一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 现代生物医学的发展非常注重以细胞为基础的研究，包括细胞内生物大分子的组 成和变化规律。一方面关于分子水平的研究受到重视，另一方面关于细胞与细胞之间的相 互关系，组织、器官以及机体的赋型和功能的完成，也都是非常重要的研究内容。这样的认 识，促使人们更加关注位于上皮或内皮细胞下层、结缔组织细胞周围，为组织、器官甚至 整个机体的完整性提供力学支持和物理强度的物质一细胞外基质。近年来，关于细胞外基 质的种类、结构、功能、调控的研究变得非常重要。除了机体的生理功能与细胞外基质的 关系不可或缺，细胞外基质在各种疾病的形成和演变中也具有非常重要的作用。因此，细胞 外基质的研究已经成为生物医学领域中非常重要的研究方向和研究内容。
[0003] 脱细胞技术就是通过脱除组织细胞的方法得到无定型的胞外基质，去除组织的移 植免疫原性，同时产生空间及保留相应的生化信号，让干细胞或者宿主相容的细胞能够生 长并重建组织。
[0004]目前国内外常用到的脱细胞方法有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，只要条件 控制适度，这些方法均可制备出合乎条件的组织工程材料，但这些方法或多或少会影响胞 外基质的生物性能。1、未交联型的组织工程材料几乎没有表面张力，力学性能差，尽管有 一些工艺中复合了高分子生物材料，增加了组织工程材料的力学性能，但植入人体后，在使 用过程中，在极其复杂的人体环境中，受到各种因素的影响，会失去原有的机械强度。而细 胞外基质是细胞赖以生存的微环境，基质硬度的增加能影响DNA的复制和表达、影响干细 胞的分化方向，促进细胞迀移、改变细胞核的形态。2、目前现有脱细胞技术中交联型组织 工程材料则是通过一些化学和物理方法改性，增加胞外基质的生物力学性能，通常都是利 用胶原蛋白螺旋结构X和Y位置的特殊氨基酸侧链来进行交联，提高脱细胞基质的强度、耐 用性和降低免疫性。然而，在交联的同时，更重要的是交联剂本身的毒性及其残留成为影响 细胞相容性的一个隐性原因。3、另外，在我们产业化研究的过程中发现，脱细胞技术制备 的产品，一个主要的问题是细胞毒性不稳定，不易控制。国内已上市产品，未交联型及交联 型组织工程材料仍然存在细胞毒性不合格产品，虽然在脱细胞技术制备工艺中已经过磷酸 盐缓冲液和纯化水大量洗涤，但仍有细胞毒性。目前几乎所有的生物材料都必须通过相关 实验来检测其是否具有良好的生物相容性，以确保生物材料安全地应用于人体组织。其中 最常用的就是细胞毒性实验，它也是最敏感的生物学实验之一。细胞毒性实验是指应用体 外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价对细胞的毒 性，通过观察细胞形态及数量改变初步判断材料是否具有毒性，是检测生物相容性的一种 快速、价廉、重复性好的方法。动物源性生物材料本身所含生物大分子的复杂性，原材料 经过复杂的加工过程时，其中还可能添加很多辅助作用的化学试剂，样品的初始污染菌数 量、内毒素含量以及酸碱度等，每一环节都有可能产生毒性作用。
[0005] 理想的脱细胞技术制备的样品，应该具有优越的生物相容性、可降解性及具备一 定的机械强度。因此在现有脱细胞制备技术中，怎样解决既要完全脱除细胞等抗原成分，又 能最大限度的保留胞外基质等有用成分，在工艺产业化过程中优化脱细胞组织工程材料的 机械性能并且保证其良好、稳定的组织相容性，是我们要解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生物相容性良好的异种 脱细胞真皮基质的制备方法，通过该方法制备得到的组织工程材料细胞毒性稳定，细胞相 容性更好。
[0007] 为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为： 一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其具体包括如下步骤： (1) 制备断层皮片 取0. 1-2. Omm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0. 1%(质量体积 比(质量体积比g/l〇〇ml))新洁尔灭去脂，再用PBS液洗涤； (2) 分离表皮和真皮 将步骤（1)得到的断层皮片用0. 1%~0. 3% (质量体积比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS 液在4°C -20°C下，浸泡6-36h，依次用乙醇、双氧水和纯水洗涤，洗涤，最后PBS洗涤； (3) 脱细胞处理 将步骤（2)处理后的材料先用0. 1~0. 5%(质量体积比g/100ml)SDS水溶液洗涤1~ 6小时，再用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤，然后用纯化水洗涤，最后PBS液洗涤； (4) 交联 将步骤（3)处理后的材料用0. 024~0. lmol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干 重对应215ml交联液反应，反应结束后，用0. lmol/L磷酸氢二钠洗涤，再用纯化水洗涤； (5) 病毒灭活 将步骤（4)处理后的材料用0. 2~I. 2mol/L氢氧化钠浸泡30~60分钟，纯化水洗涤 至中性； (6) 精制 将步骤（5)处理后的材料用乙醇洗涤，再用纯化水充分洗涤； (7) Co-60辐照灭菌 将步骤（6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的F射线辐照消毒灭菌， 即得成品。
[0008] 进一步的，所述的PBS液的配制方法如下： NaCl 8.00g/L ； KCl 0. 20 g/L ； Na2HPO4 I. 56g/L ； KH2PO4 0. 20 g/L ； 将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。
[0009] 进一步地，所述步骤（2)中用乙醇洗涤，为40%~75%乙醇(体积分数）洗涤6~12 小时，3%双氧水洗涤15分钟。
[0010] 进一步地，所述步骤（3)中水溶性含羟基化合物包括水溶性氨基酸类、羧甲基壳 聚糖或水溶性醇类，浓度为2~10% (质量体积比g/100ml)，用水溶性含羟基化合物的水溶液 洗涤的洗涤时间为1~6小时。
[0011] 进一步地，水溶性含羟基化合物的水溶液为乙醇溶液，优选浓度为4%(质量体积比 g/100ml)，洗涤时间为1~6小时。
[0012] 进一步地，所述步骤（4)中的交联液通过如下方法配置：以浓度为0. 05mol/L的 2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES)水溶液为交联液溶剂，先向其中加入EDC. HCL，然后再加入 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，所述EDC. HCL和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的质量比为3 :1~8 : 1，交联液浓度为〇. 024~0. lmol/L。
[0013] 进一步地，所述步骤（6)中用乙醇洗涤，浓度为40% (体积分数)。
[0014] 进一步地，具体步骤如下： (1) 制备断层皮片 取0. 1-2. Omm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0. 1%新洁尔灭 去脂，再用PBS液洗涤3-6次； (2) 分离表皮和真皮 将步骤（1)得到的断层皮片用0. 1%~0. 3% (质量体积比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS 液在4°C -20°C下，浸泡16-36h，用乙醇洗涤，优选为70%乙醇洗涤6~12小时，3%双氧水 洗涤15分钟，然后用PBS洗涤，3~6次，然后再用纯化水洗涤12~24次，隔1小时换液； (3) 脱细胞处理 将骤（2)处理后的材