制胶质瘤生长和血管新生。人们在angptl4敲除小鼠的研究中发现在视网膜发育过程中和病理条件下,angptl4通过调控内皮细胞间连接,进而调节血管渗透性和血管新生。这些结果提示angptl4在调控血管渗透性和血管新生中的重要作用。然而,angptl4对血管渗透性的调控机制不清楚,因此其在血管渗透性和肿瘤转移中的地位充满争议。总之,众多资料显示angptl4具备对血管渗透性和血管新生的调控作用,并且与肿瘤转移、心血管事件和炎症性疾病的发展有关。
微血管内皮屏障功能是指构成微血管管壁结构的内皮细胞及其间的各组分,控制血液中的细胞成分和大分子物质渗出至血管壁的能力。常常以微血管通透性作为内皮屏障功能的评价指标。研究证实内皮细胞间连接以及内皮细胞与基底膜之间的连接是维持微血管管壁通透性正常的重要结构和功能基础。
技术实现要素:
本发明所要解决的技术问题是保护内皮屏障功能,并减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤。
为了解决以上技术问题,本发明提供血管生成素样蛋白4在制备保护和/或增强细胞屏障功能的产品中的应用;
所述保护和/或增强细胞屏障功能体现在如下(1)-(3)至少任一所示的方面:
(1)抑制细胞通透性增加;
(2)保护细胞骨架和/或抑制细胞骨架重构;
(3)保护和/或促进细胞间连接。
上述应用中,所述保护和/或增强细胞屏障功能、所述抑制细胞通透性增加、所述保护细胞骨架和/或抑制细胞骨架重构和所述保护和/或促进细胞间连接分别为保护和/或增强高糖和/或氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)刺激下的细胞屏障功能、抑制高糖和/或氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)刺激下的细胞通透性增加、保护高糖和/或氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)刺激下的细胞骨架和/或抑制高糖和/或氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)刺激下的细胞骨架重构和保护和/或促进高糖和/或氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)刺激下的细胞间连接;
或,
所述保护和/或增强细胞屏障功能、所述抑制细胞通透性增加和所述保护和/或促进细胞间连接别为保护和/或增强心肌缺血再灌注损伤下的细胞屏障功能、抑制心肌缺血再灌注损伤引起的细胞通透性增加和保护和/或促进心肌缺血再灌注损伤下的细胞间连接;
所述心肌缺血再灌注损伤优选为糖尿病心肌缺血再灌注损伤。
上述应用中,所述细胞为内皮细胞,优选为微血管内皮细胞,再优选为心脏微血管内皮细胞。
为了解决以上技术问题,本发明还提供血管生成素样蛋白4在制备预防和/或减轻和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的产品中的应用。
上述应用中,所述心肌缺血再灌注损伤为心脏微血管内皮细胞屏障功能损伤。
上述应用中,所述心脏微血管内皮细胞屏障功能损伤为心肌危险区面积增加、心脏微血管通透性增加、心肌组织髓过氧化物酶表达增加、心肌组织灶性出血、心脏微血管内皮细胞间连接下降和/或心脏微血管内皮细胞凋亡。
上述任一所述的应用中,所述心肌缺血再灌注损伤为糖尿病心肌缺血再灌注损伤。
上述任一所述的应用中,所述心肌缺血为由急性心肌梗死引起的心肌缺血。
为了解决以上技术问题,本发明还提供血管生成素样蛋白4在制备预防和/或治疗心肌梗死的产品中的应用。
上述应用中,所述心肌梗死为急性心肌梗死引起的心肌缺血再灌注后的心肌梗死。
上述应用中,所述急性心肌梗死为糖尿病急性心肌梗死。
为了解决以上技术问题,本发明还提供血管生成素样蛋白4在制备预防和/或治疗高血糖引起的疾病或损伤的产品中的应用。
上述任一所述的应用中,所述血管生成素样蛋白4的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明证明血管生成素样蛋白4具有保护内皮屏障功能的作用,并可以减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤。
附图说明
图1为实施例1中未经sirna敲低的各组人心脏微血管内皮细胞的通透性检测。
图2为实施例1中利用sirna敲低angptl4表达后各组人心脏微血管内皮细胞的通透性检测。
图3为实施例1中各组内皮细胞骨架结构的比较。
图4为实施例1中westernblot检测各组细胞间紧密连接蛋白的表达。
图5为实施例1中westernblot检测各组细胞间黏附连接蛋白的表达。
图6为实施例1中westernblot检测各组细胞间黏着斑连接蛋白的表达。
图7为实施例2中苏木素-伊红染色法比较各组间心肌组织灶性出血程度。
图8为实施例2中免疫组织化学法比较各组间心肌组织mpo表达。
图9为实施例2中各组大鼠心脏微血管内皮细胞的电镜检测结果。
图10为实施例2中各组大鼠心脏微血管内皮细胞p120-catenin表达的检测结果。
图11为实施例2中各组大鼠心肌微血管内皮细胞的凋亡检测结果。
图12为实施例2中westernblot检测各组大鼠心肌组织jam-a蛋白的表达。
图13为实施例2中westernblot检测各组大鼠心肌组织ve-cadherin蛋白的表达。
图14为实施例2中westernblot检测各组大鼠心肌组织integrin-α5蛋白的表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
人心脏微血管内皮细胞(hcmec)为美国sciencell公司产品,产品目录号为6000。
1%青/链霉素双抗生素,即青霉素/链霉素溶液(100x),为美国sciencell公司产品,产品目录号为0503。
dmem低糖液体培养基为美国hyclone公司产品,产品目录号为sh30021.01b。
高糖培养基的组分如表1所示:
表1高糖培养基组分
表1中的基础培养基为dmem低糖液体培养基。
