本发明涉及亚麻酸与抗癌药物的前药、前药制备方法、前药的低密度脂蛋白组合物、组合物制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，属于抗癌药物的制备及应用领域。
背景技术：
癌症(cancer)是影响中国居民健康的主要慢性病之一，已成为中国居民的第一死因。并且，随着人口老龄化等因素的加剧，肿瘤的发病及死亡率仍然呈上升趋势。根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，中国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人，2030年将上升至500万人和350万人。
化疗是肿瘤治疗的最常用方式，但由于化疗药物对肿瘤组织不具有靶向选择性，会出现明显的全身毒副作用。因此提高化疗药物的治疗效果，减轻化疗所引起的毒副作用是当今肿瘤研究中亟待解决的问题。
亚麻酸是一种n-3类多不饱和脂肪酸，和体内营养物质的代谢有密切关系，能够减少心脑血管发生的风险，且具有一定的抗肿瘤活性。
低密度脂蛋白是体内胆固醇运输的主要载体，肿瘤细胞由于快速增值需要大量的胆固醇来构建细胞膜，因此多数肿瘤细胞表面低密度脂蛋白受体高表达，药物的低密度脂蛋白组合物可以实现对肿瘤的靶向治疗。
因此，将亚麻酸与抗癌药物共价连接形成共价前药，并通过一定的制剂制备手段包载于低密度脂蛋白中形成组合物，有利于提高抗癌药物治疗效果，减轻毒副作用，降低癌症的治疗成本和风险。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种亚麻酸与抗癌药物的前药及其制备方法，该前药通过亚麻酸上的羧基与抗癌药物的羟基、氨基等基团在一定的催化条件下反应得到，且该前药能够降低抗癌药物的毒副作用。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种前药的低密度脂蛋白组合物及其制备方法，该组合物可以靶向作用于肿瘤组织，提高肿瘤治疗效果，减轻化疗药物的毒副作用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种亚麻酸与抗癌药物的前药，该前药通过亚麻酸上的羧基与抗癌药物的羟基、氨基等基团在一定的催化条件下反应得到。亚麻酸包括α-亚麻酸或γ-亚麻酸；抗癌药物包括：紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、多柔比星、顺铂、喜树碱、10-羟基喜树碱、9-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱sn-38、拓扑替康、伊立替康、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春西汀、吉西他滨、多肽类抗肿瘤药物(如戈舍瑞林、曲普瑞林)、氨基喹唑啉类抗肿瘤药物(如吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼)、或肿瘤坏死因子等，优选紫杉醇和多西紫杉醇。
本发明进一步公布了亚麻酸与抗癌药物的前药的制备方法，该方法的步骤如下：
(1)在氮气保护下，将抗肿瘤药物溶解于溶剂中，加入催化剂和脱水剂，搅拌下，再加入亚麻酸，室温搅拌反应；
(2)取上述反应所得物料，加入乙醚，过滤除沉淀，滤液依次用5％盐酸、水及氯化钠饱和水溶液各洗三遍，收集有机相，使用旋转蒸发仪旋蒸干燥，通过硅胶色谱柱分离得到前药。
其中，上述方法中溶剂是指二氯甲烷、氯仿、n，n-二甲基甲酰胺或二氧六环中的一种或其混合溶液；催化剂为二甲氨基吡啶；脱水剂是指二环己基碳二酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺中的一种或其混合物，反应时间为2-24小时。抗肿瘤药物：亚麻酸的摩尔比为1：0.1-10；催化剂与亚麻酸的摩尔比为1∶0.1-10，优选1:1；脱水剂与亚麻酸摩尔比为1∶0.1-10，优选1:2。
