本发明属于中药领域，具体涉及一种治疗卵巢癌的中药复方及其制备方法。
背景技术：
：卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％，大多数已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，所以在早期诊断上是一大难题。目前尚未有治疗卵巢癌效果显著的中药复方。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种中药复方，用于治疗卵巢癌；本发明的第二目的在于提供一种利用上述中药复方制备的中药活性成分浸膏；本发明的第三目的在于提供一种治疗卵巢癌的中药复方制剂，含有上述的中药活性成分浸膏和药学上可以接受的辅料。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种治疗卵巢癌的中药复方，由如下重量份比例的生药制备而成：芫花，60～70份；五味子，35～45份；侧柏叶，45～55份；黄连，15～25份；补骨脂，35～45份；川牛膝，25～35份；没药和陈皮共50～70份，二者重量份之比为4～6:1。进一步地，所述的治疗卵巢癌的中药复方由如下重量份比例的生药制备而成：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为5:1。进一步地，所述的治疗卵巢癌的中药复方由如下重量份比例的生药制备而成：芫花，60份；五味子，35份；侧柏叶，45份；黄连，15份；补骨脂，35份；川牛膝，25份；没药和陈皮共50份，二者重量份之比为4:1。进一步地，所述的治疗卵巢癌的中药复方由如下重量份比例的生药制备而成：芫花，70份；五味子，45份；侧柏叶，55份；黄连，25份；补骨脂，45份；川牛膝，35份；没药和陈皮共70份，二者重量份之比为6:1。一种治疗卵巢癌的中药活性成分浸膏，由上述中药复方制备而成，包括如下步骤：取配方量的生药用65～95％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩，喷雾干燥得浸膏粉。进一步地，取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液。进一步地，浓缩至密度为1.15～1.30。进一步地，每克浸膏粉相当于生药4～6g。一种治疗卵巢癌的中药复方制剂，含有上述中药活性成分浸膏和药学上可以接受的辅料，按照常规方法制备成制剂。进一步地，所述制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射液、口服液。本发明的优点：本发明提供的中药复方经药理实验证明可以治疗卵巢癌；本发明提供的中药活性成分浸膏通过本发明提供的中药复方经提取、浓缩制备而成，可以显著治疗卵巢癌；本发明提供的中药复方制剂含有本发明提供的中药活性成分浸膏和药学上可以接受的辅料载体，可以用于治疗卵巢癌。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。本发明中涉及的生药基源与2015版中国药典一致。实施例1：活性成分浸膏的制备生药配方：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为5:1。制备方法：取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.22，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药5g。实施例2：活性成分浸膏的制备生药配方：芫花，60份；五味子，35份；侧柏叶，45份；黄连，15份；补骨脂，35份；川牛膝，25份；没药和陈皮共50份，二者重量份之比为4:1。制备方法：取配方量的生药用65％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.15，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药4g。实施例3：活性成分浸膏的制备生药配方：芫花，70份；五味子，45份；侧柏叶，55份；黄连，25份；补骨脂，45份；川牛膝，35份；没药和陈皮共70份，二者重量份之比为6:1。制备方法：取配方量的生药用95％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.30，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药6g。实施例4：活性成分浸膏的制备生药配方：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为4:1。制备方法：取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.22，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药5g。