胰岛素(1nm)的配制:称取胰岛素(sigma公司产品,产品目录号为i-5500)10mg,加5ml蒸馏水(2m盐酸调节溶液ph值=2.0,待胰岛素干粉溶解后,用0.5m氢氧化钠溶液微调ph至7.0)配成2mg/ml的贮存液,用ep管分装为20份,每份0.25ml(含0.5mg胰岛素),-20℃保存,使用时取适量贮存液加入到培养基中,稀释至目标浓度。
rhangptl4(1μg/ml)的配制:取50μg的angptl4干粉(r&d公司产品,产品目录号为4487-an-050),加入0.5ml的pbs配成100μg/ml的贮存液,置于-20℃保存,使用时取适量贮存液加入到培养基中,稀释至目标浓度。
angptl4sirna为美国appliedbiosystems公司产品,产品目录号为s169900,序列为5’-gggccgcuacuauccacuatt-3’(seqidno.2)。
angptl4sirna溶液(60pmol)的配制:5nmolangptl4sirna粉剂加入50μldepc水,-20℃保存。取1μl上述溶液加入9μldepc水,稀释10倍至10μm,取6μl该溶液加入至600μlopti-memi培养基(invitrogen公司产品,产品目录号为51985034)中,静置5min,得到a液。取6μllipo-imax(invitrogen公司产品,产品目录号为13778-100)试剂加入至600μlopti-memi培养基中,得到b液。将a液与b液按混合均匀,室温下静置20min,再与10μlredoligo(invitrogen公司产品,产品目录号为14750100)混合均匀,得到1.2ml转染试剂,可用于24孔板的4个孔。
阴性sirna(selectnegativecontrol#1sirna)为美国appliedbiosystems公司产品,产品目录号为4390843。
阴性sirna溶液(60pmol)的配制:同angptl4sirna溶液(60pmol)的配制,以5nmol阴性sirna粉剂替换angptl4sirna粉剂,可配制成阴性sirna溶液(60pmol),用于24孔板的4个孔。
糖尿病鼠(基因型:zdf-leprfa/fa)和非糖尿病瘦鼠(基因型:zdf-leprfa/+)为spf级12周龄雄性zdf大鼠,体重:(325±25)g,均为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。
血管生成素样蛋白4的氨基酸序列如seqidno.1所示。
实施例1、高糖和氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)共同刺激下血管生成素样蛋白4(angptl4)对内皮屏障功能的影响
利用sirna敲低内皮细胞angptl4的表达,以证实angptl4是否具有保护内皮细胞的功能。
一、将人心脏微血管内皮细胞(hcmec)在高糖(18mm)(表1)培养基中培养,将第5-6代细胞随机分为如下各组,分别在如下各组的条件下在t75细胞培养瓶中进行培养,再分别给予氧-糖-血清剥夺/复氧(ogsd/r)处理。
ogsd/r处理包括:(1)使用相应的培养基进行换液,实现糖-血清剥夺。其中,药物干预及ogsd/r干预用细胞培养基成分见表2。(2)利用2.5l强塑厌氧盒(biomérieux,marcyl’etoile,法国,产品目录号为96127)和厌氧产气包(biomérieux,marcyl’etoile,法国,产品目录号为96124),对培养瓶中的细胞进行缺氧干预2h(缺氧指示条呈现恒定的红色表示达到缺氧条件),将细胞培养瓶从缺氧盒转移到培养箱(37℃,5%co2)进行复氧干预2h,实现缺氧/复氧。至此完成了ogsd/r处理。
表2药物干预及ogsd/r干预用细胞培养基
表2中的基础培养基为dmem低糖液体培养基。
1、正常糖ogsd/r组:将终浓度为5×105/cm2的细胞在正常糖(5.5mm)(表1)条件下培养24h,继之用5.5mm培养基(表2)换液,立即给予ogsd/r处理;
2、高糖ogsd/r组:将终浓度为5×105/cm2的细胞在高糖(18mm)(表1)条件下培养24h,继之用18mm培养基(表2)换液,立即给予ogsd/r处理;
3、胰岛素组(1nm):缺氧前1h,将终浓度为5×105/cm2的细胞在18mm培养基(表2,其中胰岛素终浓度为1nm)中培养1h,继之给予ogsd/r处理;
4、angptl4组(1μg/ml):缺氧前1h,将终浓度为5×105/cm2的细胞在18mm培养基(表2,其中angptl4终浓度为1μg/ml)中培养1h,继之给予ogsd/r处理;
5、angptl4+阴性sirna组:当24孔板中培养的细胞达到80%融合时,每孔密度为4×104/cm2细胞加入300μl转染试剂(60pmol阴性sirna溶液),转染6h后更换高糖(18mm)(表1)培养基,转染24h及48h后荧光显微镜下观察转染效果,待稳定生长后,在缺氧前1h,将终浓度为5×105/cm2的细胞在18mm培养基(表2,其中angptl4终浓度为1μg/ml)中培养1h,继之给予ogsd/r处理;
6、angptl4+angptl4sirna组:处理方法同第5组,仅将转染试剂改为60pmolangptl4sirna溶液,在缺氧前1h,将终浓度为5×105/cm2的细胞在18mm培养基(表2,其中angptl4终浓度为1μg/ml)中培养1h,继之给予ogsd/r处理。
以上各组均设6次重复。
二、荧光定量检测各组单层内皮通透性
(一)未经sirna敲低的各组内皮屏障功能的比较
提取步骤一中各组细胞的总rna,并应用hifi-mmlvcdna第一链合成试剂盒(北京cwbio公司产品,产品目录号为cw0744)进行反转录,得到各组的cdna。分别以各组的cdna为模板,应用powersybrgreenpcrmastermix试剂盒(美国abi公司产品,产品目录号为4367659),以gapdh为管家基因,进行real–timepcr检测目的基因angptl4的表达水平。
real–timepcr引物如下:
gapdh上游引物:5’-acatcgctcagacaccatg-3’(seqidno.3);
gapdh下游引物:5’-tgtagttgaggtcaatgaaggg-3’(seqidno.4)。