优选的在氮气保护下，将紫杉醇溶解于一定量二氯甲烷中，加入催化剂二甲氨基吡啶和脱水剂二环己基碳二酰亚胺，搅拌下，再加入α-亚麻酸，室温搅拌反应。取上述反应所得物料，加入乙醚，过滤除去沉淀，滤液依次用5％盐酸、水和氯化钠饱和的水溶液各洗三遍，收集有机相，使用旋转蒸发仪旋蒸干燥，通过硅胶色谱柱分离得到前药。
本发明进一步公布了前药的低密度脂蛋白组合物，该组合物可通过乳化超声法或高压乳匀法中的任意一种制备。其中乳化超声法步骤如下：
(1)称取适量低密度脂蛋白亲脂成分及前体药物，加入少量有机溶剂助溶，加热至50-80℃熔融，作为油相备用。
(2)称取适量低密度脂蛋白功能多肽和磷脂及辅助的两亲性材料，加入适量注射用生理盐水，加热至50-80℃，作为水相备用。
(3)在400-800r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5-20min，制备成o/w型初乳。
(4)将制备好的初乳迅速用探头式超声波细胞粉碎仪超声分散，功率80-300w，时间3-10min。
(5)冰水浴冷却5-30min使制剂固化，过0.22μm微孔滤膜得所需组合物。
其中高压乳匀法步骤如下：
(1)称取适量低密度脂蛋白亲脂成分及前体药物，加入少量有机溶剂助溶，加热至50-80℃熔融，作为油相备用。
(2)称取适量低密度脂蛋白功能多肽和磷脂及辅助的两亲性材料，加入适量注射用生理盐水，加热至50-80℃，作为水相备用。
(3)在400-800r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5-20min，制备成o/w型初乳。
(4)将制备好的初乳使用高压均质机分散。
(5)冰水浴冷却5-30min使制剂固化，过0.22μm微孔滤膜得所需组合物。
上述制剂制备中两亲性材料选自：天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂、磷脂的聚乙二醇共轭物、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、泊洛沙姆188、聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯或它们的混合物，优选天然磷脂和聚乙二醇15羟基硬脂酸酯的混合物；有机溶剂选自：乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、n，n-二甲基乙酰胺、苯甲基苄酯、油酸乙酯、苯甲醇中的一种或多种的混合物，优选乙醇。
其中各组分重量百分比如下：药物重量百分比为1％-15％，优选3％-10％；低密度脂蛋白功能多肽重量百分比为5％-25％，优选8％-20％；磷脂重量百分比为8％-24％，优选18％-22％；胆固醇成分和甘油三酯等成分的重量百分比为30％-75％，优选50％-68％。
上述方法制备的前药的低密度脂蛋白组合物粒径在10-100nm，分散性良好，可以直接注射给药，或冻干后制成冻干制剂，使用时可用5％葡萄糖溶液、生理盐水、注射用水或它们的混合物将其分散，恢复成前药的低密度脂蛋白组合物后注射给药，或根据需要在前药的低密度脂蛋白组合物中加入医药学上可接受的辅料，如辅助乳化剂、稳定剂、ph值调节剂和抗氧剂等，可以按药剂学的常规方法制备成胶囊剂、口服液体制剂或外用制剂等。
上述前药及前药的低密度脂蛋白组合物可以应用于肿瘤治疗中，其中肿瘤选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌或脑胶质瘤的一种或多种，优选脑胶质瘤和肝癌。
在体内实验中，首先建立了脑胶质瘤裸鼠腋下移植瘤模型，通过给予不同的制剂后发现，与紫杉醇上市制剂泰素相比，亚麻酸与抗癌药物的前药有相当的抗肿瘤效果，但重要的是，亚麻酸与抗癌药物的前药体内毒副作用显著降低；与泰素相比，前药的低密度脂蛋白组合物具有更强的肿瘤抑制效果，且体内毒副作用大大降低。其中紫杉醇、亚麻酸与抗癌药物的前药、前药的低密度脂蛋白组合物肿瘤抑制效果分别达到51.2％、50.0％和72.1％。
