专利名称：激光微孔猪去细胞真皮基质及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学皮肤组织工程技术领域，尤其涉及一种激光微孔猪去细胞真皮基质作为人体真皮替代物的应用，还涉及激光微孔猪去细胞真皮基质的制备方法。
背景技术：
大面积深度烧伤创面愈合后，常遗留瘢痕增生和挛缩畸形，严重影响外观和功能，这与愈合创面缺乏真皮有关。如果在促进创面愈合的同时，重建真皮结构，将能有效减轻瘢痕的形成，进而提高创面修复的质量。
国内外在真皮替代物方面开展了大量研究，各种人工合成真皮(如Integra和Dermagraft等)、去细胞同种异体真皮(如Alloderm等)等产品相继问世并投入使用，取得了较好的临床效果，但其价格昂贵，临床应用受到限制。由于猪去细胞真皮基质具有来源广和费用低廉等优点，因此其受到重视并在临床上得到初步应用。
既往在制备猪去细胞真皮基质时，通常采用皮肤拉网机将其制成网状，移植后创面基底渗液能够透过真皮网眼营养浅层皮片，微血管可通过网眼再生，从而保证复合皮的成活。临床上将网状猪去细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植，用于修复小面积切痂创面、瘢痕切除创面以及各种原因所致的皮肤软组织缺损，取得较满意的疗效。但由于网状真皮的网眼较大，真皮基质分布欠均匀，网眼部分的自体刃厚皮实质上等同于单纯自体皮移植，因此远期仍存在一定程度的创面收缩。此外，临床上将网状猪去细胞真皮基质+自体微粒皮+异体皮复合移植，试图改善大面积深度烧伤创面愈合质量，结果发现在某些病例中异体皮成活不良。这是由于在异体皮与创面基底之间加入猪去细胞真皮基质后，真皮网嵴部分影响了浅层异体皮的营养供应和血管再生。
因此，只有同时尽可能地缩小真皮网眼(孔径)和缩窄网嵴(孔间距)，才能有效解决上述问题。但传统的拉网机并不具备这一精细工艺，传统的拉网机(以美国Zimmer公司皮肤拉网机为例)只能制备孔径约为1.8mm×1.8mm，孔间距约为1.2mm的真皮基质。
激光打孔是最早达到实用化的激光加工技术，已广泛应用于金属、皮革、玻璃、木材等材料的加工。激光打孔技术主要具有以下优点①打孔速度快、效率高；②孔径微小、可调；⑧适用于各类材料；④无工具损耗；⑤适合数量多、高密度的群孔加工。激光微孔孔径可达到数十至数百微米不等，可容纳蛋白质等营养成分通过，便于真皮内微血管的重建。
因此，将激光打孔技术引入猪去细胞真皮基质的加工，可望在真皮基质上制作出均匀密布的微孔，以利于组织间液渗透和微血管再生，从而达到提高复合皮移植成活率和改善创面愈合质量的目的。但到目前为止，仍未开发出将激光打孔技术应用于猪去细胞真皮基质加工领域以制备微孔猪去细胞真皮基质的方法。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种激光微孔猪去细胞真皮基质，其特征在于通过对猪去细胞真皮基质采用二氧化碳激光加工机打孔加工进行制备。
本发明的另一个目标是提供一种激光微孔猪去细胞真皮基质，其特征在于孔径为0.40±0.02mm，孔间距为0.8mm～1.0mm。
本发明的第三个目标是提供一种激光微孔猪去细胞真皮基质的制备方法，其特征在于采用激光对猪去细胞真皮基质进行打孔加工。在本发明的一个优选的实施方式中采用二氧化碳激光加工机对猪去细胞真皮基质进行打孔加工(优选孔径为0.40±0.02mm，孔间距0.8mm～1.0mm)，再将激光微孔猪去细胞真皮基质置入0.5％Triton X-100溶液内浸泡并持续震荡6个小时，去除微孔周围变性组织，并使用磷酸盐缓冲溶液对其进行充分浸泡和洗涤，袋装密封。在本发明的一个优选实施方式中，对所制备的激光微孔猪去细胞真皮基质使用60Co照射进行消毒，并在4℃保存备用。
本发明的第四个目标是提供一种激光微孔猪去细胞真皮基质在构建组织工程复合皮以及人体真皮替代物中的应用。
本发明的其它目标和优点，将通过下面的
具体实施方式
和说明变得显而易见。
具体实施例方式