angptl4上游引物:5’-agacacaactcaaggctcag-3'(seqidno.5);
angptl4下游引物:5’-ctcatggtctaggtgcttgtg-3'(seqidno.6)。
real–timepcr反应条件如表3所示。
表3real–timepcr反应条件
95℃,10min;95℃,15秒,60℃,1min此步骤收集荧光信号,40个循环,反应完成后同在60-95℃进行融解曲线分析,每10秒升高1℃。
根据real-timepcr检测结果,采用2-δδct法对各样品中检测基因的表达差异进行相对定量分析。2-δδct相对定量分析计算公式如下:
f=2-{[待测组目的基因平均ct值-待测组管家基因平均ct值]-[对照组目的基因平均ct值-对照组管家基因平均ct值]}
以人心脏微血管正常单层内皮细胞为对照,对正常糖ogsd/r组、高糖ogsd/r组、胰岛素组(1nm)和angptl4组(1μg/ml)的单层内皮细胞进行通透性检测,利用体外血管通透性检测试剂盒(美国milliporechemicon公司产品,产品目录号为ecm640)进行各组荧光定量,光镜检测结果和荧光定量检测结果分别如图1和表4所示。
图1中,a:正常单层内皮细胞;b:正常糖ogsd/r组;c:高糖ogsd/r组;d:
注:★★p<0.01vs.人心脏微血管正常单层内皮细胞组;**p<0.01vs.正常糖ogsd/r组;▲▲p<0.01vs.高糖ogsd/r组。
微血管内皮屏障功能是指构成微血管管壁结构的内皮细胞及其间的各组分,控制血液中的细胞成分和大分子物质渗出至血管壁的能力。常常以微血管通透性作为内皮屏障功能的评价指标。
图1和表4表明,与人心脏微血管正常单层内皮细胞组相比,正常糖ogsd/r组和高糖ogsd/r组人心脏微血管内皮细胞的通透性均显著增高(p均<0.05),且高糖ogsd/r组比正常糖ogsd/r组人心脏微血管内皮细胞的通透性显著增高(p<0.05)。与高糖ogsd/r组相比,angptl4组的人心脏微血管内皮细胞的通透性显著降低(p<0.05),而且胰岛素组与angptl4组的效果相当(p均>0.05)。说明angptl4能够保护人心脏微血管内皮细胞的通透性,抑制细胞通透性增加。
(二)利用sirna敲低angptl4表达后各组内皮屏障功能比较
设置如下各组,再分别给予如下各组同步骤一的ogsd/r处理。
1、单层内皮细胞的阴性sirna组:ecm培养基(美国sciencell公司产品,产品目录号为6000)在24孔板中培养人心脏微血管内皮细胞(hcmec)达到80%融合时,每孔密度为4×104/cm2的细胞加入300μl转染试剂(60pmol阴性sirna溶液),转染6h后更换高糖(18mm)(表1)培养基,转染24h及48h后荧光显微镜下观察转染效果,待稳定生长;
2、单层内皮细胞的angptl4sirna组:处理方法同第1组,仅将转染试剂改为60pmolangptl4sirna溶液;
3、高糖ogsd/r的阴性sirna组:用高糖(18mm)(表1)培养基在24孔板中培养人心脏微血管内皮细胞(hcmec)达到80%融合时,每孔密度为4×104/cm2的细胞加入300μl转染试剂(60pmol阴性sirna溶液),转染6h后更换完全培养基,转染24h及48h后荧光显微镜下观察转染效果,待稳定生长;
4、高糖ogsd/r的angptl4sirna组:处理方法同第3组,仅将转染试剂改为60pmolangptl4sirna溶液;
5、angptl4的阴性sirna组:用高糖(18mm)(表1)培养基在24孔板中培养的细胞达到80%融合时,每孔密度为4×104/cm2的细胞加入300μl转染试剂(60pmol阴性sirna溶液),转染6h后更换完全培养基,转染24h及48h后荧光显微镜下观察转染效果,待稳定生长后,在缺氧前1h给予angptl4(终浓度为1μg/ml)干预;
6、angptl4的angptl4sirna组:处理方法同第5组,仅将转染试剂改为60pmolangptl4sirna溶液,缺氧前1h给予angptl4(终浓度为1μg/ml)干预;
以上各组均设8次重复。
将上述得到的单层内皮细胞的阴性sirna组和angptl4sirna组、高糖ogsd/r的阴性sirna组和angptl4sirna组以及angptl4的阴性sirna组和angptl4sirna组。对这6组的单层内皮细胞进行通透性检测,光镜检测结果和荧光定量检测结果分别如图2和表5所示。
图2中,a、e:正常单层内皮细胞;b、f:高糖ogsd/r组;c、g:angptl4组(1μg/ml);a-c:阴性sirna组;e-g:angptl4sirna组。
表5不同药物对单层内皮细胞通透性的影响(x±s,n=8)
注:各行中★★p<0.01vs.单层内皮细胞;**p<0.01vs.高糖ogsd/r组。
图2和表5表明,与人心脏微血管正常单层内皮细胞相比,高糖ogsd/r组的内皮细胞通透性显著增高(p<0.05)。与高糖ogsd/r组相比,angptl4的阴性sirna组内皮通透性均显著降低(p<0.05)。与angptl4的阴性sirna组相比,angptl4的angptl4sirna组内皮通透性均无显著改变(p>0.05)。结果表明,敲低angptl4的表达能阻断内皮细胞屏障的保护功能,但敲低angptl4后外源性补充angptl4仍可发挥保护内皮细胞屏障功能的作用。
三、各组内皮细胞骨架结构的比较
以人心脏微血管正常单层内皮细胞为对照,激光扫描共聚焦显微镜下观察步骤一中正常糖ogsd/r组、高糖ogsd/r组、胰岛素组、angptl4组、angptl4+阴性sirna组和angptl4+angptl4sirna组的细胞骨架。
上述激光扫描共聚焦显微镜检测细胞骨架的方法具体如下:
(一)细胞爬片的制备
采用
(二)细胞爬片的固定
1、弃去腔室载玻片系统小腔内的培养基上清,以pbs浸洗小腔3次,每次3min,注意动作一定要轻柔,以防损伤细胞。最后一次冲洗时要将每个小腔内的液体吸净。
2、室温下,以4%的多聚甲醛固定细胞15min,以pbs浸洗3次,每次3min。
(三)破膜
