一种治疗骨质疏松性骨折的中药复方制剂及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种治疗骨质疏松性骨折的中药复方制剂，此外，本发明还涉及该中药复方制剂的制备方法和医药用途。

背景技术：

骨质疏松性骨折是骨质疏松症的严重并发症，常在轻微外力作用下即可造成全身各部位骨折，多发于脊柱、髋部和桡尺骨远端，其他部位也易发生骨折，常可引起骨折部位疼痛、畸形、功能障碍，脊柱骨折还可引起身高变矮、驼背等。

随着我国人口老龄化，原发性骨质疏松症发病率也呈现明显的上升趋势，造成的骨质疏松性骨折也越来越多。对于骨质疏松性骨折的治疗，主要分为非手术和手术治疗，但由于骨质疏松症患者自身成骨细胞与破骨细胞藕联关系的失衡，其骨折愈合的时间延迟，甚至不愈合，预后质量也较正常者差，易导致再次手术或二次骨折风险，给患者躯体、精神、经济带来沉重负担。因此，还需结合系统性管理、抗骨质疏松治疗(西药、中药、物理疗法、康复训练、运动疗法)。

中医药在防治骨质疏松症方面具有重要作用和独有特色。但由于骨质疏松性骨折多发于中老年人，非手术治疗的重要原则是长期固定制动，一定程度上增加了褥疮、深静脉血栓、肺部感染及心脑血管病等并发症的风险，其危害性甚至超过了骨折本身。因此就骨质疏松性骨折的首选疗法而言，中医药相对于现代手术治疗就没有那么明显的优势。不过，骨质疏松性骨折再次骨折的发生率相对较高，必须坚持抗骨质疏松治疗，西药、中药均可作为主要辅助手段。虽然手术可解决骨折部位的复位、固定及早期康复锻炼，但由于老年人体质因素较弱、基础疾病较多，仍会有骨折延迟愈合及不愈合的发生，通过中医药的对症处理和整体调节，可充分发挥中医药的特色优势。

脾肾阳虚证是原发性骨质疏松性骨折的重要证型之一，因此，本发明选用施杞教授临诊中的经验方——健脾补肾方，通过体内、外实验，运用现代科学手段进行研究，结合―先后天之本”、―脾肾相关”中医理论，以阐明健脾补肾方促进骨质疏松性骨折愈合的作用机制及疗效分析，进而为临床医师在诊治该病时提供一定的理论指导。

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提出一种疗效确切、安全性高的治疗骨质疏松性骨折的中药复方制剂——健脾补肾方，并提出其制备方法和医药用途。

本发明所涉及的中药药材质量均应符合中国药典2015年版一部相应药材项下各有关规定。其中：

党参为为桔梗科植物党参codonopsispilosula(franch.)nannf.、素花党参codonopsispilosulanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen或川党参codonopsistangshenoliv.的干燥根。

刺五加为五加科植物刺五加acanthopanaxsenticosus(rupr.etmaxim.)harms的干燥根及根茎或茎。

骨碎补为为水龙骨科植物槲蕨drynariafortunei(kunze)j.sm.的干燥根茎。

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿epimediumbrevicornumaxim的干燥叶。

丹参为为唇形科植物丹参salviamiltiorrhizabge.的干燥根和根茎。

独活为伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的干燥根。

具体而言，本发明治疗骨质疏松性骨折的中药复方制剂，由上述健脾补肾中药与药物辅料制成，所述健脾补肾中药的重量份配比如下：党参6-30，刺五加6-30，骨碎补6-30，淫羊藿6-30，丹参6-15，独活3-12。

本发明中药复方制剂的健脾补肾中药经过乙醇或水溶剂提取和醇沉、滤过的方法纯化，其中所采用的提取方法是根据药物中有效成分的理化性质，选用醇沉、滤过的提取溶剂和提取条件；所采用的纯化方法在保证疗效的前提下，选用乙醇沉淀法经行纯化处理。

