青阳参总苷在制药中的用途的制作方法

本发明涉及一种药用组合物，具体地说，是由青阳参总苷为活性成分制成的药用组合物及其在制备用于预防和治疗慢性应激障碍和创伤后应激障碍药物的应用，属于中药技术领域。

背景技术：

应激由加拿大心理学家Hans Selye于20世纪30年代提出，是机体在内稳态受到威胁时,为了保持内部平衡产生的一系列适应性反应。应激反应指个体因为应激源所致的各种生物、心理、社会、行为方面的变化，常称为应激的心身反应。这些心理应激源包括：严重的生活事件、重大灾难；人际关系长期紧张、工作压力大等生活、工作方面的应激；生存环境改变的应激等。这些强烈或持久的应激因素，对大多数人来说，都可引起应激反应，如焦虑、恐惧、抑郁、愤怒等。根据其对机体影响的性质及程度，分为生理性应激和病理性应激。适度的应激反应能动员机体非特异适应系统,提高对疾病的抵抗力,而严重或持久的应激则对健康不利，应激反应超出一定强度和/或持续时间超过一定限度，构成应激障碍。

超过24h的持续或反复应激称为慢性应激,该状态起因于持久的应激源,主要伴有神经、内分泌、免疫和行为等变化。慢性应激则能严重影响着人类的身心健康,如损伤中枢神经系统、神经内分泌、免疫系统等的机能，慢性应激是多种临床综合症，包括焦虑症、抑郁症等情感性障碍，以及糖尿病、心血管疾病和肿瘤等重大疾病的诱发因素。

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)，又称延迟性心因反应，是指由于异乎寻常的威胁性或灾难性心理创伤，导致延迟出现和长期持续的精神障碍，是一种强应激作用下导致的延迟出现和长期持续的精神障碍。近年来，随着突发灾难性事件增多，以及恐怖主义的自杀性爆炸等不断发生，PTSD成为关注的重点。PTSD表现有明显的生理和心理症状，它的复杂性表现在常与相关的精神失调合并发展，如抑郁、药物滥用、记忆和认知问题，以及其他的生理和精神健康问题。PTSD可以共病精神疾患，如焦虑、抑郁、睡眠障碍、物质依赖(酒精、药物)；也可以共病心身疾病：高血压、支气管哮喘等、消化性溃疡、肥胖、肿瘤及其他心身疾病。

研究表明，降低高唤醒的早期症状可能会减轻回避和情绪麻木以及再体验等症状。创伤应激引起的高唤醒是一个复杂的生理状态，患者的病理性行为与应激引起的患者脑内兴奋性和抑制性氨基酸的不平衡和单胺类神经递质的过度耗竭有关，Leah R.等发现，慢性应激可以使大脑海马中谷氨酸含量明显升高，γ-氨基丁酸含量降到普通人的一半。因此不同脑区氨基 酸的变化亦有所不同，最终的行为表现是多个脑区氨基酸变化共同作用的结果，长期慢性应激易导致抑郁症，产生抑郁样行为，使得活动性减弱、恐惧抑制减弱等。可见，在神经生化变化方面，PTSD与慢性应激诱导产生的抑郁等情感性障碍具有相似性。因而，对于PTSD的治疗，除了采用危机干预的原则和技术，帮助患者提高心理应对技能，表达和宣泄相关的情感外，药物治疗也是PTSD的重要手段。而目前临床上还没有特异的针对PTSD的特效药物，而是主要使用一些抗焦虑、抗抑郁、抗惊厥和抗癫痫等药物治疗PTSD，在改善症状、治疗共病疾患、减轻干扰心理治疗和/或日常功能的相关症状方面达到治疗效果。

青阳参(Cynanchum otophyllum Schneid)为萝藦科鹅绒藤植物，分布于我国西南部，是西南地区的重要的民族药之一，民间用其根作滋补强壮药，治疗小儿惊风症和风湿关节痛。木全章等公开了青阳参的抗癫痫【木全章、沈月毛、周茜兰，治疗癫痫的药物，中国专利，专利号：CN 1060676N；木全章、沈月毛、周茜兰、郝小江，青阳参甙丙至庚五个化合物及其制备方法，中国专利，专利号：CN 1064048C】、抗美尼尔病【木全章、沈月毛、周茜兰、郝小江，青阳参苷甲、苷乙在制药中的应用，CN1064235；抗美尼尔氏病青阳参用途和制备方法CN1052905】、抗肝炎【木全章、沈月毛、周茜兰、郝小江，抗肝炎药青阳参用途和制备方法CN114987A】等用途；杨庆雄等公开了青阳参抗抑郁用途【杨庆雄、金和锴、杨崇仁，一种C₂₁甾体配糖体在制药中的应用，ZL200410079555.6】。而青阳参在慢性应激障碍和PTSD治疗和预防方面的应用，未见有报道。