制备激光微孔猪去细胞真皮基质首先，制备猪去细胞真皮基质。可以采用任何已知的制备猪去细胞真皮基质的方法，优选采用专利号为ZL 200410069394.2中所公开的方法，这里将该专利作为参考文献加以整体引用。将无菌猪皮在三蒸水配置的高渗盐水中浸泡获得的真皮基质，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氢氧化钠溶液中用水浴震荡器常温下持续震荡24小时，再用超声波清洗机对真皮基质用三蒸水分次震荡洗涤至少3遍，每次至少震荡洗涤10分钟，然后用磷酸平衡盐溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇内浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍后，-80℃下冷冻干燥4小时，分装消毒，低温保存备用。
然后，采用二氧化碳激光加工机对猪去细胞真皮基质进行打孔加工。孔径0.40～0.02mm。根据孔间距不同，制备出四种规格的激光微孔去细胞真皮基质(0.8mm、1.0mm、1.2mm和1.5mm)。再将激光微孔猪去细胞真皮基质置入0.5％TritonX-100溶液内浸泡并持续震荡6小时，去除微孔周边变性组织，磷酸盐缓冲溶液充分浸泡洗涤，袋装密封，使用60Co照射进行消毒，4℃保存备用。
动物模型及分组取健康SD大鼠144只，雌雄不限，体重为250±15g。3％的戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉，背部去毛，切除背部约3cm×3cm全层皮肤至深筋膜。大鼠随机分为6组(n＝24)。微孔组I孔间距为0.8mm的激光微孔猪去细胞真皮基质+自体刃厚皮移植；微孔组II孔间距为1.0mm的真皮基质+自体刃厚皮移植；微孔组III孔间距为1.2mm的真皮基质+自体刃厚皮移植；微孔组IV孔间距为1.5mm的真皮基质+自体刃厚皮移植；网状组网状猪去细胞真皮基质(采用皮肤拉网机按1∶1.5比例拉网而成)+自体刃厚皮移植；对照组单纯自体刃厚皮移植。创面移植后用凡士林纱布及无菌敷料覆盖，打包固定。实验鼠术后单笼饲养。分别在术后2周、4周和6周观察创面愈合率，计算收缩率，同时取移植物组织进行组织学观察。
实验结果(1)创面大体观察 移植术后2周，微孔组I、II、III和网状组创面移植的<p>表四
实施例3处方见表五表五
制备方法同实施例2该实施例制备的涤纶薄膜吸附亚甲蓝组合物的含量经检测为168.2ug/片，无菌、热原检测合格，微粒检测符合2005年二部药典附录ixC规定，符合注射用要求。
该实施例制备的亚甲蓝的病原体灭活验证效果详见下表六表六
实施例4处方见表七表七
<p>表2术后各组创面收缩率比较(％，x±s)
注与对照组比较*P＜0.05与网状组比较#P＜0.05(2)组织学观察 各微孔组和网状组术后2周复合皮组织学可见炎性细胞浸润、成纤维细胞生长及毛细血管结构出现；术后4周复合皮表皮层分化良好，真皮内可见少许炎性细胞浸润，毛细血管垂直于创面生长；术后6周表皮和真皮结构基本正常，真皮层内可见到胶原纤维排列规整，毛细血管结构丰富，未见皮肤附件；免疫组化抗层粘连蛋白(Laminin)染色各组层粘连蛋白，均在基底膜区及真皮血管束周围呈阳性反应，染色较深，连续性好。术后6周，对照组表皮层分层接近正常，但真皮内胶原纤维排列较紊乱，成纤维细胞多；免疫组化染色层粘连蛋白在基底膜区及真皮血管束周围也呈阳性反应，但染色较淡，连续性较差。
以上实验结果表明微孔孔间距越小，移植物成活率越大；当孔间距为0.8mm和1.0mm时，两组术后6周的移植物成活率及创面收缩率均明显优于网状猪去细胞真皮基质组和单纯自体刃厚皮移植组；当孔间距为1.2mm或1.5mm时，两组移植物成活率低于网状猪去细胞真皮基质组和单纯自体刃厚皮移植组。结果证实，孔间距为0.8mm或1.0mm的激光微孔猪去细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植可明显提高创面修复质量；其中后者与前者相比，孔间距更大，单位面积内微孔更少、真皮基质组织量更多，而移植物成活率及创面收缩率无明显差异。
通过上述描述，本发明的以下优点是显而易见的①激光微孔孔径微小、一致，分布均匀，存活后可缩小创面收缩率。
②真皮基质易于血管化，可提高创面愈合率；⑧制备工艺简单，价格低廉。