0.1%tritonx-100/pbs室温破膜5min,pbs浸洗细胞3次,每次3min。
(四)封闭
吸净pbs后在小腔内滴加pbs配制的10%正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司产品,产品目录号为ar0009),室温下封闭40min。
(五)染细胞骨架
5μlfitc-鬼笔环肽贮存液(美国sigma公司产品,产品目录号为p5282)加入150μlpbs中配成工作液(5μg/ml)并用以染各组细胞,在湿盒中室温染色30-60min。
(六)复染核及封片
pbs浸洗各组细胞爬片3次,每次3min后,吸净每个小腔内的液体,以含有dapi的封片液(北京中杉金桥生物技术公司产品,产品目录号为zli-9557)封片,并以指甲油黏贴细胞爬片四周。小心擦净爬片表面的污渍。
(七)图像采集
激光扫描共聚焦显微镜下随机选取每组5个视野进行观察拍照,用405nm波长的激光器激发蓝色荧光,用488nm波长的激光器激发绿色荧光,观察并比较各组细胞。
结果如图3所示。
图3中,a:正常单层内皮细胞;b:正常糖ogsd/r组;c:高糖ogsd/r组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna组;i:angptl4+angptl4sirna组。
图3表明,与人心脏微血管正常单层内皮细胞相比,正常糖ogsd/r组和高糖ogsd/r组内皮细胞的应力肌丝显著增加,内皮细胞规律的线性细胞骨架消失,肌丝向细胞膜转移增加,细胞回缩,细胞间缝隙增加。与高糖ogsd/r组相比,胰岛素组和angptl4组内皮细胞应力肌丝均减少,细胞间缝隙减少,而且胰岛素组与angptl4组的效果相当,提示angptl4能保护内皮细胞骨架,抑制细胞骨架重构或分散。
四、各组对细胞间紧密连接蛋白表达的影响
采用jam-a抗体(abcam公司产品,产品目录号为英国ab52647)、occludin抗体(abcam公司产品,产品目录号为英国ab31721)和gapdh抗体(美国cst公司产品,产品目录号为2118),westernblot检测步骤一中正常糖ogsd/r组、高糖ogsd/r组、胰岛素组、angptl4组、angptl4+阴性sirna组和angptl4+angptl4sirna组内皮细胞occludin和jam-a的表达,用于评价内皮细胞间紧密连接结构的完整性。
结果如图4所示。
图4中,1:正常糖ogsd/r组;2:高糖ogsd/r组;3:胰岛素组;4:angptl4组;5:angptl4+阴性sirna组;6:angptl4+angptl4sirna组;a:occludin蛋白表达,b:jam-a蛋白表达,n=6;★★p<0.01vs.正常糖ogsd/r组;**p<0.01vs.高糖ogsd/r组。
图4表明,与正常糖ogsd/r组相比,高糖ogsd/r组内皮细胞occludin表达无显著差别(p>0.05),而jam-a表达显著降低(p<0.05)。与高糖ogsd/r组相比,胰岛素组和angptl4组内皮occludin表达均无显著改变(p均>0.05),而两组的内皮jam-a表达均显著增高(p均<0.05),而且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05)。说明angptl4能促进紧密连接蛋白jam-a的表达,敲低angptl4能够阻抑内皮细胞紧密连接蛋白的表达。
五、各组对细胞间黏附连接蛋白表达的影响
采用ve-cadherin抗体(美国santacruz公司产品,产品目录号为sc-28644)、p120-catenin抗体(abcam公司产品,产品目录号为ab92514)和gapdh抗体(美国cst公司产品,产品目录号为2118),westernblot检测步骤一中正常糖ogsd/r组、高糖ogsd/r组、胰岛素组、angptl4组、angptl4+阴性sirna组和angptl4+angptl4sirna组内皮细胞ve-cadherin和p120-catenin的表达,用于评价内皮细胞间黏附连接结构的完整性。
结果如图5所示。
图5中,1:正常糖ogsd/r组;2:高糖ogsd/r组;3:胰岛素组;4:angptl4组;5:angptl4+阴性sirna组;6:angptl4+angptl4sirna组;a:ve-cadherin蛋白的表达,b:p120-catenin蛋白的表达,n=6;★★p<0.01vs.正常糖ogsd/r组,**p<0.01vs.高糖ogsd/r组。
图5表明,与正常糖ogsd/r组相比,高糖ogsd/r组内皮细胞ve-cadherin的表达显著降低(p<0.05),而p120-catenin表达无显著改变(p>0.05)。与高糖ogsd/r组相比,胰岛素组内皮细胞ve-cadherin表达显著增高(p<0.05),而angptl4组内皮细胞ve-cadherin表达有增高趋势(p>0.05)。胰岛素组和angptl4组内皮细胞p120-catenin的表达无显著改变(p均>0.05)。说明angptl4能够促进内皮细胞黏附连接蛋白ve-cadherin的表达,敲低angptl4能够阻抑内皮细胞黏附连接蛋白表达。
六、各组对细胞间黏着斑连接蛋白表达的影响
采用integrin-α5抗体(abcam公司产品,产品目录号为ab150361)、integrin-β1抗体(美国cellsignalingtechnology公司产品,产品目录号为(cst4706s)和gapdh抗体(美国cst公司产品,产品目录号为2118),westernblot检测步骤一中正常糖ogsd/r组、高糖ogsd/r组、胰岛素组、angptl4组、angptl4+阴性sirna组和angptl4+angptl4sirna组内皮细胞integrin-α5和integrin-β1的表达,用于评价内皮细胞间黏着斑连接结构的完整性。
结果如图6所示。
图6中,1:正常糖ogsd/r组;2:高糖ogsd/r组;3:胰岛素组;4:angptl4组;5:angptl4+阴性sirna组;6:angptl4+angptl4sirna组;a:integrin-α5蛋白表达,b:integrin-β1蛋白表达,n=6;★★p<0.01vs正常糖ogsd/r组;**p<0.01vs高糖ogsd/r组。