本发明旨在提供青阳参总苷在预防和治疗慢性应激障碍和创伤后应激障碍方面的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供青阳参(Cynanchum otophyllum Schneid)在制药领域中的新用途，即以青阳参总苷部分为有效成分制备用于预防和治疗慢性应激障碍和创伤后应激障碍的药物。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

采用萝摩科鹅绒藤属植物青阳参(Cynanchum otophyllum Schneid)根茎为原料，经粉碎成小于10目的颗粒，用70％～100％醇或酮溶剂提取2～3次，溶剂的每次加量以没过原料面为宜，合并提取液并在50℃～80℃下加热浓缩回收溶剂，至无明显的溶剂气味；浓缩液用水稀释，浓缩液与水的重量比为1：3～5,用石油醚或汽油萃取2～3次，水层再用氯仿或乙酸乙酯或甲酸乙酯萃取2～3次，合并所述的溶剂部分，回收溶剂，得到浅黄色粉末，即为青阳参总苷，得率为1％～5％。

技术方案

通过下面给出的具体的实施例和药理试验例可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明内容的限定。

实施例1

取野生青阳参块根10kg，粉碎，80％乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收溶剂。浓缩液用水稀释，石油醚萃取三次，水层再用氯仿萃取三次，合并氯仿部分。回收氯仿，得浅黄色粉末230克，得率为2.3％。所得浅黄色粉末为青阳参总苷，以告达廷苷元(caudatin)为对照品，参照药品标准(WS₃-B-2343-97)方法，测得总苷含量为62.5％。

Lieberman-Burchard和Keller-Killiani反应均呈阳性，表示总苷为含2-去氧糖的甾体化合物。

实施例2

取栽培青阳参块根10kg，粉碎，75％乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收溶剂。浓缩液用水稀释，石油醚萃取三次，水层再用氯仿萃取三次，合并氯仿部分。回收氯仿，得浅黄色粉末310克，得率为3.1％。所得浅黄色粉末为青阳参总苷，以告达廷苷元(caudatin)为对照品，参照药品标准(WS₃-B-2343-97)方法，测得总苷含量为65.5％。

实施例3

将青阳参总苷100g、淀粉60g、糊精5g混和均匀，加入10％淀粉浆制软材，用14目尼龙筛网制粒，60～70℃通风干燥，16目筛整粒，加入硬脂酸镁1.5g、羧甲基淀粉钠5g混匀，压制成1000片，包衣，即得所需的片剂，每片含青阳参总苷100mg。

实施例4

取青阳参总苷100g，加入淀粉50g、硬脂酸镁2g混匀，直接用全自动胶囊填充机填充成1000粒，抛光，即得所需的胶囊。每粒青阳参总苷100mg。

药理试验例1

——大鼠慢性社会挫败应激试验

1实验方法

1.1实验动物

成年雄性SD大鼠(购自北京维通利华实验动物公司)60只，初始体重250-280g，单笼饲 养。成年雄性Long-Evans大鼠30只。所有动物自由饮水进食。光周期8:00-20:00，温度20-24℃，相对湿度40-70％，实验均在光周期进行。实验开始前至少适应性饲养7天。根据糖水偏爱基值测试结束的结果，对动物进行平衡分组，分为6组，每组10只。分别为：不应激对照组(control)、应激口服生理盐水组(stress)、青阳参5mg/kg组(QYS-5mg/kg)、青阳参15mg/kg组(QYS-15mg/kg)、青阳参45mg/kg组(QYS-45mg/kg)和氟西汀组(Flu)。

1.2实验药品

青阳参总苷，盐酸氟西汀(常州四药制药有限公司)分析纯蔗糖(北京化工厂)。

1.3实验程序

实验分为三个阶段，即糖水偏爱基线测试阶段、慢性社会挫败应激及给药阶段和应激停止后糖水偏爱后测及其他行为测试。

糖水基线测试阶段：新进动物在动物饲养间适应7天，第1-3天每只动物每天抚摸3min，使动物熟悉实验人员，适应实验人员对动物捉拿的操作。随后分别适应单瓶糖水、挂双瓶(一瓶清水一瓶糖水)适应，在第8天测试糖水基线值(糖水偏爱＝糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)×水消耗量)。