本发明所述的亚麻酸与抗癌药物前药及前药的低密度组合物具有以下优点：
(1)亚麻酸与抗癌药物的前药能够减小药物在动物体内的毒副作用，提高抗癌药物在纳米制剂中的包封率。
(2)前药及前药的低密度组合物体内具有更好的肿瘤抑制效果，且毒副作用显著降低。
(3)低密度脂蛋白各种材料生物相容性较好、成本低，且制备工艺简单，便于工业化生产。
附图说明：
图1为α-亚麻酸与紫杉醇前药的合成图；
图2为α-亚麻酸与紫杉醇前药的质谱图；
图3为α-亚麻酸与紫杉醇前药的核磁共振氢谱图；
图4为前药的低密度脂蛋白组合物用动态光散射法测得的粒径分布图；
图5为前药的低密度脂蛋白组合物的透射电镜图；
图6为紫杉醇及α-亚麻酸与紫杉醇前药对荷u87脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长曲线图；
图7为紫杉醇及α-亚麻酸与紫杉醇前药对荷u87脑胶质瘤裸鼠体重变化曲线图。
图8为紫杉醇及前药的低密度脂蛋白组合物对荷u87脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长曲线图；
图9为α-亚麻酸与紫杉醇前药及前药的低密度脂蛋白组合物对荷u87脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长曲线图；
图10为前药乳剂组合物及前药的低密度脂蛋白组合物对荷u87脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长曲线图；
图11为紫杉醇及前药的低密度脂蛋白组合物对荷u87脑胶质瘤裸鼠体重变化曲线图。
图12为不同制剂对荷u87脑胶质瘤裸鼠的离体肿瘤图片。
图13为肿瘤切片tunel凋亡检测图。
注：附图中control为生理盐水对照，
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1α-亚麻酸与紫杉醇前药的合成
紫杉醇95mg在惰性环境中加入到有2.5ml二氯甲烷的圆底烧瓶中，再加入二甲氨基吡啶13.6mg，二环己基碳二酰亚胺46mg，α-亚麻酸31mg，常温下搅拌反应两小时；用乙醚稀释，5％的盐酸，水，饱和氯化钠水溶液洗涤有机相；有机相用硫酸铵干燥，旋蒸浓缩，过硅胶色谱柱纯化得到产品；分别以质谱和核磁共振氢谱对产物进行表征。
其中图1为合成路线图。质谱(图2)中1136和1152分别为[pala+na+]和[pala+k+]的分子离子峰；核磁共振氢谱(图3)中分别为原料紫杉醇(ptx)、α-亚麻酸(ala)和产物α-亚麻酸与紫杉醇前药(pala)核磁共振氢谱图；与紫杉醇相比，α-亚麻酸与紫杉醇前药化学位移在1ppm出现了α-亚麻酸上甲基相应的特征峰，在5.35ppm出现了α-亚麻酸上双键的特征峰，这表明成功合成了较纯的α-亚麻酸与紫杉醇前药。
实施例2α-亚麻酸与多西紫杉醇前药的合成
多西紫杉醇90mg在惰性环境中加入到有2.5ml二氯甲烷的圆底烧瓶中，再加入二甲氨基吡啶13.6mg，二环己基碳二酰亚胺46mg，α-亚麻酸31mg，常温下搅拌反应两小时；用5.0ml的乙醚稀释，5％的盐酸，水，饱和氯化钠水溶液洗涤有机相；有机相用硫酸铵干燥，旋蒸浓缩，过硅胶色谱柱纯化得到产品。最终得到α-亚麻酸与多西紫杉醇前药质量为102mg，产率约为85％。
实施例3α-亚麻酸与阿霉素前药的合成
阿霉素62mg在惰性环境中加入到有2.5ml二氯甲烷的圆底烧瓶中，再加入二甲氨基吡啶13.6mg，二环己基碳二酰亚胺46mg，α-亚麻酸31mg，常温下搅拌反应两小时；用5.0ml乙醚稀释，5％的盐酸，水，饱和氯化钠水溶液洗涤有机相；有机相用硫酸铵干燥，旋蒸浓缩，过硅胶色谱柱纯化得到产品。最终得到α-亚麻酸与阿霉素前药质量为74mg，产率约为80％。