本发明提供了上述中药复方制剂的制备方法。

本发明中药复方制剂通过下述方法和步骤制备：

①按组方重量称取各药材，浸泡1h，煎煮1～3次，每次煎煮0.5～1.5h，一煎加水10～14倍，二、三煎加水量6～10倍，合并煎煮液，滤过，在60～70℃温度下，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.30的浸膏。其中，优选煎煮2次，每次煎煮1h，一煎加水14倍，二煎加水量10倍，合并煎煮液，滤过，优选滤过液浓缩至相对密度为1.05～1.07的浸膏液；

②上述①浸膏液中加入乙醇，至乙醇浓度为50％～80％，优选加乙醇至浓度为60％；静置过夜，醇沉。滤过，滤液在60～70℃温度下回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.35～1.40的浓浸膏；

③上述②浓浸膏在70～80℃时减压干燥，粉碎成细粉，过60目筛，即得浸膏粉；

④按照浸膏粉：填充剂：崩解剂＝12：5：1重量比例配比(浸膏粉，微晶纤维素101，交联羧甲基纤维素纳)，取上述③制得的组分，加入上述比例的填充剂、崩解剂。混匀，采用干法制粒，压制成片，包薄膜衣，制成成品片剂，即得。

本发明中药复方制剂的制备方法，采用了水提取法并优选了煎煮次数、时间和加水量，并优选了醇沉的密度和乙醇浓度经行醇沉纯化，最大限度的提取有效成分并去除杂质，在减压低温条件下浓缩、干燥，同时对干燥方法及条件、制剂成型工艺的辅料、制粒方法及条件等经行考查、筛选，优选出适合于工业化的制备工艺。

本发明中药复方制剂可按常规方法制成各种口服制剂，包括片剂、颗粒剂、胶囊、合剂、散剂等。

本发明所述的健脾补肾方在治疗骨质疏松性骨折的医疗用途是通过发现健脾补肾方对骨质疏松性骨折动物模型的作用疗效而得出的。

动物实验发现，健脾补肾方均能显著促进去卵巢后骨质疏松性骨折小鼠在不同时期骨痂的愈合，包括在骨折早期0-7天可促进膜内成骨和软骨内成骨，断端附近可见大量肥大软骨细胞增生；而在骨折中后期，14-28天，软骨细胞凋亡，促进成骨细胞的大量增生，同时，不会抑制破骨细胞数量，以起到骨痂塑形重建的作用，使骨髓腔再通。健脾补肾方能明显提高骨痂的骨量和骨强度。健脾补肾方促进骨折断端肌肉和骨痂中β–catenin的表达。健脾补肾方增加骨折断端肌肉中肌源性干细胞的数量和促进其增值。健脾补肾方促进肌源性干细胞迁移至骨痂，从而刺激成骨，加速骨质疏松性骨折愈合。

本发明所述的健脾补肾方用于治疗骨质疏松性骨折时，以中药煎剂、农本方、颗粒剂等形式使用。

附图说明

以下附图中：saline—生理盐水；jpbs-健脾补肾；qgjn-强骨胶囊。骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁分离度(tb.sp)、骨密度(mean/densityoftv、mean/densityofbv)。

图1为去卵巢后3月模型组与假手术组血清雌二醇含量比较。

图2为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊各组干预骨质疏松性骨折28天后血清雌二醇含量比较。

图3去卵巢模型组与假手术组腰椎micro-ct三维重建。

图4去卵巢模型组与假手术组腰椎micro-ct参数情况。

图5为去卵巢模型组与假手术组胫骨micro-ct参数情况。

图6为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天骨折断端x-ray线。

图7为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天骨痂三维重建。

图8为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨痂micro-ct参数情况。

图9为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠28后胫骨骨折部位生物力学。

图10为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠28后骨折愈合部位受力分析。

图11为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨折部位he染色。

图12为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨折部位abh/og染色。

图13为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨折部位trap染色。

图14为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨折部位β-catenin染色。

图15为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7、14、28天胫骨骨折部位runx2染色。

图16为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7天腓肠肌pax7+brdu免疫荧光染色。

图17为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠14天腓肠肌pax7+brdu免疫荧光染色。

图18为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7天腓肠肌myod+brdu免疫荧光染色。

图19为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠14天腓肠肌myod+brdu免疫荧光。

图20为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠7天胫骨后肌相关标志基因表达。

图21为生理盐水、健脾补肾方及强骨胶囊干预小鼠14天胫骨后肌相关标志基因表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