图6表明,与正常糖ogsd/r组比较,高糖ogsd/r组integrin-α5和integrin-β1的表达均无显著改变(p>0.05)。与高糖ogsd/r组比较,胰岛素组和angptl4组内皮integrin-α5的表达均显著增高(p均<0.05),而且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05),但这两组内皮细胞的integrin-β1表达无显著改变(p均>0.05)。提示angptl4能够促进黏着斑连接蛋白表达。
上述步骤四至六的结果表明,血管生成素样蛋白4能促进细胞间连接。
综上所述,正常糖和高糖ogsd/r均导致心脏微血管内皮细胞的屏障功能损伤,且后者损伤更重。而胰岛素和angptl4均能保护高糖ogsd/r状态下的心脏微血管内皮屏障功能。
实施例2、血管生成素样蛋白4(angptl4)通过保护内皮屏障功能减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤
为探明非糖尿病瘦鼠、糖尿病鼠分别发生急性心肌梗死(ami)再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤的程度、对心肌微血管内皮细胞凋亡的影响以及对心肌微血管内皮屏障功能有无损伤,血管生成素样蛋白4能否减小糖尿病鼠ami再灌注后心肌梗死范围和再灌注损伤、心肌微血管内皮细胞凋亡及保护心肌微血管内皮屏障功能,进行如下实验:
一、将12周龄雄性zdf大鼠56只,随机分为如下各组:
1、糖尿病鼠假手术组:糖尿病鼠lad(左前降支(血管))穿线但不结扎。
2、糖尿病鼠mi对照组:糖尿病鼠lad穿线前后不给药。
3、非糖尿病瘦鼠mi对照组:非糖尿病瘦鼠lad穿线前后不给药。
4、胰岛素组(5u/100g体重):糖尿病鼠在结扎冠状动脉前降支前1h开始静脉注射胰岛素(5u/100g体重),监测并维持血糖为10mmol/l。
5、angptl4组(10μg/kg体重):糖尿病鼠在结扎lad前1h静脉注射重组人angptl4(rhangptl4,10μg/kg体重)。
6、angptl4+阴性sirna组:糖尿病鼠lad结扎前48h,心肌注射转染试剂阴性sirna(80μg/kg体重):
1)计算n/p比率(影响转染效率的关键)
n/p比率是对jetpei复合体的所带电荷的度量。它指的是dna分子带负电的磷酸基团与jetpei中n残基的摩尔比,是衡量核酸与转染试剂比例的参数。从理论上讲,jetpei/dna复合体的电中性为n/p=2-3,但本实验中,n/p=6转染效果最好。
2)5nmsirna加4.5μl10%葡萄糖溶液(终浓度8μg/μl),冻于-20℃冰箱保存。取3μl贮存液,用10%葡萄糖溶液稀释至8μl。即:5μl10%葡萄糖溶液+7μl去离子水+3μl阴性sirna,得到1/2注射体积(葡萄糖终浓度5%),混匀静置5min。
3)8μl10%葡萄糖溶液+4μl去离子水+3μlinvivo-jetpei试剂(polyplus-transfection公司产品,产品目录号为201-10g),得到1/2注射体积(葡萄糖终浓度5%),混匀。
4)将步骤2)和3)得到的上述两种液体1:1混合,得到1个注射体积(30μl)的转染试剂(0.8μg/μl,n/p=6),混匀,室温孵育15min,用于一只大鼠注射。
5)将得到的转染试剂jetpei-dna复合体溶液注射至心肌,具体方法如下:
①麻醉:戊巴比妥钠(1%,35mg/kg)腹腔注射;
②备皮、消毒、固定动物;
③左侧胸部第五肋间剪开,切开心包,暴露心脏;
④32g微量注射器注入转染试剂,分三点注入左心室前壁,每处注射10μl。
⑤关胸,大鼠正常饲养48h后接受缺血/再灌注。
该组动物在结扎lad前1h开始静脉注射rhangptl4(10μg/kg体重)。
7、angptl4+angptl4sirna组:糖尿病鼠lad结扎前48h,心肌注射转染试剂angptl4sirna(方法同第6组),结扎lad前1h给予rhangptl4(10μg/kg体重)静脉注射。
共7组,每组8只。
将第2、3、4、5、6、7组开胸结扎冠状动脉45min,再开放180min,建立ami再灌注模型。
二、各组间微血管通透性的比较
检测危险区(包括非缺血区和再灌注区)心肌fitc-右旋糖酐含量以评估心脏微血管内皮细胞屏障功能。
(一)危险区面积的判定及取材
称取心脏总质量后,切除左右心房及右室,称取左室总质量。然后将左室切成均匀薄片,厚度略大于2mm,称取每个心肌片的质量。拍照,照片导入电脑,测量危险区面积,计算危险区体积和质量。
观察终点各组非缺血区危险区范围如表6所示。
观察终点各组再灌注区危险区范围如表7所示。
(二)miles法微血管通透性测定
心脏微血管内皮通透性按照“hultstromd,malmgrenl,gilstringd,etal.fitc-dextransastracersformacromolecularmovementsinthenervoussystem.afreeze-dryingmethodfordextransofvariousmolecularsizesinjectedintonormalanimals[j].actaneuropathol,1983,59(1):53-62.”公开的方法,利用酶标仪测定心肌组织萃取液异硫氰酸荧光素(fitc)浓度。再灌注后30min尾静脉注射0.2ml含200mg/mlfitc-dextran(70kda)的生理盐水溶液,心肌取材后进行微血管通透性检测。2.5h后大鼠处死后进行心肌组织取材。大鼠左心室心肌危险区取材(湿重100mg),冷pbs冲洗后,置于1ml含50mmol/l的乙酸铵和150mmol/l氯化钠的溶液(ph=7.4)中匀浆,于4℃下12000g离心15min。上清液转移至新ep管内,以上述缓冲液按1∶100比例稀释,贮存在-70℃冰箱内保存,按照lowry等(lowryoh,rosebroughnj,farral,etal.proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent[j].jbiolchem,1951,193(1):265-275)的方法,使用bsa作为标准品,利用多功能酶标仪检测fitc-dextran的浓度。