实施例4α-亚麻酸与10-羟基喜树碱前药的合成
10-羟基喜树碱40mg在惰性环境中加入到有2.5ml二氯甲烷的圆底烧瓶中，再加入二甲氨基吡啶13.6mg，二环己基碳二酰亚胺46mg，α-亚麻酸31mg，常温下搅拌反应两小时；用5.0ml乙醚稀释，5％的盐酸，水，饱和氯化钠水溶液洗涤有机相；有机相用硫酸铵干燥，旋蒸浓缩，过硅胶色谱柱纯化得到产品。最终得到α-亚麻酸与10-羟基喜树碱前药质量为59mg，产率约为83％。
实施例5前药的乳剂组合物的制备
称取适量胆固醇油酸酯35mg、三油酸甘油酯25mg、非酯化胆固醇12mg，前药6mg，加入少量乙醇助溶，加热至60±2℃熔融，作为油相备用。称取适量大豆磷脂35mg，聚乙二醇15羟基硬脂酸酯45mg，加注射用生理盐水5ml，加热至60±2℃，作为水相备用。在400r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5min，制备成o/w型初乳。将制备好的初乳迅速用探头式超声波细胞粉碎仪超声分散，功率100w，时间5min，超声1s间歇1s。冰浴10min使制剂固化，过0.22um微孔滤膜得所需制剂。
通过动态光散射测得前药的乳剂组合物粒径为51.80nm，pdi为0.102，通过高效液相色谱测得药物包封率为92.36％。
实施例6前药的乳剂组合物的制备
称取适量胆固醇油酸酯35mg、三油酸甘油酯25mg、非酯化胆固醇12mg，前药6mg，加入少量乙醇助溶，加热至60±2℃熔融，作为油相备用。称取适量大豆磷脂35mg，聚乙二醇15羟基硬脂酸酯45mg，加注射用生理盐水5ml，加热至60±2℃，作为水相备用。在400r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5min，制备成o/w型初乳。将制备好的初乳迅速用高压均质机分散，压力为200mpa,循环10次。冰浴10min使制剂固化，过0.22um微孔滤膜得所需制剂。
通过动态光散射测得前药的乳剂组合物粒径为45.12nm，pdi为0.100，通过高效液相色谱测得药物包封率为96.09％。
实施例7前药的低密度脂蛋白组合物的制备
称取适量胆固醇油酸酯35mg、三油酸甘油酯25mg、非酯化胆固醇12mg，前药6mg，加入少量乙醇助溶，加热至60±2℃熔融，作为油相备用。称取适量大豆磷脂35mg，聚乙二醇15羟基硬脂酸酯45mg，功能多肽15mg，加注射用生理盐水5ml，加热至60±2℃，作为水相备用。在400r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5min，制备成o/w型初乳。将制备好的初乳迅速用探头式超声波细胞粉碎仪超声分散，功率100w，时间5min，超声1s间歇1s。冰浴10min使制剂固化，过0.22um微孔滤膜得所需制剂。
通过动态光散射测得前药低密度脂蛋白组合物粒径为66.80nm，pdi为0.163(图4)，通过高效液相色谱测得药物包封率为95.39％。而且可通过透射电镜可以观察到所制备的组合物为球形(图5)。
实施例8前药的低密度脂蛋白组合物的制备
称取适量胆固醇油酸酯35mg、三油酸甘油酯30mg、非酯化胆固醇15mg，前药10mg，加入少量乙醇助溶，加热至60±2℃熔融，作为油相备用。称取适量大豆磷脂35mg，聚乙二醇15羟基硬脂酸酯35mg，功能多肽13mg，加注射用生理盐水5ml，加热至60±2℃，作为水相备用。在400r/min的磁力搅拌下，将水相趁热滴加到有机溶剂挥尽的油相中，滴加完毕后，搅拌5min，制备成o/w型初乳。将制备好的初乳迅速使用高压均质机分散，压力为200mpa,循环10次。冰浴10min使制剂固化，过0.22um微孔滤膜得所需制剂。
通过动态光散射测得前药低密度脂蛋白组合物粒径在45.32nm，pdi为0.113，通过高效液相色谱测得药物包封率为95.18％。