慢性社会挫败应激(chronic social defeat)：将SD大鼠放入到Long-Evans大鼠的饲养盒中，Long-Evans大鼠作为居住者会主动攻击SD大鼠，每次打斗一个小时，前半个小时让其任意打斗，半个小时后在饲养盒中间放置一个铁丝网制成的隔板，使两只动物无法直接接触，但仍能看见彼此、听见彼此的声音、闻见彼此的气味。若动物打斗过于激烈，为避免对动物的躯体造成伤害，可提前结束打斗，用铁丝网将两只动物隔开。此后隔天按照上述方法进行应激，共应激10天。

应激反应测试：在应激第4、8、10天测试糖水偏爱。应激结束后用陌生情境旷场箱测试动物的新颖寻求，记录僵直行为时间、不动时间和运动距离等行为，随后用惊跳反射箱测试动物的惊跳反射和前脉冲抑制。

1.4给药时间及给药方式：动物从打斗第5天开始进行隔天灌胃给药1次，氟西汀每天灌胃给药1次。

1.5统计分析：研究采用SPSS 19.0进行数据处理，以P<0.05为差异有统计学意义(**p<0.01,*p<0.05)。

2实验结果

2.1青阳参总苷对慢性社会挫败应激糖水偏爱的作用

如图1所示，糖水偏爱随应激时间的延长，糖水偏爱的值出现显著变化。在应激8天后， 与应激组对比，青阳参总苷能够逆转糖水偏爱，并呈一定的剂量依赖关系，说明青阳参总苷可以显著恢复社会挫败应激导致的快感缺失症状。

2.2青阳参总苷对慢性社会挫败应激旷场相关行为的作用

如图2所示，青阳参总苷对慢性社会挫败应激活动性的研究发现，不同剂量青阳参总苷具有一定增加大鼠僵直时间和不动时间，减少活动距离，说明对焦虑样行为具有一定抑制作用，并增加大鼠探究活动。

2.3青阳参总苷对慢性社会挫败应激诱发惊跳反射的影响

如图3所示，慢性社会挫败应激对与对照组相比，对三个声音诱发的惊反射无显著性差异，但青阳参总苷中剂量组(15mg/kg)有弱刺激(95dB)惊反射有显著抑制趋势，但对105dB和115dB诱发惊反射抑制不显著，高剂量组(45mg/kg)对105dB诱发惊反射有一定的抑制作用趋势；对115dB诱发惊跳反射效应不显著。说明青阳参总苷具有一定的弱刺激惊反射抑制作用。

2.4青阳参总苷对慢性社会挫败应激前脉冲抑制的影响

如图4所示，青阳参总苷中剂量15mg/kg组能够显著增强71dB PPI和77dB PPI，45mg/kg也有增强71dB PPI的趋势，但对77dB PPI无显著作用。说明青阳参总苷具有一定的增强前脉冲抑制的作用。

药理试验例2

——大鼠慢性不可预知温和应激试验

1实验方法

1.1实验动物

成年雄性SD大鼠72只，初始体重250-280g，单笼饲养(购自北京维通利华实验动物公司)。所有动物自由饮水进食。光周期8:00-20:00，温度20-24℃，相对湿度40-70％，实验均在光周期进行。实验开始前至少适应性饲养7天，适应期第3天开始触摸大鼠直至适应期结束，同时在适应期的第5、6、7天进行糖水训练。在第8天进行糖水偏爱第一次测试，根据糖水偏爱第一次的实验结果对动物进行平衡分组，分为对照组(control)、应激组(stress)、氟西汀组(flu)、青阳参总苷低剂量组(QYS-5mg/kg)、青阳参总苷中剂量组(QYS-15mg/kg)和青阳参总苷高剂量组(QYS-45mg/kg)共六组，每组12只动物。Control组与其他组动物分开两个动物房饲养。