实施例5：活性成分浸膏的制备生药配方：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为6:1。制备方法：取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.22，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药5g。实施例6：实施例1的对比，没药和陈皮重量份之比为3:1生药配方：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为3:1。制备方法：取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.22，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药5g。实施例7：实施例1的对比，没药和陈皮重量份之比为7:1生药配方：芫花，65份；五味子，40份；侧柏叶，50份；黄连，20份；补骨脂，40份；川牛膝，30份；没药和陈皮共60份，二者重量份之比为7:1。制备方法：取配方量的生药用80％乙醇热回流提取2～3次，合并提取液，浓缩至密度为1.22，喷雾干燥得浸膏粉，每克浸膏粉相当于生药5g。实施例8：治疗卵巢癌作用一、材料和仪器人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3由兰州大学的医学实验中心提供。通用RPMI-1640培养基(10％胎牛血清)培养。分别按实施例1～7方法制备活性成分浸膏1～7。RPMI-1640培养液、四甲基偶氮挫蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、L-谷氨酰胺科昊生物工程有限公司。胰蛋白酶购于美国Sigma公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。十二院基磺酸钠(SDS)购于西安周鼎生物技术有限责任公司。HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。酸化HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。青霉素、链霉素购于华北制药厂。CO2培养箱(Heraeus，BB5060UV)，德国倒置相差显微镜(OLYMPUS，CK-40)，日本荧光显微镜(OLYMPUSOPTICAL，A×80，日本)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，酶标分析仪(BIO-TEK公司，美国)，低温高速离心机(Beckman-Coulter公司，德国)，EpicsXL流式细胞仪(Beckman-Coulter公司，德国)，R-3850型自动台式灭火器(山东新华医疗器械股份有限公司)，DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，数显恒温水浴箱(上海梅香仪器有限公司)，BS400S电子分子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，08-2恒温磁力搅拌器(上海天平仪器厂)，TDL-5普通离心机(上海安亭科学仪器厂)，低温冰箱(日本三洋公司)，电子制冰箱(日本三洋公司)，细胞冻存管(上海生工生物工程有限公司)，96孔板(科昊生物工程有限公司)。主要试剂的配置1、RPMI-1640：将RPMI-1640干粉剂一袋(10g)倒入清洗好的1000ml的烧杯中，加入双蒸水，终体积至1000ml，磁力搅拌器搅拌30分钟后，再加入碳酸氢钠2.0g，调整pH范围至7.2～7.4，继续搅拌使其充分溶解，之后在超净工作台中除菌，无菌条件下分装至250ml的盐水瓶中，放置4℃冰箱保存。每次重新配RPMI-1640时都应另取少量培养液放置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的培养箱中培养48h，细胞培养无菌后使用。2、10％胎牛血清：将冻存的胎牛血清置于4℃冰箱过夜解冻后放于56℃水域箱中，定时震摇，减少沉淀发生，35min后取出，置于超净工作台内降至常温后，分装置20或10ml小瓶后-20℃保存。3、PBS液：称取氯化钠8.00g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3.489g放入清洗好的100ml的烧杯中，再加入一些双蒸水，使其终体积为1000ml。，搅拌使其充分溶解，pH7.4，200ml瓶分装，高压灭菌后降至常温，4℃冰箱保存。4、青链霉素溶液：将青霉素、链霉素各80万单位，溶于80ml生理盐水中，无菌条件下分装，-20℃保存。当用其配制完全培养基时终浓度为100U/ml。5、胰蛋白酶消化液：称取胰蛋白酶0.25g，放入100ml的烧杯中，加入PBS液使其终体积为100ml，搅拌充分溶解后，滤过除菌，无菌条件下分装，4℃冰箱保存。6、L-谷氨酰胺补充液：称取谷氨酰胺2.922g，放入100ml的烧杯中，加入PBS液使其终体积为100ml，搅拌充分溶解后，过滤除菌，无菌条件下分装，4℃冰箱保存。