一种阴道基质材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞外基质及其制备方法，具体的说是涉及一种阴道基质材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞外基质材料(亦称脱细胞基质材料)是由组织或器官脱细胞后剩余的结构和功能蛋白的复合体，其由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖和多种生长因子等构成，它对细胞黏着，细胞分化和细胞与生物材料之间的连接有着重要的作用。并且，细胞外基质材料移植后会逐渐降解为单肽类物质，其具有很强的生物活性，具有抗菌性，趋化宿主细胞和促其有丝分裂的特性。因其具有来源广泛，无免疫原性，良好生物相容性，生物活性及抗菌性等优点，越来越受到人们的重视。
[0003]目前脱细胞基质材料通常采用动物组织或器官经过脱细胞处理后形成具有一定机械性能和生物性能的支架材料。现已公开报道的有关脱细胞基质材料的制备方法有很多。如CN103191466B公开的一种制备人体或动物脱细胞组织的方法，其是以人类或动物组织中的皮肤、胸腹膜、食道粘膜、心脏瓣膜、骨、软骨、肌腱等为基材，经过初步加工制成所需形状后，经过灭活、采用含过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂、烧碱的溶液进行两次脱脂，然后采用过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂、胰酶或胰蛋白酶的溶液进行脱细胞处理，最后保存、冻干，由此将动物组织或器官进行脱细胞处理。该方法列举了许多具体的人类/动物组织，但采用的都是同一种处理方法。本领域技术人员都知晓，在组织和器官脱细胞方法中，选用的组织不同，其脱细胞方法也不尽相同。每一种处理方法都会对所制备的支架材料的生物学组成以及组织的超微结构、机械性能产生不同的影响。另外，该文献也未曾公开任何一个具体实例，说明其所制的具体材料的生物学特性以及机械性能特点。因此，该文献对本领域技术人员不具有任何指导意义。朞惠等研究人员对脱细胞真皮基质制备及其生物相容性进行了研究，其采用的方法是采用新生小牛背部真皮组织，以0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞，然后采用0.5%胰蛋白酶行胶原纤维结构重塑，再用甲醛浸泡进行交联，0.5%硫酸软骨素溶液中超声振荡进行表面修饰。该方法制备的是一种适合软骨细胞生长的生物支架(详见朞惠等.脱细胞真皮基质制备及其生物相容性研究.中国修复重建外科杂志2014年6月第28卷第6期)。CN101366975B (ZL200810150792.5)公开了一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，该方法是以小肠粘膜下层为基材，首先通过刮除小肠粘膜、肌层和浆膜获得粘膜下层，然后放入0.1-1M的NaOH溶液中进行脱细胞处理，脱细胞处理的粘膜下层置入含DNA酶和α -半乳糖苷酶的混合液中，进行酶处理，将酶处理的粘膜下层于冷冻保护液中浸泡处理后，再经冷冻干燥，形成脱细胞小肠粘膜下层生物材料的膜状产品。由此可见，目前对不同组织来源的材料的处理方法都不尽相同。
[0004]目前针对不同的疾病需求，动物组织脱细胞基质材料的研究有多种，如心脏、肝脏、肺脏、膀胱、皮肤、小肠粘膜、胸膜、腹膜、心包膜等等。阴道组织缺失、盆底损伤和机能退化造成的盆腔器官脱垂是妇产科常见的一些疾患。先天性无阴道(MRKH综合征)、两性畸形、创伤、肿瘤术后等均可导致阴道组织缺失。阴道组织缺失给患者躯体带来痛苦的同时，也给患者造成巨大的精神心理压力。盆底损伤和机能退化造成的盆腔器官脱垂(pelvic organprolapse, POP),严重影响了中老年妇女的健康和生活质量。这两种疾病用到的脱细胞基质材料主要是以动物真皮、小肠粘膜和膀胱为基材，这可能是源于真皮、膀胱固有层或小肠粘膜下层比较容易进行切割、处理的缘故(如:选用真皮可采用机器切割方式或用切割刀，即可除去表皮，获得所需真皮材质；膀胱固有层和小肠粘膜下层由于具有上皮层和肌层且与所取组织连接疏松的生理结构的特性，因此比较容易获得)。并且，虽然已有材料的应用起到了一定的治疗效果，但其生物活性、生物力学性能及其治疗效果还有待进一步提高。研究者希望找到并制备出更适用于盆底修复、阴道重建的脱细胞基质材料。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种更适用于盆底修复或阴道重建的脱细胞阴道基质材料及其制备方法。
[0006]本发明的目的是这样实现的:
本发明所提供的脱细胞阴道基质材料，其载体为猪/牛阴道组织粘膜层，所述载体经以下方式处理:
Ca)将猪/牛阴道组织粘膜层在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-72小时；其中所述Tris溶液，其浓度为0.01M、pH为8.0 ;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L ;
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时；
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层，经磷酸盐缓冲液漂洗，然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的Tris-HCl缓冲溶液震荡处理6_10天，再经磷酸盐缓冲液漂洗；
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；
Cd)将(c)步骤处理过的粘膜层，放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲溶液中，在32°C _37°C温度下震荡处理8-12小时，再经磷酸盐缓冲液漂洗；
(d)步所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05M、pH值为8.0 ;其所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL ;所含核糖核酸酶的浓度为l_5U/mL ;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层，消毒和冻干，即得阴道基质材料。
[0007]本发明还提供了所述阴道基质材料的制备方法，具体包括以下步骤:
Ca)将猪/牛阴道组织，采用钝器和锐器交替剥离除去阴道组织的外膜层及肌层，留取厚度均匀、无损伤的阴道粘膜层，漂洗后，放置在含有苯甲基磺酰氟的去离子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震荡处理24-72小时；其中所述Tris溶液的浓度为0.01M,pH为8.0 ;去离子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的浓度为0.1mM/L ；
其中所述的钝器如机械手、机械钳；锐器如切割刀、手术刀、手术剪等，如此采用钝器和锐器交替剥离法，解决了阴道组织皱襞多、质地致密、粘膜层难以剥离的难题；
(b)将(a)步骤处理过的粘膜层放置在所含十二烷基硫酸钠的质量体积浓度为0.1-1%的水溶液或Tris-HCl缓冲溶液中震荡处理8-12小时；
(c)将(b)步骤处理过的粘膜层，经磷酸盐缓冲液漂洗，然后用所含TritonX-100的体积浓度为0.1-1%的TriS-HCl缓冲溶液震荡处理6_10天，再经磷酸盐缓冲液漂洗；
上述(c)、(b)步骤中的所有溶液及缓冲溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；(c)步和(b)步中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.01M、pH为8.0 ;
Cd)将(c)步骤处理过的粘膜层，放置在含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl缓冲溶液中，在32°C _37°C温度下震荡处理8-12小时，再经磷酸盐缓冲液漂洗；
其中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05M、pH值为8.0，其所含脱氧核糖核酸酶的浓度30-70U/mL，所含核糖核酸酶的浓度l_5U/mL ;
(e)将(d)步骤处理过的粘膜层，消毒和冻干，即得阴道基质材料。
[0008]所述阴道基质材料的制备方法中，步骤(e)中所述消毒的优选方案是:使用含过氧乙酸和乙醇的溶液将(d)步骤处理过的粘膜层在25°C条件下震荡处理2小时，振荡速率为80-200rpm，然后依次使用无菌磷酸盐缓冲液和无菌去离子水漂洗；其中，所述含过氧乙酸和乙醇的溶液中，所含过氧乙酸的体积百分含量为0.1%，所含乙醇的体积百分含量为20%。
[0009