按照重量份配比称取原料药，浸泡1h，煎煮1～3次，每次煎煮0.5～1.5h，一煎加水10～14倍，二、三煎加水量6～10倍，合并煎煮液，滤过，在60～70℃温度下，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.30的浸膏；

②上述①浸膏液中加入乙醇，至乙醇浓度为50％～80％，静置过夜，醇沉。滤过，滤液在60～70℃温度下回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.35～1.40的浓浸膏；

③上述②浓浸膏在70～80℃时减压干燥，粉碎成细粉，过60目筛，得药物组分的浸膏粉；

④按照：浸膏粉：填充剂：崩解剂＝12：5：1重量比例配比(浸膏粉，微晶纤维素101，交联羧甲基纤维素纳)，取上述③值得的组分，加入上述比例的填充剂、崩解剂。混匀，采用干法制粒，压制成片，包薄膜衣，制成成品片剂，即得。或按常规方法制成各种口服制剂，包括片剂、颗粒剂、胶囊、合剂、散剂等。

实施例1

原料药重量配比：党参6g，刺五加6g，骨碎补6g，淫羊藿6g，丹参6g，独活3g。

实施例2

原料药重量配比：党参30g，刺五加30g，骨碎补30g，淫羊藿30g，丹参15g，独活12g。

实施例3

原料药重量配比：党参5.5g，刺五加5.5g，骨碎补5.5g，淫羊藿5.5g，丹参4.5g，独活3g。

实施例4

原料药重量配比：党参15g，刺五加15g，骨碎补15g，淫羊藿15g，丹参12g，独活9g。

实施例5

原料药重量配比：党参5g，刺五加5g，骨碎补5g，淫羊藿5g，丹参4g，独活3g。

实施例6

原料药重量配比：党参12g，刺五加12g，骨碎补12g，淫羊藿12g，丹参9g，独活6g。

实施例7

原料药重量配比：党参12g，刺五加12g，骨碎补9g，淫羊藿9g，丹参12g，独活9g。

试验例

健脾补肾方对去卵巢骨质疏松性骨折小鼠的作用研究。

1材料与方法

1.1实验动物

由上海中医药大学动物房订购2月龄c57bl/6雌55只，spf级饲养至3月龄。所有动物在整个实验过程中均自由饮水和进食。许可证号：scxk(京)2012-0001。

1.2实验药物

健脾补肾方：由实施例1-7制得，随机选取；强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司)由龙华医院提供；10％水合氯醛注射液，批号：20081027，国药集团化学试剂有限公司；ultra-sensitiveestradiolria超敏雌二醇试剂盒(beckmancoulter，dsl-4800，immunotechs.r.o.，usa)

1.3实验器材

uct80microct(scancomedical,che)，discovery双能x线骨密度仪，cmisa-99b图像分析管理系统，le-80k超速离心机，leicatp1020组织脱水机，leicaeg1160型全自动石蜡包埋机，leicarm2135轮转式切片机，leicahistobath型hi1210摊片机，leicahistoplatehi1220型烘片机，leicaemlbslr显微镜及照相系统，olympus全组织扫描仪，olympusvs120-sl，eppendorf5415d高速离心机

1.4动物模型建立及分组

在雌鼠3月龄时，10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，剔除小鼠背部正中平两侧髂嵴水平处鼠毛，碘伏消毒，无菌条件下，俯卧位经腰背侧正中切开皮肤约2-3cm切口进入，移至一侧肋弓下第3-4腰椎处，钝性分开腰部筋膜、肌肉，切开腹膜，分离暴露卵巢，结扎输卵管和周围血管后，摘除卵巢。然后按相同的方法摘除对侧卵巢。在确保摘除双侧卵巢后，逐层缝合腹膜至皮肤，金霉素眼膏涂抹伤口。随机挑取5只作为模型组，5只假手术组不摘除卵巢，仅摘除双侧卵巢旁边少许脂肪组织。其余实验组小鼠均于3个月后再复合胫骨骨折造模。