RPMI-1640培养液在配制2周后应补加谷氨酰胺。7、细胞冻存液：50％RPMI-1640培养液+40％胎牛血清+10％DMSO，过滤除菌后低温避光保存。8、十二烷基磺酸钠溶液：称取十二烷基磺酸钠10g，加入双蒸水至终体积为100ml，再加入1ml0.01％盐酸，搅拌使其充分溶解，4℃冰箱保存。9、MTT：称取MTT50mg，10mlPBS液使其充分溶解，使其质量浓度为5mg/ml，无菌条件下过滤分装，4℃冰箱保存，两周内有效。注意配制及保存均应避光。10、RPMI-1640完全培养液：由90mlRPMI-1640+10ml胎牛血清+2ml100U/ml青链霉素溶液组成。二、试验方法1、细胞培养1.1细胞复苏将冻存管迅速从液氮中取出后立即放入37℃温水中，轻轻晃动冻存管，使冻存物尽快溶解，将其放入超净工作台中，将其内的细胞悬液移入离心管，再向离心管中加入10倍RPMI-1640培养液(含10％小牛血清)，离心，800rpm/min，离心5～10min，弃上清，细胞沉淀中加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，轻摇均匀，置37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养。并注明细胞名称及日期。1.2细胞传代培养待SKOV3细胞长至80～90％培养瓶时，弃去原有的培养液，并用配好的PBS洗两遍；用0.25％的胰酶消化，放在倒置显微镜下观察，当见细胞回缩、细胞间隙增大、形态变圆时弃去消化液，加入一定量的培养液中和胰酶消化液，并用吸管轻轻吹打已经消化过的细胞.，使其脱离培养瓶，800rpm/min离心5min，弃上清；显微镜下在计数板上进行细胞计数，按1:3比例传代，分装至培养瓶中，再次补充适量培养液后继续培养。注意严格无菌操作，每天观察细胞生长情况。1.3细胞冻存取对数生长期的细胞以0.25％的胰蛋白酶消化后离心，PBS洗2次，在低速离心机上l000rpm离心5min，弃上清液，加入1mL于-20℃下预冷的含DMSO的细胞冻存液，用吸管吹打均匀后移入冻存管中，用封口膜封口标记后放入4℃静置30min，之后-20℃放置2h后转入-80℃。一个月内使用的细胞可保存于-80℃中，长期保存者24h后应由-80℃移入液氮中。细胞的复苏与冻存应遵循的原则为慢冻快融。2、四甲基偶氮蓝(MTT)实验(1)选择对数生长期的细胞(生长80～90％)时，用配好的0.25％胰酶将细胞消化好以后，轻轻地吹打制成单细胞悬液，调整的最终的细胞浓度为8×104/mL；(2)取3个96孔板，每个时间点1板，100μL/孔，每孔细胞数为104做好分组标志；(3)细胞贴壁后分组，设空白组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)、活性成分浸膏1～7组(终浓度80μg/L)；(4)37℃、5％CO2条件下分别培养24、48和72h；(5)时间到后，吸去上清液后每孔加5g/L的MTT10μL；(6)培养4h后加入10μLDMSO，在多功能微板测试系统上以490nm波长测定各孔光密度OD值；(7)药物对细胞抑制率的计算：抑制率(％)＝(对照组细胞数-实验组细胞数)/对照组细胞数×100％。实验至少重复三次。3、数据分析采用SPSS19.0的软件进行统计学的分析，以均数±标准差(X±s)来表示。采用单因素方差分析对计量资料进行比较，而组间两两比较采用LSD检验，率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。三、结果及结论1、MTT实验结果活性成分浸膏1～5组显著抑制人卵巢腺癌SKOV3细胞的增殖，活性成分浸膏6、7组抑制作用不明显。结果见下表。活性成分浸膏2、3的治疗效果分别与活性成分浸膏4、5相似。上述结果表明，本发明提供的中药复方可以抑制卵巢癌细胞增殖，可以开发成治疗卵巢癌的药物。抑制效果与复方中生药没药和陈皮重量份之比有关。实施例9：颗粒剂的制备按实施例1方法先制得活性成分浸膏，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。实施例10：片剂的制备按实施例1方法先制得活性成分浸膏，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。实施例11：注射液的制备按实施例1方法先制得活性成分浸膏，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。实施例12：口服液的制备按实施例1方法先制得活性成分浸膏，按常规口服液制法制成口服液。实施例13：胶囊剂的制备按实施例1方法先制得活性成分浸膏，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制成胶囊剂。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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