需要注意的是，本发明所讨论的这些优选实施方案及其变化对于本领域技术人员来说根据这里所公开的内容是很显而易见的和有启示的，其中显然需要理解的是，上面描述的内容只是为了举例说明本发明而不是对其进行限制。
权利要求
1.一种激光微孔猪去细胞真皮基质，其特征在于通过对猪去细胞真皮基质采用二氧化碳激光加工机进行打孔加工进行制备。
2.根据权利要求1所述的激光微孔猪去细胞真皮基质，其中所述的猪去细胞真皮基质是通过包括以下步骤的方法进行制备的1)将无菌猪皮在三蒸水配置的高渗盐水中浸泡获得的真皮基质，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氢氧化钠溶液中用水浴震荡器常温下持续震荡24小时；2)再用超声波清洗机对真皮基质用三蒸水分次震荡洗涤至少3遍，每次至少震荡洗涤10分钟；3)然后用磷酸平衡盐溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇内浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍。
3.根据权利要求1或2所述的激光微孔猪去细胞真皮基质，其特征在于其孔径为0.40±0.02mm，孔间距为0.8mm～1.0mm。
4.一种制备激光微孔猪去细胞真皮基质的方法，其包括使用激光对猪去细胞真皮基质进行打孔加工。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的猪去细胞真皮基质是通过包括以下步骤的方法进行制备的1)将无菌猪皮在三蒸水配置的高渗盐水中浸泡获得的真皮基质，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氢氧化钠溶液中用水浴震荡器常温下持续震荡24小时；2)再用超声波清洗机对真皮基质用三蒸水分次震荡洗涤至少3遍，每次至少震荡洗涤10分钟；3)然后用磷酸平衡盐溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇内浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于包括以下步骤A)采用二氧化碳激光加工机对猪去细胞真皮基质进行打孔加工；B)将激光微孔猪去细胞真皮基质置入0.5％ Triton X-100溶液内浸泡并持续震荡6个小时，去除微孔周围变性组织，并使用磷酸盐缓冲溶液对其进行充分浸泡和洗涤。
7.根据权利要求4～6中任意一项所述的方法，其特征在于对所制备的激光微孔猪去细胞真皮基质使用60Co照射进行消毒。
8.根据权利要求4～7中任意一项所述的方法，其特征在于步骤A)中采用二氧化碳激光加工机对猪去细胞真皮基质进行打孔加工的孔径为0.40±0.02mm，孔间距为0.8mm～1.0mm。
9.根据权利要求1或2所述激光微孔猪去细胞真皮基质与自体刃厚皮的结合在制备人体真皮替代物中的应用。
10.根据权利要求1或2所述激光微孔猪去细胞真皮基质与培养细胞的结合在构建组织工程复合皮中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种采用二氧化碳激光加工机制备激光微孔猪去细胞真皮基质的方法，其包括(A)采用二氧化碳激光加工机对猪去细胞真皮基质进行打孔加工，孔径为0.40±0.02mm，孔间距0.8mm～1.0mm；(B)将激光微孔猪去细胞真皮基质置入0.5％Triton X－100溶液内浸泡并持续震荡6个小时，去除微孔周围变性组织，并使用磷酸盐缓冲溶液对其进行充分浸泡和洗涤，袋装密封。本发明公开了一种通过上述方法所制备的激光微孔猪去细胞真皮基质，其适合制备人体真皮替代物和构建组织工程复合皮。
文档编号A61L27/38GK1861203SQ20061009008
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者柴家科, 梁黎明, 杨红明, 冯瑞, 孙强, 尹会男, 侯玉茹 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院