本发明涉及一种医用多孔材料的制备方法，尤其涉及一种具有三维梯度孔结构的人体皮肤仿真材料的制备方法。
背景技术：
生物材料的选择决定了所构建的多孔支架材料生物相容性的优劣。海藻酸钠是从海藻植物里提取的天然材料，是美国食品药品管理局(FDA)批准用于组织工程等医学领域的天然生物材料之一。
海藻酸钠这种多糖具有与皮肤真皮基质成分：氨基聚糖类似的结构，生物相容性良好，皮肤成纤维细胞、肝细胞、软骨细胞和成骨细胞等均易在海藻酸盐多孔材料中成活并形成细胞外基质，同时海藻酸钠还具备良好的成膜性、凝胶性、吸湿性、阻隔细菌等特性，因此应用广泛。
组织工程皮肤支架能够为皮肤细胞的体外培养提供合适环境，以解决糖尿病足溃疡、烧伤等问题造成的皮肤缺损问题。临床常用或研究的皮肤组织工程支架多以均一孔径的支架为主，如武汉纺织大学朱平在2012年硕士毕业论文“海藻酸盐多孔材料的制备与性能研究”中研究了浓度为2％的海藻酸盐溶液在-20℃低温冰箱中预冻，纵截面形成100-500μm均匀孔隙的多孔材料。由于低温冰箱中温度的传导沿预冻模型轴向，因此沿此方向多孔材料孔径有差异，但纵截面孔径大小相同，青岛大学郝晓丽2010年在其博士毕业论文“海藻酸钙冻干膜及海藻酸钙基互穿网络膜材料的制备与性能研究”中研究了浓度为2％的海藻酸盐溶液在-5℃低温冰箱预冻，纵截面孔隙均匀，孔径为100-300μm，虽然材料制备简单，但是由于孔径单一，不适合全层皮肤的培养，使用于临床时容易造成瘢痕。有研究表明，具有皮肤仿生结构的梯度渐变组织工程支架更利于皮肤的再生，针对皮肤仿生结构的皮肤组织工程支架，研究报道多为采用双层或多层复合的方法或其他方法制备，该方法较为耗时如Harley及Oh等人研究使用旋转/离心技术结合冷冻干燥技术构建径向具有梯度孔结构的多孔支架，支架的孔径大小可以通过旋转速度来调节，但此技术一般只适用于制备血管用管状支架材料，对于构建其他支架材料不适用(Harley,B.A.,Hastings,A.Z.,Yannas,I.V.&Sannino,A.Fabricating tubular scaffolds with a radial pore size gradient by a spinning technique.Biomaterials 27,866-874,doi:10.1016/j.biomaterials.2005.07.012(2006)；Oh,S.H.,Park,I.K.,Kim,J.M.&Lee,J.H.In vitro and in vivo characteristics of PCL scaffolds with pore size gradient fabricated by a centrifugation method.Biomaterials28,1664-1671,doi:10.1016/j.biomaterials.2006.11.024(2007))，Wu、Zhang和Mao等人使用不同致孔剂结合冷冻干燥技术形成梯度孔或双层支架结构，通过调节致孔剂大小来控制孔径分布，但是致孔剂较难完全去除干净，残留致孔剂对材料后期使用不利(Wu,H.et al.Fabrication of chitosan-g-polycaprolactone copolymer scaffolds with gradient porous microstructures.Materials Letters62,2733-2736,doi:10.1016/j.matlet.2008.01.029(2008)；Zhang,Q.,Lu,H.,Kawazoe,N.&Chen,G.Preparation of collagen porous scaffolds with a gradient pore size structure using ice particulates.Materials Letters107,280-283,doi:10.1016/j.matlet.2013.05.070(2013)；Mao,J.S.,Zhao,L.G.,Yin,Y.J.&Yao,K.D.Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds.Biomaterials 24,1067-1074,doi:Pii S0142-9612(02)00442-8)，Mao等人将试样置于单向导热的环境中，制备了双层支架材料，由于预冻温度单一，形成的支架孔径不可调控，且未形成梯度孔结构，Tanya J.Levingstone等使用层层自组装的方法构建三层梯度仿生软骨支架，每层支架均通过冷冻干燥制备，制备一次软骨支架需要三次冷冻干燥过程，费时费力(Levingstone,T.J.,Matsiko,A.,Dickson,G.R.,O'Brien,F.J.&Gleeson,J.P.A biomimetic multi-layered collagen-based scaffold for osteochondral repair.Acta Biomaterialia 10,1996-2004,doi:10.1016/j.actbio.2014.01.005(2014))。