1.2实验药品

同药理试验例1

1.3实验程序

实验分为三个阶段，即糖水偏爱基线测试阶段、慢性应激及给药阶段和应激停止后糖水偏爱后测及其他行为测试。

糖水基线测试阶段：同药理试验例1

慢性不可预知温和应激：糖水偏爱基线值测试后，根据测试结果进行平衡分组，分为应激组和对照组。应激组分为青阳参总苷组和盐水处理组。慢性温和应激方式共包括：彻夜光照、高温应激、低温应激、频闪灯应激和倾斜鼠笼和湿笼子等。动物每天遭受1-2种应激，每天的应激方式都不相同，应激方式随机。应激期内以7天为一个周期，一个周期结束后测试糖水偏爱，共应激28天。

应激反应测试：应激开始后全体动物每隔7天进行一次糖水测试，观察动物随着应激时间的延长糖水偏爱的变化。应激结束后进行旷场实验。

1.4给药方式和给药时间：从应激开始后的第14天开始口服灌胃隔天给药1次，一直持续到应激结束，氟西汀口服灌胃每天给药1次(10mg/kg)。青阳参总苷采用低中高三个剂量(5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)。

1.5统计分析：研究采用SPSS 19.0进行数据处理，以P<0.05为差异有统计学意义(**p<0.01,*p<0.05)。

2实验结果

2.1青阳参总苷对慢性温和应激糖水偏爱的影响

如图5所示，刚开始应激前四周，应激组及不同给药组对糖水偏爱程度都稍高于对照组，但四周过后，应激影响显著，糖水偏爱显著下降，对照组实验环境后，糖水偏爱增加。与对照组相比，应激组的影响最大，不同剂量的青阳参总苷组合阳性对照组都能显著不同程度的恢复大鼠的糖水偏爱。应激第三周，青阳参总苷高剂量组开始有恢复糖水偏爱的趋势，第四周，青阳参总苷高剂量组已经可以显著恢复慢性温和应激动物的糖水偏爱，慢性应激过后第五周，青阳参总苷中低剂量组均可以显著恢复慢性温和应激动物的糖水偏爱。

2.2青阳参总苷对慢性温和应激大鼠旷场行为的影响

如图6所示，青阳参总苷有增强慢性温和应激动物的僵直时间的趋势，且随着剂量的升高，僵直行为时间也有逐渐增加的趋势。青阳参总苷能增加旷场实验中慢性应激动物的不动时间，与青阳参总苷呈现剂量效应。青阳参总苷能够显著降低慢性应激动物的活动性，呈一定的剂量依赖关系，青阳参总苷可以缩短穿越旷场中央区域的时间。

药理试验例3

——大鼠足底电击诱发惊反射高唤醒模型试验

1实验方法：

1.1实验动物：雄性SD大鼠60只，初始体重为250g～280g(购自北京维通利华实验动物技术公司)，单笼饲养，自由饮水、取食。适应期每天抚摸捉拿动物，使其适应实验主试人员操作，排除非实验特异性的应激因素对实验的干扰。动物接受应激处理后，分为4组：生理盐水组、青阳参总苷(QYS)低、中和高剂量组，每组15只。

1.2实验装置：惊反射测试箱(购自美国San Diego Instruments，Inc)和恐惧条件反射箱(购自美国MED公司)

1.3实验程序

短程强电击应激程序：将动物放入恐惧条件反射箱(购自美国MED公司)适应3分钟后，给予动物足底电击强应激，应激采用1.5mA电流强度，电流持续时间5秒，共进行5次电击，每次电击间隔60-180s。最后一次电击结束后60s取出大鼠，将大鼠送回饲养笼。用5％酒精清洁电击箱。

惊反射测试程序：惊反射测试箱(购自美国San Diego Instruments，Inc)，将测试动物放入由圆形有机玻璃制成的束缚盒中适应5分钟，测试不同声音强度(95dB、105dB和115dB)诱发的惊吓反射。

应激后2周的基础惊反射测试：在动物接受应激前测试惊反射基值，共30个trials，适应5min后，95dB、105dB、115dB各10个trials，随机播放，记录每个trial下惊反射的幅值，取各个分贝下诱发惊反射10个trials的平均值作为该声音诱发的惊跳反射值。在应激后14天按照相同程序进行测试。

恐惧增强高唤醒测试(fear-potentiated startle,FPS)：全部动物进行FPS测试。FPS测试分为前测、训练和后测三个阶段。FPS前测目的是比较在伴随光线和不伴随光线的条件下动物对不同强度声音的惊反射是否有差异，并为接下来的以光线作为条件信号的FPS训练提供基线值，FPS后测目的是测量动物在恐惧条件化训练后，在恐惧情境和条件恐惧信号条件下惊反射的变化。