实施例9紫杉醇及α-亚麻酸与紫杉醇前药体内药效
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，紫杉醇上市制剂泰素
由实验结果(图6)可知，与对照组相比，泰素和α-亚麻酸与紫杉醇前药的平均肿瘤抑制率分别为51.2％和50.0％，两者之间无显著性差异。
实施例10紫杉醇及α-亚麻酸与紫杉醇前药体内安全性评价
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，紫杉醇上市制剂泰素
由实验结果(图7)可知，与对照组相比，泰素在给药后第二天体重有很明显的减轻，且在实验终点体重低于对照组；α-亚麻酸与紫杉醇前药给药后体重持续增加，实验终点时体重比对照组更重；这说明α-亚麻酸与紫杉醇前药比紫杉醇在体内给药时更安全。
实施例11紫杉醇及前药的低密度脂蛋白组合物体内药效
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，紫杉醇上市制剂泰素
由实验结果(图8)可知，与对照组相比，泰素具有一定的肿瘤生长抑制效果，在实验终点，肿瘤抑制率为51.2％；前药的低密度脂蛋白组合物肿瘤抑制效果明显强于泰素，其实验终点的肿瘤抑制率为72.1％。
实施例12α-亚麻酸与紫杉醇前药及前药的低密度脂蛋白组合物体内药效
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，α-亚麻酸与紫杉醇前药(pala)，前药的低密度脂蛋白组合物(pala-sldl，实施例8方法制备)，每三天给药一次，共三次。每天测量肿瘤长径和短径，绘制肿瘤生长曲线(相对瘤体积-时间曲线)。
由实验结果(图9)可知，与对照组相比，α-亚麻酸与紫杉醇前药具有一定的肿瘤生长抑制效果，在实验终点，肿瘤抑制率为50.0％；前药的低密度脂蛋白组合物肿瘤抑制效果明显强于α-亚麻酸与紫杉醇前药，其实验终点的肿瘤抑制率为72.1％。
实施例13前药的乳剂组合物及前药的低密度脂蛋白组合物体内药效
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，前药的乳剂组合物(pala-me，实施例5方法制备)，前药的低密度脂蛋白组合物(pala-sldl，实施例8方法制备)，每三天给药一次，共三次。每天测量肿瘤长径和短径，绘制肿瘤生长曲线(相对瘤体积-时间曲线)。
由实验结果(图10)可知，与对照组相比，前药的乳剂组合物具有一定的肿瘤生长抑制效果，在实验终点，肿瘤抑制率为58.8％；前药的低密度脂蛋白组合物肿瘤抑制效果明显强于前药的乳剂组合物，其实验终点的肿瘤抑制率为72.1％。
实施例14紫杉醇及前药的低密度脂蛋白组合物体内安全性评价
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，紫杉醇上市制剂泰素
由实验结果(图11)可知，与对照组相比，泰素在给药后第二天体重有很明显的减轻，且在实验终点体重低于对照组，提示泰素的毒性作用；前药的低密度脂蛋白组合物给药后体重持续增加，实验终点时体重比对照组更重；这说明前药低密度脂蛋白组合物比紫杉醇更安全。
实施例15不同制剂对荷u87脑胶质瘤裸鼠的离体肿瘤情况
建立腋下u87脑胶质瘤裸鼠模型，在肿瘤体积达到100mm3分别静脉注射生理盐水(control)，紫杉醇上市制剂泰素
实验结果(图12)可知，对照组肿瘤在各组中是最大的；泰素和α-亚麻酸与紫杉醇前药具有相当的肿瘤抑制效果，离体肿瘤小于对照组；前药的乳剂组合物及前药的低密度脂蛋白组合物离体肿瘤小于泰素和α-亚麻酸与紫杉醇前药组，且前药的低密度脂蛋白组合物离体肿瘤最小，说明前药的低密度脂蛋白组合物具有最好的体内抗肿瘤药效。
实施例16肿瘤组织的的tunel凋亡分析
剥离出的肿瘤制成冰冻切片，使用tunel凋亡检测试剂盒对不同给药组的凋亡情况进行评价，最终通过共聚焦显微镜观察。
实验结果(图13)可知，与对照组相比，泰素