本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种异种脱细胞真皮基质的制备方法。
背景技术：
烧伤、创伤、上皮癌切除及皮肤疾病等因素造成的皮肤缺损常遗留瘢痕增生和挛缩畸形，严重影响外观和功能。目前，用于修复创面的修复材料除了自体皮、皮瓣外，主要有异体皮、异种皮以及各种人工合成的创面覆盖物。在治疗大面积烧伤患者时，患者自体皮源有限，就需要应用这些皮肤替代物；异体皮来源有限，并有传染疾病的风险，且受到伦理学的制约；人工合成材料技术尚不成熟，抗感染能力较差，且价格昂贵。与之相比，异种皮经过脱细胞变性处理后，抗原性降低，来源广泛、价格低廉，且保存了真皮组织中绝大部分的有效组织成分和框架结构，最大限度地模拟了人体皮肤的组织结构，可更好地诱导宿主细胞的生长和皮肤胶原的重建。
目前，异种脱细胞真皮基质的制备方法主要有：(1)反复冻融法：通过对新鲜皮肤进行3次以上的反复冻融；(2)胰酶消化法：通过外源性蛋白酶对真皮中的细胞进行消化；(3)磷酸盐缓冲液浸泡法：通过对真皮内的内源性酶的激活，将皮肤中的细胞成分进行有效的清除；(4)DispaseII-Triton法：将真皮首先采用DispaseII进行处理，然后再使用TritonX-100进行处理；(5)高渗盐-SDS法：将真皮首先采用高渗盐进行处理，然后再采用破膜剂十二烷幕硫酸钠(SDS)将真皮中的细胞成分彻底的脱除；(6)高渗盐-NaOH消蚀法：首先利用高渗盐将表皮去除，然后再通过NaOH的吸水作用，使细胞发生脱水死亡而将真皮中的细胞成分彻底的去除。虽然现有的异种脱细胞真皮基质的制备已经比较成熟，但是在其制备和应用中还存在一些问题，如：细胞成分去除不彻底，抗原性高，组织相容性差，易导致植皮的失败；对基底膜结构破坏性较大，不利于上皮细胞的粘贴与生长；制备过程复杂，处理时间过长；制备成本高等。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种处理周期短、对真皮细胞外基质结构破坏性小的异种脱细胞真皮基质的制备方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，去脂杀菌；
2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤3～5次；
3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质放入0.5％的TritonX-100溶液中，室温下超声3～7min后再摇床震荡5～6h，再次超声3～7min后摇床震荡3～4h，取出真皮基质，放入无菌PBS溶液中摇床震荡1～2h，重复TritonX-100溶液超声震荡-超声震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，取出真皮基质，再用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗3～7min，摇床振荡2～3h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡2～3h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；
4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，用无菌PBS溶液洗涤3～5次；
5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照消毒灭菌，即得成品。
优选地，所述无菌PBS溶液是由NaCl8.00g+KCl0.20g+KH2PO40.20g+Na2HPO41.56g溶解于1000mL的容量瓶中并定容得到的。
优选地，所述步骤1)中切取的断层皮片的厚度为0.3～0.5mm。
优选地，所述步骤2)中浸泡时间为22～24h。
优选地，所述步骤4)中孔径为0.1～1.3mm，孔间距为0.5～5mm。
优选地，所述步骤5)中辐照时间为10～12h。
本发明有益效果：本发明提供的异种脱细胞真皮基质的制备方法，对于细胞成分去除干净，抗原性低，保留了真皮胶原结构，对组织无明显刺激性，组织相容性良好，而且带有微孔结构有利于引流创面渗液，促进血管再生，提高皮片成活率，减少瘢痕形成，具有良好的技术效果，且整个制备过程时间仅60h左右，处理时间短，处理成本低，具有良好的社会效益和经济效益。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取0.3mm带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡30min，去脂杀菌；
2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡23h，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤4次；
3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质用0.5％的TritonX-100溶液在室温下超声清洗5min，摇床震荡6h，再次超声清洗5min，摇床震荡4h，最后转移到无菌PBS溶液中摇床震荡2h，重复TritonX-100溶液超声清洗-震荡-清洗-震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，将真皮基质用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗5min，摇床振荡3h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡3h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；
4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，孔径为0.1mm，孔间距为1mm，用无菌PBS溶液洗涤4次；
5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照11h消毒灭菌，即得成品。
其中，制备方法中所使用的无菌PBS溶液是由NaCl8.00g+KCl0.20g+KH2PO40.20g+Na2HPO41.56g溶解于1000mL的容量瓶中并定容得到的。
实施例2：
一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取0.3mm带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡20min，去脂杀菌；
2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡22h，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤5次；
3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质用0.5％的TritonX-100溶液在室温下超声清洗7min，摇床震荡6h，再次超声清洗7min，摇床震荡4h，最后转移到无菌PBS溶液中摇床震荡2h，重复TritonX-100溶液超声清洗-震荡-清洗-震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，将真皮基质用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗7min，摇床振荡3h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡3h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；
4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，孔径为0.3mm，孔间距为2mm，用无菌PBS溶液洗涤3次；
5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照10h消毒灭菌，即得成品。
其中，制备方法中所使用的无菌PBS溶液是由NaCl8.00g+KCl0.20g+KH2PO40.20g+Na2HPO41.56g溶解于1000mL的容量瓶中并定容得到的。
实施例3：
一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取0.5mm带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡40min，去脂杀菌；
2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡24h，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤3次；
3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质用0.5％的TritonX-100溶液在室温下超声清洗3min，摇床震荡5h，再次超声清洗3min，摇床震荡3h，最后转移到无菌PBS溶液中摇床震荡1h，重复TritonX-100溶液超声清洗-震荡-清洗-震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，将真皮基质用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗3min，摇床振荡2h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡2h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；
4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，孔径为1.3mm，孔间距为5mm，用无菌PBS溶液洗涤5次；
5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照12h消毒灭菌，即得成品。
其中，制备方法中所使用的无菌PBS溶液是由NaCl8.00g+KCl0.20g+KH2PO40.20g+Na2HPO41.56g溶解于1000mL的容量瓶中并定容得到的。
实施例4：
一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：
1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取0.4mm带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用2‰的苯扎氯铵溶液浸泡30min，去脂杀菌；
2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡23h，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤3次；
3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质用0.5％的TritonX-100溶液在室温下超声清洗4min，摇床震荡5.5h，再次超声清洗4min，摇床震荡3.5h，最后转移到无菌PBS溶液中摇床震荡1.5h，重复TritonX-100溶液超声清洗-震荡-清洗-震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，将真皮基质用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗4min，摇床振荡2.5h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡2.5h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；
4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，孔径为0.7mm，孔间距为2.5mm，用无菌PBS溶液洗涤4次；
5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照11h消毒灭菌，即得成品。
其中，制备方法中所使用的无菌PBS溶液是由NaCl8.00g+KCl0.20g+KH2PO40.20g+Na2HPO41.56g溶解于1000mL的容量瓶中并定容得到的。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。