适应期后，进行一次惊反射基值测试。其后将所有动物进行足底电击，以应激当天为Day0。给药周期过后，停药后24小时进行基础惊反射测试，其后进行FPS惊反射测试。

1.4给药方式和给药时间：实验采用灌胃隔天一次给药方式。从应激第一天开始给药，持续14天。青阳参总苷采用低中高三个剂量(5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)。

1.5统计分析：研究采用SPSS 19.0进行数据处理，以P<0.05为差异有统计学意义(**p<0.01,*p<0.05)。

2.实验结果

2.1青阳参对应激后无环境线索诱发的基础惊反射变化的影响

动物经受创伤应激后会产生高唤醒状态，实验采用不同强度的白噪音刺激(95dB、105dB和115dB)诱发的惊吓反射来测量动物的唤醒程度。方差分析结果表明，与应激前比较，应激后的动物在115dB的白噪音条件下诱发的惊反射显著升高。95dB和105dB的白噪音诱发的惊反射在应激前后没有显著差异。说明短时强电击应激使动物产生高唤醒症状。创伤经历后动物接受不同剂量的青阳参药物处理后，青阳参总苷对各组动物惊反射的作用没有显著差异，如图7。

2.2青阳参总苷对应激后恐惧情境诱发惊反射的作用

创伤应激处理后，各组动物接受14天的不同剂量的青阳参总苷处理，接着在惊反射测试箱内进行恐惧条件化学习，然后在恐惧情境(惊反射箱，不呈现条件线索)中检测不同强度的白噪音(95，105，115dB)诱发的惊反射强度的变化。结果发现，在恐惧情境中能显著增加105dB和115dB声音刺激下动物的惊反射强度，而不同剂量青阳参总苷对各组动物在恐惧情境诱发的惊反射强度增加的作用存在显著的差异。其中，中、高剂量的青阳参总苷组能显著抑制恐惧情境下105dB诱发惊反射的增强，高剂量的青阳参总苷组能显著抑制恐惧情境下115dB声音诱发的惊反射增强，如图8。

2.3青阳参总苷对恐惧条件信号诱发惊反射的作用

如图9所示，在FPS训练开始之前的基线水平测试，光刺激条件下和无光刺激条件下动物的惊反射水平无显著影响，说明作为条件信号的光刺激在条件化训练前对惊反射无干扰作用。在FPS训练结束后，比较动物在恐惧相关的条件信号和没有条件信号的情况下不同声音强度的白噪音诱发的惊反射的变化，结果显示，恐惧条件线索能显著增加动物的惊反射强度，而不同剂量的青阳参总苷组都能抑制动物在不同强度白噪音诱发的惊反射增强，并且呈现明显的剂量依赖性。特别是对105dB声音刺激条件下恐惧线索诱发的惊反射增强，高剂量青阳参总苷组的抑制效果特别明显。

高唤醒是PTSD的核心症状，并且能推进其他症状的发展变化。高唤醒主要表现为愤怒、睡眠障碍、烦躁不安、高警戒状态和惊吓反应的增加等。稳定性较好的惊反射作为高唤醒的测量工具已经广泛应用。本实验结果显示，动物经过FPS学习后，恐惧应激情境和应激条件 信号刺激能够使动物的惊反射显著增强。青阳参总苷能显著抑制恐惧情境和恐惧线索诱发的惊反射增强，也提示青阳参总苷可以用于PTSD的治疗与预防。

附图说明：

图1青阳参总苷对社会挫败慢性应激糖水偏爱的影响；

图2青阳参总苷对社会挫败慢性应激陌生情境旷场的影响；

图3青阳参总苷对慢性社会挫败应激大鼠惊跳反射的作用；

图4青阳参总苷对慢性社会挫败应激大鼠前脉冲抑制的作用；

图5青阳参总苷对慢性温和应激动物糖水偏爱的影响；

图6青阳参对慢性温和应激动物焦虑样行为的影响；

图7青阳参总苷对无环境线索诱发基础惊反射的影响；

图8青阳参总苷对恐惧情境诱发的惊反射增强的抑制的作用；

图9青阳参总苷对恐惧线索诱发惊反射增强的抑制作用。