完整皮肤具有表皮和真皮结构，而真、表皮细胞生长所需要的孔径大小不同。有研究表明，20μm更适合表皮细胞的生长，80μm更适合真皮成纤细胞的生长。并且，表皮细胞和真皮成纤细胞联合培养时细胞间的相互作用可更快促进伤口愈合，促进新皮的再生，并能避免瘢痕的形成。具有梯度孔结构的皮肤工程支架可同时容纳表皮细胞和真皮成纤细胞，比单层皮肤组织工程支架更具优越性。
技术实现要素：
本发明的目的是，提供一种上述的具有三维梯度孔结构的人体皮肤仿真材料的制备方法，其工艺简单、易控、制造成本低，产品质量稳定。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是，一种具有三维梯度孔结构的人体皮肤仿真材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，原料制备
按溶质与溶剂的质量比为1-20︰100，将海藻酸钠或氧化海藻酸钠溶于去离子水、蒸馏水、生理盐水、注射用水或林格氏液中，搅拌0.5-3h，得到海藻酸钠溶液或氧化海藻酸钠溶液；
上述海藻酸钠、氧化海藻酸钠的相对分子质量均≥10万；
第二步，在专用模具内冷冻成型
将海藻酸钠溶液或氧化海藻酸钠溶液倾倒入专用模具中，控制液深为0.5-5mm；静置脱泡12-24h或置于真空脱泡机内在真空度为1000Pa下脱泡0.5-1h
上述专用模具为一带上盖的平底容器，其周边壁面材质为绝热材料，底板材质为银或铜；
在专用模具内部底面上，均匀设置有若干数量、竖直朝上的导热针；导热针的长度≥5mm；导热针布置的疏密程度与仿生皮肤内毛孔分布的疏密程度一致；
上述平板式换热器的冷却媒质为液氮；
然后，扣紧上盖并将专用模具置于平板式换热器的顶板上冷冻，直至冻结成型，得到固态多孔结构形式的海藻酸钠或氧化海藻酸钠；
上述冷冻过程是按如下方法控制的：平板式换热器换热表面温度采用阶梯升温方式，以－75℃为起始温度、－15℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每升温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min；
或者，平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式，以－15℃为起始温度、－75℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每降温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min；
第三步，真空干燥
将所得固态多孔材料从专用模具中取出，放入真空干燥机中，真空干燥至绝干；
第四步，交联、冻干
将经过真空干燥后的物料取出，置于质量百分比浓度为3％-15％的交联剂溶液中，交联反应30-60min；
然后取出，用蒸馏水洗净，再置于冰箱中，在-10℃下冷冻8h，再经真空干燥至绝干，即得成品。
上述技术方案直接带来的技术效果是，制备工艺简单、易控，既有利于产品质量的稳定，有利于制造成本的降低。
所制得的海藻酸盐三维梯度人体皮肤仿真结构多孔材料具有皮肤仿生结构，其内部成蜂窝状，包括若干数量的孔，每相邻两孔彼此贯通；并且，从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，上表面的孔径为5-70μm，下表面的孔径为50-200μm。
这种梯度孔结构的海藻酸钠多孔材料，其适于用作皮肤工程支架，可同时容纳表皮细胞和真皮成纤细胞，比单层皮肤组织工程支架更具优越性。
并且，由于多孔材料的化学成分基本组成为海藻酸钠和海藻酸钙，或氧化海藻酸钠和氧化海藻酸钙；余量为杂质，杂质成分主要包括生理盐水、注射用水或林格氏液经水分蒸发后的固相残留物”，使得其具有良好的生物相容性、可降解性和良好的吸水性能。
更为重要的是，海藻酸钠/氧化海藻酸钠这种多糖具有与皮肤真皮基质成分：氨基聚糖类似的结构，由于其生物相容性良好，皮肤成纤维细胞、肝细胞、软骨细胞和成骨细胞等均易在海藻酸盐多孔材料中成活并形成细胞外基质，同时海藻酸钠还具备良好的成膜性、凝胶性、吸湿性、阻隔细菌等特性，特别适于用作人体皮肤工程支架。
上述技术方案中，盛装有海藻酸钠溶液/氧化海藻酸钠溶液的专用模具叠放在平板式换热器的顶板表面上，进行热交换(制冷)。此时，在竖直方向上的不同标高位置处，在海藻酸钠/氧化海藻酸钠溶液内部必然存在一定的温差或被冻结过程的先后顺序，且这种温差或被冻结过程的先后顺序必然导致最终冻结成型的海藻酸钠/氧化海藻酸钠多孔材料从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变。
概括而言，上述技术方案的关键点就在于：采用定向冷冻干燥法，通过控制模具内水平温度场的均匀性和纵向温度的渐变，孔径大小可由小孔5-70μm至大孔50-200μm梯度渐变，孔形态为蜂窝状连通结构的海藻酸盐多孔材料。