观察终点各组非缺血区微血管通透性参数变化如表6所示。
观察终点各组再灌注区微血管通透性参数变化如表7所示。
表6观察终点各组非缺血区微血管通透性参数变化(x±s,n=8)
注:与糖尿病鼠假手术组比较,★p<0.05;
表7观察终点各组再灌注区微血管通透性参数变化(x±s,n=8)
注:与糖尿病鼠mi对照组比较,**p<0.01;
表7表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌fitc-右旋糖酐含量均显著增加(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌fitc-右旋糖酐含量显著增加(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组相比,胰岛素组和angptl4组心肌fitc-右旋糖酐含量显著降低(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05),说明angptl4能够保护心脏微血管内皮细胞的通透性,抑制其通透性增加。
三、各组间心肌组织灶性出血程度的比较
苏木素-伊红(h-e)染色及心肌组织灶性出血程度评分,具体步骤如下:
1、5μm石蜡切片,置于60℃恒温烤箱,烘烤1h;
2、二甲苯脱蜡,20-30min;
3、梯度酒精水化:由高到低依次为100%、95%、90%、80%和70%;
4、流水冲洗干净,加入苏木素染液5min,水洗;
5、流水冲洗干净,加入1%盐酸酒精分化液2-3秒;
6、清水冲洗2min,温水返蓝;
7、加入1%伊红乙醇溶液20s;
8、梯度酒精脱水:由低到高为70%、80%、90%、95%和100%;
9、二甲苯透明:于二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ中各浸泡10min;
10、中性树胶封片;
11、光镜下观察心肌组织灶性出血程度并评分:每张片子随机选4个视野,在×100光镜下观察红细胞的外渗程度,并在×400镜下予以确认。评分标准(参考“barrabesja,garcia-doradod,gonzalezma,etal.regionalexpansionduringmyocardialischemiapredictsventricularfibrillationandcoronaryreocclusion[j].amjphysiol,1998,274(5pt2):h17671775”):0分:未见红细胞外渗;1分:红细胞轻度外渗;2分:组织间红细胞大量外渗;3分:外渗的红细胞区域性融合,形成血肿。
苏木素-伊红(h-e)染色结果如图7所示,心肌组织灶性出血评分如表8所示。
图7中,a:糖尿病鼠假手术组;b:糖尿病鼠mi对照组;c:非糖尿病瘦鼠mi对照组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna;i:angptl4+angptl4sirna组。
图7和表8表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌fitc-右旋糖酐含量、灶性出血、mpo表达均显著增加(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组的灶性出血显著增加(p均<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌fitc-右旋糖酐含量、灶性出血、mpo表达均显著降低(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05),说明angptl4能够降低心肌fitc-右旋糖酐含量、灶性出血、mpo表达,保护微血管内皮细胞。
四、各组对心肌组织髓过氧化物酶(mpo)表达的影响
检测危险区心肌mpo表达以评估心脏微血管内皮屏障功能。
mpo染色
1、烤片:石蜡包埋组织切片3-4μm厚度,将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1h;
2、脱蜡:切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ),每次10min;
3、水化:切片经梯度酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddh2o洗2×2min;
4、抗原修复:酶消化修复法,切片tbs冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后tbs洗涤(2×2min)。
5、封闭:滴加封闭液,即pbs配制的10%正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司产品,产品目录号为ar0009),37℃湿盒孵育30min;
6、加一抗:滴加抗mpo抗体(prosci公司产品,产品目录号为70-900),37℃湿盒孵育2h;
7、洗涤:tbs-t洗涤(3×5min);
8、封闭:滴加封闭液,即pbs配制的10%正常山羊血清,37℃湿盒孵育10min;
9、加二抗:滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(生物素标记山羊抗兔igg(h+l),碧云天生物技术公司产品,产品目录号为a0277),37℃湿盒中孵育30min;
10、洗涤:tbs-t洗涤(3×5min);
11、封闭:滴加试剂tween20,37℃湿盒孵育封闭20min;
12、加hrp-sa(辣根过氧化物酶标记streptavidin,碧云天生物技术公司产品,产品目录号为a0303):滴加用抗体稀释液稀释(1:50~200,终浓度5~20nm),37℃湿盒中孵育30min;
13、洗涤:tbs-t洗涤(3×5min),tbs洗涤(2×5min);
14、显色:应用dab溶液显色;
