一种氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用的制作方法

本技术涉及生物，尤其是涉及一种氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。

背景技术：

1、氧化低密度脂蛋白脂蛋白是低密度脂蛋白(ldl)在体内发生氧化修饰而形成的。低密度脂蛋白上的多不饱和脂肪酸氧化后形成丙二醛，丙二醛氧化修饰载脂蛋白b上的赖氨酸残基，当赖氨酸修饰量超过15％后将形成新的抗原表位，即形成氧化低密度脂蛋白。

2、氧化低密度脂蛋白不能被低密度脂蛋白受体识别，此时吞噬细胞将大量、快速、无限制地吞噬氧化低密度脂蛋白。氧化低密度脂蛋白能抵抗细胞内溶酶体酶和组织蛋白酶对它的降解，导致胆固醇在细胞内大量积聚，最终形成泡沫细胞。泡沫细胞是导致动脉粥样硬化的关键因素，而氧化低密度脂蛋白是导致动脉粥样硬化的关键性蛋白。

3、国内外对氧化低密度脂蛋白的临床意义已有比较深入的研究，对其在动脉粥样硬化上的致病性上一致认可。但在临床的检测上面临着重大的检测难题，主要原因是氧化低密度脂蛋白的交叉反应物质多，难以获得特异性好的单克隆抗体，且交叉反应物质的浓度高于氧化低密度脂蛋白的浓度，因此，亟需一种特异性识别血样本中的氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。本技术通过获得分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株jd03#5-21和杂交瘤细胞株jd02#2-2)，进而获得针对氧化低密度脂蛋白不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，可以通过配对检测样本中的氧化低密度脂蛋白含量，应用于检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株包括保藏编号为gdmcc no:63553的杂交瘤细胞株jd03#5-21和保藏编号为gdmcc no:63554的杂交瘤细胞株jd02#2-2；所述杂交瘤细胞株jd03#5-21和杂交瘤细胞株jd02#2-2均于2023年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

4、第二方面，本技术提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株产生，所述单克隆抗体特异性识别氧化低密度脂蛋白。

5、本技术筛选出的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别血样本中的氧化低密度脂蛋白，该单克隆抗体特异性、亲和力均较高，可以通过配对检测血样本中的氧化低密度脂蛋白含量，具有检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。

6、经过单克隆抗体效价检测的试验，杂交瘤细胞株jd03#5-21和杂交瘤细胞株jd02#2-2单克隆抗体效价分别为1：256000和1:128000，效价高。

7、作为本技术所述单克隆抗体的优选实施方式，所述氧化低密度脂蛋白的氨基酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

8、经过单克隆抗体配对实验验证，杂交瘤细胞株jd03#5-21分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株jd02#2-2分泌的单克隆抗体反应性好，与交叉反应物质基本没有反应。

9、作为本技术所述单克隆抗体的优选实施方式，所述杂交瘤细胞株jd03#5-21分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如seq id no:1的氧化低密度脂蛋白；所述杂交瘤细胞株jd02#2-2分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如seq id no:2的氧化低密度脂蛋白。

10、第三方面，本技术还提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，将上述杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经纯化获得单克隆抗体。

11、更优选地，上述杂交瘤细胞株的筛选方法，包括以下步骤：

12、1)氧化低密度脂蛋白片段准备：通过蛋白表达获得2段低密度脂蛋白片段，氨基酸序列分别为seq id no:1和seq id no:2，再用丙二醛在37℃条件下处理2小时得到氧化低密度脂蛋白片段。

13、2)用氧化低密度脂蛋白片段免疫小鼠，检测小鼠血清效价；

14、3)检测小鼠血清效价达到1:10000后用氧化低密度脂蛋白片段腹腔加强免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，克隆筛选出单克隆抗体的杂交瘤细胞行扩大再培养和保存。

15、更优选地，所述小鼠骨髓瘤细胞为sp2/0小鼠骨髓瘤细胞。

16、更优选地，上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

17、1)向balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡，腹腔接种上述杂交瘤细胞株，采集腹水上清备用；

18、2)将采集的腹水用微孔滤膜过滤溶液，加入硫酸铵，搅拌均匀后，静置，收集沉淀，并用pbs溶液重溶沉淀；将得到的粗纯抗体上样到protein a-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用甘氨酸-盐酸溶液洗脱抗体，得到单克隆抗体。

19、第四方面，本技术提供了上述杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在检测氧化低密度脂蛋白中的应用。

20、第五方面，本技术提供了上述单克隆抗体在制备氧化低密度脂蛋白体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。

21、第六方面，本技术提供了一种免疫检测试剂，所述免疫检测试剂包括保藏编号为gdmcc no:63553的杂交瘤细胞株jd03#5-21和保藏编号为gdmcc no:63554的杂交瘤细胞株jd02#2-2分泌的单克隆抗体。

22、第七方面，本技术提供了一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，所述检测试剂盒包括保藏编号为gdmcc no:63553的杂交瘤细胞株jd03#5-21和保藏编号为gdmcc no:63554的杂交瘤细胞株jd02#2-2分泌的单克隆抗体。

23、作为本技术所述氧化低密度脂蛋白检测试剂盒的优选实施方式，所述检测试剂盒还包括标准品、检测抗体和化学发光底物。

24、第八方面，本技术提供了上述杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在制备检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。

25、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

26、本技术提供了一种氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用，本技术通过获得分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株jd03#5-21和杂交瘤细胞株jd02#2-2)，获得针对氧化低密度脂蛋白不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，经过单克隆抗体配对实验验证，杂交瘤细胞株jd03#5-21分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株jd02#2-2分泌的单克隆抗体反应性好，与交叉反应物质基本没有反应。并且，本技术制备的单克隆抗体可以通过配对检测样本中的氧化低密度脂蛋白含量，应用于检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。