优选为，上述平板式换热器换热表面温度由计算机控制，平板式换热器的换热表面的降温速率为－5℃/min～－10℃/min、平板式换热器的换热表面的升温速率为+5℃/min～+10℃/min。
该优选技术方案直接带来的技术效果是，可以更好地保证三维梯度孔的成形质量。
进一步优选，上述交联剂为氯化钙、氯化锌、氯化铜、硫酸锌、硫酸铜、氯化铁、硫酸铁、氯化铝、硫酸铝中的一种或多种。
该优选技术方案直接带来的技术效果是，交联剂原料可供选择的范围宽，且易于获取。
进一步优选，上述氧化海藻酸钠是按如下方法制备得到的：
(1)、将海藻酸钠放入单口烧瓶，加入去离子水，搅拌至充分溶解，制成海藻酸钠水溶液，并滴加盐酸调节pH＝4；
(2)、使用锡箔纸包裹单口烧瓶，并向溶液中加入适量高碘酸钠，在25℃下磁力搅拌，避光反应3-5h；
(3)、然后，加入乙二醇终止氧化反应0.5-1h；
再加入适量氯化钠，待充分沉淀后，取沉淀物依次用乙醇、去离子水沉淀洗涤纯化，即得。
该优选技术方案直接带来的技术效果是，采用上述方法现场制取的氧化海藻酸钠，有利于使海藻酸钠部分糖醛酸单元的羟基转变成醛基，从而获得良好的降解性能和反应活性。
进一步优选，上述导热针为锥形针，按细端在上、粗端在下方式布置。。
该优选技术方案直接带来的技术效果是，“导热针为锥形针，按细端在上、粗端在下布置”这一技术特征，与所需获得的“从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变”这种结构形式的孔的形状相对应，这将更进一步地，尽快产品制备过程的冷冻成型速度和冷冻成型质量，更便于最终产品质量控制与质量稳定。
进一步优选，上述专用模具为组合式结构，包括底座与管筒，底座与管筒承插连接成过盈配合。
该优选技术方案直接带来的技术效果是，便于冷冻成型后的多孔材料的简单、快速脱模，并可降低脱模过程中可能因外力的施加，所造成的对多孔材料的冲击和损伤。
综上所述，本发明相对于现有技术，具有制备工艺简单、易控，所制备出的多孔材料产品具有“从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变”这种具有三维梯度孔结构形式；并且产品质量稳定、制造成本较低等有益效果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行详细说明。
说明：
一、以下各实施例的原料来源如下：
交联剂：均为市售产品；
海藻酸钠：相对分子质量≥10万，市售产品或从天然海藻植物里提取；
氧化海藻酸钠(相对分子质量≥10万)：是按如下方法制备得到的：
(1)、将海藻酸钠放入单口烧瓶，加入去离子水，搅拌至充分溶解，制成海藻酸钠水溶液，并滴加盐酸调节pH＝4；
(2)、使用锡箔纸包裹单口烧瓶，并向溶液中加入适量高碘酸钠，在25℃下磁力搅拌，避光反应3-5h；
(3)、然后，加入乙二醇终止氧化反应0.5-1h；
再加入适量氯化钠，待充分沉淀后，取沉淀物依次用乙醇、去离子水沉淀洗涤纯化，即得。
二、产品质量和性能参数指标检测与检验：
1、孔径的测量方法：使用手术刀，沿纵向剖切，置于电镜下，分别选择放大倍数30倍、50倍进行观测。
2、孔隙率的测量方法：液体位移法。
3、钠离子置换率的测量方法：将制备好的多孔材料浸入质量分数为2％的柠檬酸钠中进行溶解，用原子吸收法(AAS)测定多孔材料中的金属离子(钙、锌等离子)含量，并计算出钠离子置换率。
实施例1
将15g的海藻酸钠加入到1000mL蒸馏水中，室温搅拌3h，得到海藻酸钠或氧化海藻酸钠溶液。
将海藻酸钠溶液倒入专用模具中，海藻酸钠溶液液面至模具底板高度为3mm；静置脱泡24h；
然后，扣紧上盖并将专用模具置于平板式换热器的顶板上冷冻，直至冻结成型，得到固态多孔结构形式的海藻酸钠或氧化海藻酸钠；
上述冷冻过程是按如下方法控制的：平板式换热器换热表面温度采用阶梯升温方式，以－75℃为起始温度、－15℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每升温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min；
之后，将经过冷冻成型的样品，入真空冷冻干燥机，真空干燥至绝干；
将经过真空干燥后的物料取出，置于质量百分比浓度为5％氯化钙的溶液中，交联反应30min；
然后取出，用蒸馏水洗净，再置于冰箱中，在-10℃下冷冻8h，再经真空干燥至绝干，即得成品。
经检验：
所得产品的空隙率为85％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为25μm，大孔孔径为185μm。
钠离子置换率：48.2％
实施例2
除原料为氧化海藻酸钠、冷冻过程的控制方法为：平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式，以－15℃为起始温度、－75℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每降温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min之外；