15、复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;
16、封片:待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片。
髓过氧化物酶(mpo)染色结果如图8所示。
用med6.0的数码病理图像分析系统中的组化分析模块进行图像分析,高倍镜下随机选择10个视野,分别计算每个视野中mpo的阳性目标面密度,并取均值作为各种蛋白表达的相对含量,心肌组织mpo水平如表8所示。
图8中,a:糖尿病鼠假手术组;b:糖尿病鼠mi对照组;c:非糖尿病瘦鼠mi对照组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna;i:angptl4+angptl4sirna组。
图8和表8表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌mpo表达均显著增加(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌mpo表达显著增加(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌mpo表达均显著降低(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05),说明angptl4能够抑制心肌mpo表达,保护内皮屏障。
五、各组对电镜下心肌微血管内皮细胞间紧密连接结构的影响
透射电镜观察内皮细胞紧密连接超微结构。
按照“phinikaridoua,andiame,prottia,etal.noninvasivemagneticresonanceimagingevaluationofendothelialpermeabilityinmurineatherosclerosisusinganalbumin-bindingcontrastagent[j].circulation,2012,126(6):707-719”公开的方法,利用透射电镜观察心肌微血管超微结构。心肌危险区样本(每组2块)取材后固定于2%的戊二醛溶液中2h,继之用磷酸盐缓冲液冲洗2h,然后用1%四氧化锇固定2h。每片心肌组织分为三份(从缺血边缘区至缺血核心区),然后每份组织制作3至4个切片,每只动物共制作9-12个切片。样本通过乙醇的梯度脱水后包被在环氧树脂中。半薄切片(0.2μm)用甲苯胺蓝染色后在光镜下观察,以确定微血管丰富的区域。在150目的铜网上进行薄切片(0.09μm),并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染,最后使用透射电镜观察。
结果如图9所示。
图9中,a:糖尿病鼠假手术组;b:糖尿病鼠mi对照组;c:非糖尿病瘦鼠mi对照组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna;i:angptl4+angptl4sirna组。
图9表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌危险区内皮细胞紧密连接宽度均显著增加,且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌危险区内皮细胞紧密连接宽度显著增加。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌危险区内皮细胞(心肌危险区是指结扎区)紧密连接宽度均显著降低,且胰岛素与angptl4的效果相当,进一步说明angptl4能保护内皮细胞间紧密连接结构。
六、各组对微血管内皮细胞黏附连接蛋白p120-catenin表达的影响
检测危险区心肌p120-catenin的表达以评估心肌内皮屏障结构完整性。
共聚焦显微镜观察内皮细胞特异性连接蛋白p120-catenin表达,心肌冰冻组织切片进行免疫荧光分析,以5μm厚度连续切片,具体步骤如下:
1、从-80℃冰箱中取出冰冻切片,在通风橱风干30min。
2、冷丙酮4℃固定10min。
3、pbs轻洗,3次×3min。
4、滴加pbs配制的10%正常山羊血清孵育30min。
5、吸弃血清,不洗,滴加相应浓度的抗p120-catenin抗体(abcam公司产品,产品目录号为ab92514)100μl,4℃过夜。
6、pbs轻洗,3次×3min。
7、滴加fitc标记的山羊抗兔igg(earthox公司产品,产品目录号为e031230),37℃,孵育30min。
8、pbs轻洗,3次×3min。
9、吸干pbs,用含dapi的封片液封片。
10、随即于激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。也可放置于-20℃冰箱中,一周内观察拍照。
共聚焦显微镜观察结果如图10所示。
用med6.0的数码病理图像分析系统中的组化分析模块进行图像分析,高倍镜下随机选择10个视野,分别计算每个视野中p120-catenin的阳性目标面密度,并取均值作为各种蛋白表达的相对含量,内皮细胞p120-catenin表达水平如表8所示。
图10中,a:糖尿病鼠假手术组;b:糖尿病鼠mi对照组;c:非糖尿病瘦鼠mi对照组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna;i:angptl4+angptl4sirna组。
图10和表8表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌p120-catenin的表达均显著降低(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌p120-catenin的表达显著降低(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌p120-catenin的表达均显著增加(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05)。
七、各组对ami再灌注区心肌微血管内皮细胞凋亡的影响
