5ml交联液反应，于25 °C条件下交联 4小时，80转/分；反应结束后，用0. lmol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次， 每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液； 所述的交联液的配制方法如下：以浓度为〇. 〇5mol/L的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES) 水溶液IOlml为交联液溶剂，先向其中加入EDC. HCLO. 9681g，然后再加入N-羟基琥珀酰亚 胺（NHS) 0. 242g，所述EDC. HCL和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的质量比为4 :1。
[0037] (5)病毒灭活 将步骤（4)处理后的材料在4°C条件下，lmol/L氢氧化钠浸泡30分钟，纯化水洗涤至 中性； (6) 精制 将步骤（5)处理后的材料先用40%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水 充分洗涤； (7) Co-60辐照灭菌 用双层铝箱袋包装将步骤（6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的 射线辐照消毒灭菌，即得成品。
[0038]效果例 对实施例1-3和对比例1-3所得到的成品进行效果比较，具体见下表：
通过上表说明随着加入乙醇量增多，细胞毒性趋向良好，但力学强度下降；加入戊二醛 交联剂，能提高其力学强度，但细胞毒性不能保证所有产品均在i级以上。
[0039] 以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对 于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而 易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【主权项】
1. 一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，其具体包括 如下步骤： (1) 制备断层皮片 取0. 1-2.Omm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0. 1%新洁尔灭 去脂，再用PBS液洗涤； (2) 分离表皮和真皮 将步骤（1)得到的断层皮片用0. 1%~0. 3% (质量体积比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS液在4°C-20°C下，浸泡6-36h，依次用乙醇、双氧水和纯水洗涤，最后PBS洗涤； (3) 脱细胞处理 将步骤（2)处理后的材料先用0. 1~0. 5%(质量体积比g/100ml)SDS水溶液洗涤1~ 6小时，再用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤，然后用纯化水洗涤，最后PBS液洗涤； (4) 交联 将步骤（3)处理后的材料用0. 024~0.lmol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干 重对应215ml交联液反应，反应结束后，用0.lmol/L磷酸氢二钠洗涤，再用纯化水洗涤； (5) 病毒灭活 将步骤（4)处理后的材料用0. 2~1. 2mol/L氢氧化钠浸泡30~60分钟，纯化水洗涤 至中性； (6) 精制 将步骤（5)处理后的材料用乙醇洗涤，再用纯化水充分洗涤； (7) Co-60辐照灭菌 将步骤（6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的，射线辐照消毒灭菌， 即得成品。2. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，所述的PBS液的配制方法如下： NaCl8.00g/L； KC1 0. 20g/L； Na2HP04 1. 56g/L； KH2P04 0 . 20g/L； 将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。3. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，所述步骤（2)中用乙醇洗涤，为40%~75%乙醇洗涤6~12小时，3%双氧水洗涤 15分钟。4. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，所述步骤（3)中水溶性含羟基化合物包括水溶性氨基酸类、羧甲基壳聚糖或水 溶性醇类，浓度为2~10%，用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤的洗涤时间为1~6小时。5. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，水溶性含羟基化合物的水溶液为乙醇溶液，优选浓度为4%，洗涤时间为1~6小 时。6. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，所述步骤（4)中的交联液通过如下方法配置：以浓度为0. 05mol/L的2- (N-吗啡 啉）乙磺酸（MES)水溶液为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL，然后再加入N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的质量比为2 :1~8 :1，交联液浓度 为 0?024 ~0?lmol/L〇7. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，所述步骤（6)中用20%-50%乙醇洗涤，优选的，用40%乙醇洗涤。8. 根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其 特征在于，具体步骤如下： (1) 制备断层皮片 取0. 1-2. 0mm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0. 1%新洁尔灭 去脂，再用PBS液洗涤3-6次； (2) 分离表皮和真皮 将步骤（1)得到的断层皮片用0. 1%~0. 3% (质量体积比g/100ml)的胰蛋白酶的PBS液在4°C-20°C下，浸泡16-36h，用乙醇洗涤，用70%乙醇洗涤6~12小时，3%双氧水洗涤 15分钟，然后用PBS洗涤，3~6次，然后再用纯化水洗涤12~24次，隔1小时换液； (3) 脱细胞处理 将骤（2)处理后的材料用0. 1~0. 5% (质量体积比g/100ml)SDS水溶液洗涤1~6 小时，用浓度为2~10%的水溶性含羟基化合物水溶液洗涤，1~6小时，继续用纯化水洗涤 12~24次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤12~24次，每隔两小时换液； (4) 交联 将步骤（3)处理后的材料用0. 03~0.lmol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干 重对应215ml交联液反应，于25°C条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.lmol/ L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120 转/分，每隔30分钟换液； (5) 病毒灭活 将步骤（4)处理后的材料用0. 2~1. 2mol/L氢氧化钠浸泡30~60分钟，纯化水洗涤 至中性； (6) 精制 将步骤（5)处理后的材料用40%乙醇洗涤，洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水 充分洗涤； (7) Co-60辐照灭菌 用双层铝箱袋包装将步骤（6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的沪 射线辐照消毒灭菌，即得成品。
【专利摘要】本发明涉及到一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其具体包括如下步骤：(1)制备断层皮片；(2)分离表皮和真皮；(3)脱细胞处理；(4)交联；(5)病毒灭活；(6)精制；（7）Co-60辐照灭菌。本发明提供的方法得到的脱细胞组织工程材料的细胞毒性稳定，细胞相容性更好。
【IPC分类】A61L27/36
【公开号】CN105079880
【申请号】CN201510549616
【发明人】宋灵杰, 李一礼, 李晶, 谢美娜, 王云泽, 杨国峰
【申请人】河北爱能生物科技股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月1日