去卵巢后3月，对剩余45只小鼠剪脚趾进行编号1-45#，称量、记录体重，平均体重为(31.9±4.5)g，运用spass18软件进行随机区组分组，分为三个组别：生理盐水组、健脾补肾组、强骨胶囊组。在复合左侧胫骨骨折术后第二天，进行灌胃治疗，三组分别给予生理盐水、健脾补肾方、强骨胶囊0.2ml/天，每组三个时间点7、14、28天，分别灌胃6、12、24次。每组每个时间点各5只小鼠。每组到相应时间点分别处死小鼠，取材，进行指标检测。

1.5检测指标

1.5.1影像学检查：左侧胫骨骨折断端x-ray检查，左侧胫骨骨痂micro-ct扫描分析。

1.5.2骨组织形态计量学分析：在影像学检测之后，用14％edta对左侧胫骨进行脱钙处理，20天左右待钙质完全脱掉后，leicatp1020组织脱水机行梯度脱水、浸蜡、包埋，切片机沿胫骨矢状面，切成5mm厚切片，晾干、烤片，进行后期病理组织形态学分析(如he、abh/og、trap染色、免疫组化、免疫荧光染色等)。

1.5.3肌肉组织切片分析：取出固定的腓肠肌经pbs洗涤、浸泡1-2小时，leicatp1020组织脱水机行梯度脱水、浸蜡、包埋，切片机沿肌肉冠状面，切成5mm厚切片，晾干、烤片，进行后期病理组织形态学分析(如he、免疫荧光染色等)。

1.5.3生物力学指标检测：通过有限元分析软件对micro-ct三维重建的28d骨痂进行力学分析，测量参数包括结构刚度、破裂载荷、横断面积及弹性模量，由软件计算得出。

1.6统计分析：计数指标以均数±标准差表示。借助spss18.0软件包，多样本之间进行one-wayanova分析，两两样本之间进行t检验。检验水准取双侧α＝0.05。

2结果

2.1健脾补肾方对去卵巢后骨质疏松性骨折小鼠血清激素水平的影响：

图1血清雌二醇检测显示去卵巢后小鼠e2含量低于假手术组。

图2说明28天时健脾补肾组、强骨胶囊组血清e2水平与生理盐水组有显著性差异，说明健脾补肾方和强骨胶囊在一定疗程后可改善去卵巢后雌激素水平，从而减缓高转换型骨质疏松症的进展。

2.2健脾补肾方对去卵巢后骨质疏松性骨折小鼠不同时间段骨痂愈合的影响：

图3micro-ct三维重建可见去卵巢后腰椎骨小梁较假手术组明显稀疏，图4显示去卵巢后3月，可导致小鼠腰椎bmd(tv)显著性降低(p＜0.01)，bv/tv，tb.th，tb.n，tb.sp，bmd(bv)也有明显统计学意义(p＜0.05)；图5胫骨bv/tv，tb.th，tb.n，tb.sp，bmd(tv)均显著性降低(p＜0.01)，bmd(bv)无差异。根据腰椎、胫骨micro-ct以及血清雌二醇结果，说明骨质疏松性骨折小鼠模型建立成功。

图6x-ray显示7天时健脾补肾组、强骨胶囊组小鼠胫骨骨折线较生理盐水组模糊，14天时健脾补肾和强骨胶囊组骨折线较其生理盐水组更加模糊，两组均可见大量骨痂影，跨过骨折线，生理盐水组骨折线较清晰，且骨痂影较少；28天时健脾补肾和强骨胶囊组骨折线消失，骨皮质连续，生理盐水组仍可看到模糊骨折线存在，少量骨痂影。

图7micro-ct三维重建可见健脾补肾和强骨胶囊组7、14、28天骨痂的形态与密度均优于生理盐水组，其中以健脾补肾组最佳，图8数据分析进一步说明健脾补肾组在早期(7、14天)促进小鼠骨折断端骨痂的形成，其骨小梁体积与骨痂体积比(bv/tv)、骨痂骨密度(bmd)、连接密度(conn.d)等指标均优于生理盐水组，尽管28天的数据与生理盐水组无明显差异，考虑各药物干预后骨折断端可能在21天时已基本愈合，而生理盐水组28天时基本愈合，仍有部分硬骨痂存在，因而两组未见明显差异。但图9、10生物力学——有限元分析结果，显示健脾补肾组和强骨胶囊组骨折断段愈合后的结构刚度、弹性模量结果高于生理盐水组，也说明健脾补肾方及强骨胶囊组骨痂愈合时间及质量均优于生理盐水组。