tunel-cd34双染检测内皮细胞凋亡。
按照文献“deresendemm,amaralsl,munzenmaierdh,etal.roleofendothelialcellapoptosisinregulationofskeletalmuscleangiogenesisduringhighandlowsaltintake[j].physiolgenomics,2006,25(2):325335.”报道的方法,心肌组织冰冻切片(8μm)包被、风干30min后,冷丙酮中固定5min,丙酮-氯仿(体积比1:1)固定5min,丙酮固5min。样本用pbs(ph=7.2)洗3遍,按照“tedjaratis,bakerch,aptes,etal.synergistictherapyofhumanovariancarcinomaimplantedorthotopicallyinnudemicebyoptimalbiologicaldoseofpegylatedinterferonalphacombinedwithpaclitaxel[j].clincancerres,2002,8(7):2413-2422.”公开的方法进行cd34-tunel双染,切片进行dapi染色来计算总细胞核个数。在200×荧光显微镜下观察拍摄细胞图片。内皮细胞着红色、正常细胞核着蓝色、凋亡细胞核着蓝色及绿色(呈青色)。计算每平方毫米视野下的凋亡内皮细胞数占内皮细胞总数的比例,用于定量评价内皮细胞凋亡情况。
结果如图11和表8所示。
图11中,a:糖尿病鼠假手术组;b:糖尿病鼠mi对照组;c:非糖尿病瘦鼠mi对照组;d:胰岛素组;e:angptl4组;g:angptl4+阴性sirna;i:angptl4+angptl4sirna组。
图11和表8表明,如危险区心肌微血管内皮细胞凋亡的检测显示:与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌危险区微血管内皮细胞凋亡比例均显著增加(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌危险区内皮细胞凋亡比例显著增加(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌危险区内皮细胞凋亡比例均显著降低(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05),说明angptl4能够抑制微血管内皮细胞凋亡。
表8各组内皮屏障结构完整性参数(x±s,n=6)
注:与糖尿病鼠假手术组比较,★p<0.05,★★p<0.01;与糖尿病鼠mi对照组比较,*p<0.05,**p<0.01。
八、各组对ami危险区心肌微血管内皮细胞间连接蛋白表达的影响
(一)紧密连接
检测危险区心肌jam-a的表达以评估心肌内皮屏障结构完整性。方法同实施1的步骤四,结果如图12所示。
图12中,1:糖尿病鼠假手术组;2:糖尿病鼠mi对照组;3:非糖尿病瘦鼠mi对照组;4:胰岛素组;5:angptl4组;6:angptl4+阴性sirna;7:angptl4+angptl4sirna组。
图12表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组心肌jam-a的表达显著降低(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌jam-a的表达显著降低(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌jam-a的表达均显著增加(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05)。
2、黏附连接
检测危险区心肌ve-cadherin的表达以评估心肌内皮屏障结构完整性。方法同实施1的步骤五,结果如图13所示。
图13中,1:糖尿病鼠假手术组;2:糖尿病鼠mi对照组;3:非糖尿病瘦鼠mi对照组;4:胰岛素组;5:angptl4组;6:angptl4+阴性sirna;7:angptl4+angptl4sirna组。
图13表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组和非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌ve-cadherin的表达均显著降低(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组心肌ve-cadherin的表达显著降低(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,胰岛素组和angptl4组心肌ve-cadherin的表达均显著增加(p均<0.05),且胰岛素与angptl4的效果相当(p均>0.05)。
3、黏着斑连接
检测危险区心肌integrin-α5的表达以评估心肌内皮屏障结构完整性。方法同实施1的步骤六,结果如图14所示。
图14中,1:糖尿病鼠假手术组;2:糖尿病鼠mi对照组;3:非糖尿病瘦鼠mi对照组;4:胰岛素组;5:angptl4组;6:angptl4+阴性sirna;7:angptl4+angptl4sirna组。
图14表明,与糖尿病鼠假手术组相比,糖尿病鼠mi对照组心肌integrin-α5的表达显著降低(p均<0.05),且糖尿病鼠mi对照组比非糖尿病瘦鼠mi对照组integrin-α5的表达显著降低(p<0.05)。与糖尿病鼠mi对照组比较,angptl4组心肌integrin-α5的表达均显著增加(p均<0.05),而胰岛素组心肌integrin-α5的表达无显著改变(p>0.05)。
以上结果表明,非糖尿病瘦鼠mi和糖尿病鼠mi再灌注后均致心肌缺血再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞凋亡及内皮屏障功能损伤,且糖尿病鼠损伤更重。胰岛素和angptl4均能减轻糖尿病鼠mi再灌注后的心肌缺血再灌注损伤、抑制心脏微血管内皮细胞凋亡及减轻内皮屏障功能损伤。