其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为86％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为20μm，大孔孔径为200μm。
钠离子置换率：48.9％
实施例3
除脱泡是置于真空脱泡机内在真空度为1000Pa下脱泡0.5h、交联剂为25％的氯化铁溶液、冷冻过程的控制方法为：平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式，以－15℃为起始温度、－75℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每降温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min之外；
其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为83％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为25μm，大孔孔径为200μm。
钠离子置换率：47.8％
实施例4
除脱泡是置于真空脱泡机内在真空度为1000Pa下脱泡2h、交联剂为30％的氯化铝溶液之外；其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为80％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为25μm，大孔孔径为190μm。
钠离子置换率：42.1％
实施例5
除交联剂为20％的硫酸锌溶液之外；其余，均同实施例2。
经检验：
所得产品的空隙率为81％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为8μm，大孔孔径为154μm。
钠离子置换率：42.6％
实施例6
除交联剂为15％的硫酸铜溶液、冷冻过程的控制方法为：平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式，以－15℃为起始温度、－75℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每降温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min之外；
其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为86％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为25μm，大孔孔径为141μm。
钠离子置换率：48.8％
实施例7
除海藻酸钠溶液液面至模具底板高度为5mm、冷冻过程的控制方法为：平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式，以－15℃为起始温度、－75℃为终点温度，在起始温度下保温45min，之后每降温5℃保温一次，每次保温时间为30-45min之外；
其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为87％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为10μm，大孔孔径为190μm。
钠离子置换率：49.9％
实施例8
除海藻酸钠溶液液面至模具底板高度为0.5mm之外；其余，均同实施例1。
经检验：
所得产品的空隙率为80％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为60μm，大孔孔径为100μm。
钠离子置换率：42.2％
实施例9
除氧化海藻酸钠溶液液面至模具底板高度为5mm之外；其余，均同实施例2。
经检验：
所得产品的空隙率为87％；从下表面至上表面，各孔孔径分别从大到小成梯度渐变，其中，小孔孔径为15μm，大孔孔径为190μm。
钠离子置换率：49.3％
说明：
1、交联剂还可以使用其他可溶性的+2价、+3价的可溶性金属盐。例如：氯化锌、氯化铜、硫酸铁或硫酸铝。交联剂的成分和浓度，只是对最终产品的质量密度或交联反应的快慢有细微的影响。
2、我们的经验表明：海藻酸钠/氧化海藻酸钠溶液液面在专用模具内的深度，对最终产品的最大与最小孔的孔径，以及孔隙率指标等有较大影响；
其次，降温速率与冷媒的供送方式，对最大与最小孔的孔径，以及孔隙率指标也有一定的影响。
3、平板式换热器换热表面温度由计算机控制，平板式换热器的换热表面的降温速率为－5℃/min～－10℃/min、平板式换热器的换热表面的升温速率为+5℃/min～+10℃/min。
4、专用模具为一带上盖的平底容器，其周边壁面材质为绝热材料，底板材质为银或铜；
在专用模具内部底面上，均匀设置有若干数量、竖直朝上的导热针，所述导热针的长度≥5mm；所述导热针布置的疏密程度与仿生皮肤内毛孔分布的疏密程度一致。
5、平板式换热器的冷却媒质为液氮。