2.3健脾补肾方对老年性骨质疏松性骨折小鼠软骨及成骨细胞活性的影响：

图11he染色及图12abh/og染色可见健脾补肾组、强骨胶囊组7天时骨折断端大量软骨增生，而生理盐水组未见明显软骨痂形成；14天时健脾补肾组软骨细胞凋亡，成骨细胞开始增加，而生理盐水组在14天时才形成少量软骨痂，28天健脾补肾组、强骨胶囊组骨折断端基本愈合，骨皮质连续，骨髓腔已通，生理盐水组仍可见硬骨痂存在，骨髓腔尚未完全再通，其愈合较中药组延迟一周。说明中药组，尤其是健脾补肾组在不同时间段可显著上调软骨和成骨细胞的活性，促进骨质疏松性骨折的膜内成骨和软骨内成骨，以改善骨质疏松性骨折延迟愈合和不愈合的情况。

2.3健脾补肾方对老年性骨质疏松性骨折小鼠破骨细胞活性的影响：

图13trap染色可见各组7、14、28天骨折断端的骨痂中均有大量破骨细胞存在，而健脾补肾组在7天时仅有少量破骨细胞形成，14、28天时破骨细胞开始增加。

图13说明健脾补肾组早期可抑制破骨细胞的增生，仅有少量以吸收坏死骨组织，而14-28天软骨细胞开始凋亡，成骨细胞增加，并需要一定数量破骨细胞参与凋亡软骨细胞的吸收与骨痂重建，以使骨髓腔再通，形成正常骨骼。因此，健脾补肾方具有平衡成骨细胞-破骨细胞藕合关系，维持组织、器官的正常功能，即阴阳平衡的作用。

2.4健脾补肾方促进老年性骨质疏松性骨折愈合的分子机制研究：

图14骨痂β–catenin免疫组化染色可见，各中药组治疗7、14、28天时骨痂中均有明显的β–catenin阳性表达细胞，生理盐水组仅有少量表达，其中以健脾补肾组最为明显，表明健脾补肾方可有效激活骨痂β–catenin信号通路在核内及胞质内表达。图15骨痂runx2免疫组化染色可见，各中药组治疗7、14、28天时骨痂中均有明显的runx2阳性表达细胞，生理盐水组仅有少量表达，其中以健脾补肾组最为明显，表明健脾补肾方可有效激活骨痂runx2信号通路在核内表达。

图16、17骨折断端肌肉pax7和brdu双荧光免疫组化染色可见，与生理盐水组相比，健脾补肾组在治疗7天时骨折断端肌肉中有较多pax7和brdu双表达的细胞，表明健脾补肾方可一定程度促进骨折断端肌肉中肌源性干细胞的增殖活性。

图18、19骨折断端肌肉myod和brdu双荧光免疫组化染色可见，与生理盐水组比较，健脾补肾组在治疗7、14天时肌肉中myod和brdu双表达的细胞明显增加，健脾补肾方可促进成肌细胞增殖活性，以利于肌肉损伤的修复。

图20、21骨折后7、14天分离骨折断段肌肉(胫骨后肌)进行成骨分化基因rt-pcr检测，与生理盐水相比，健脾补肾组7天时可明显促进alp、runx2、axin2、pax7、en1及bmp2、oc的表达；14天时可促进axin2、opn、pax7的表达。强骨胶囊7天时可明显促进alp、runx2、axin2、pax7、en1及oc的表达；14天时可促进alp、runx2、opn、bmp2、oc、pax7、axin2。说明健脾补肾方在早期7天可一定程度促进肌源性细胞的成骨分化潜能，参与骨折修复。

综合以上各实验结果，得出健脾补肾方可提高去卵巢后雌激素水平，改善高转换型骨量丢失造成的骨质疏松；同时介导β–catenin信号通路促进骨折部位软骨、成骨细胞活性，促使膜内和软骨内成骨；平衡破骨细胞活性，参与骨重建；并可能通过促进骨折附近骨骼肌中肌源性干细胞的增殖，促进肌源性干细胞一定程度上向成骨细胞特异性分化，参与骨折的修复。