一种人干细胞来源的生物美容原料的制备方法及其产品与流程

本发明涉及一种制备人干细胞来源的生物美容原料的方法以及通过所述方法获得的人干细胞来源的生物美容产品。特别地，本发明涉及采用从培养人干细胞的培养液和裂解人干细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成人干细胞精华液，冷冻干燥后制备成冻干粉的生物美容原料，富含细胞生长成分，具有再生修复的功效，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，可用于皮肤皱纹、色斑和瘢痕等美容。

背景技术：

目前，各种化妆品主要以化学成分为主，再添加了一些植物提取精华素或者其他深海营养物质制备成的美容产品，对皮肤发挥保湿、美白和控油等作用。尽管这些化妆品含有一些营养物质，但因其有效成分含量和有效性等问题，在皮肤再生修复等方面还远远不足。

近年来，由于生物技术的发展，采用基因工程技术获得细胞因子基因重组载体，在大肠杆菌或酵母中发酵，大量获得相关细胞因子。作为营养因子添加到化妆品中或直接使用，在皮肤修复、再生和美白中起到一定效果。但由于这些细胞因子是在大肠杆菌或酵母等低等细胞中表达的，其缺少在哺乳动物细胞中的蛋白转录翻译后修饰，包括糖基化、甲基化和末端修饰等过程，其功能和生物活性受到很大限制。所以使用大肠杆菌或酵母中发酵制备的细胞因子应用在化妆品中，很多可能生物活性不高甚至无效，或者由于免疫原性问题皮肤造成过敏现象。

本发明采用人干细胞在无血清培养基连续培养下，这些人干细胞可天然地表达和分泌大量的细胞生长因子，人干细胞表达和分泌的蛋白具有良好的转录翻译后修饰，具有很好生物活性。这样一来，也避免了进行基因重组构建，人干细胞能表达和分泌大量天然的细胞因子，没有任何基因修饰而造成异源性免疫原性高的问题，这些细胞因子富含细胞生长相关的分子。综上所述，本发明利用人干细胞表达和分泌的细胞因子，通过裂解、浓缩和冷冻干燥后制备成成品，在生物学有效期内更好储存及时使用，将对皮肤皱纹、色斑和瘢痕等产生最佳的再生修复作用。

技术实现要素：

经过本发明科研人员长期人干细胞培养与美容应用的工作基础，为了对皮肤的皱纹、色斑和瘢痕等产生更好地再生修复等的作用，发现人干细胞表达和分泌的细胞生长因子产生很好的修复、再生和美白等作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过从培养人干细胞的培养液和裂解人干细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成人干细胞精华液，富含细胞生长因子成分，具有再生修复的功效。这些细胞生长因子主要包括：表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、类胰岛素生长因子1(insulin-like grouth factors-1，IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)和干细胞生长因子(stem cells factor，SCF)。特别是含有细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)和中性粒细胞胞浆因子2(neutrophil cytosolic factor 2，NCF-2)。

人干细胞分泌的细胞生长因子能够特异性地改善皮肤微循环，能促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性，保持皮肤内水分；通过促进肌肤内多种细胞的生长、分化，产生大量的新生细胞，来替代有色细胞；促进真皮层内纤维母细胞的增殖，修复老化的胶原纤维与弹性纤维；改善皮肤微循环，提供良好的营养环境，维持一定量的皮肤脂肪，还原肌肤弹性，使其均匀紧致，减少皱纹；促进细胞新陈代谢，促进细胞的增殖、分化，特别是干细胞。同时我们发现ICAM-1和NCF-2具有更好地促进皮肤成纤维细胞增殖和分化，表达胶原蛋白和弹性蛋白，改善皮肤肤质，特别是对皮肤瘢痕和疤痕具有很好修复作用。

本发明提供了一种培养人干细胞来源的生物美容原料的制备方法，其中，所述方法包括通过从培养人干细胞的培养液和裂解人干细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成人干细胞精华液，富含细胞生长因子成分；经冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在-80℃超低温冰箱保存，成为皮肤再生修复的生物美容原料。

本发明提供的人干细胞为废弃脐带来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)、废弃胎盘来源的间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞或内皮祖细胞和脂肪来源脂肪干细胞等，优选地，为废弃脐带和废弃胎盘来源的间充质干细胞。使用多层细胞培养器进行大规模传代培养，获得大量MSC细胞液和MSC细胞。

优选地，所述方法包括如下步骤，

(1)通过培养人干细胞获得干细胞和培养液；

(2)将干细胞裂解，加入到培养液获得蛋白悬液；

(3)将蛋白悬液经超浓缩后制备成浓缩液；

优选地，进一步包括

(4)将浓缩液制备成人干细胞精华液；

优选地，进一步包括

(5)将所述人干细胞精华液，经冷冻干燥后制备成冻干粉；其可长期在-80℃超低温冰箱保存；

其中，所述步骤(1)中使用MSC无血清培养基，优选其含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素；

所述浓缩液、干细胞精华液或所述冻干粉可为皮肤再生修复的生物美容原料；

其中，所述人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液或其浓缩液均富含如下细胞生长因子：表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、类胰岛素生长因子1(insulin-like grouth factors-1，IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)和干细胞生长因子(stem cells factor，SCF)，以及细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)和中性粒细胞胞浆因子2(neutrophil cytosolic factor 2，NCF-2)。

优选地，所述人干细胞来源废弃脐带和废弃胎盘，经剪碎成1mm³大小在MSC无血清培养基培养条件下，原代培养获得间充质干细胞，从第1代75cm²培养瓶增殖培养起始，传代到第2代225cm²培养瓶中，再到第3代1-4g/L微载体旋转生物反应器中100ml体系培养，，消化后放大培养再到第4代1-4g/L微载体旋转生物反应器中500ml体系培养，继续放大再到第5代1-4g/L微载体旋转生物反应器中2000ml体系培养，然后继续放大到第6代1-4g/L微载体旋转生物反应器中5000ml体系培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代间充质干细胞；

优选地，所述的MSC无血清培养基含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素，我们发现可以促进细胞生长因子的分泌和表达，提高细胞生长因子的含量，特别是促使了ICAM-1和NCF-2的表达。

培养获得人干细胞经超声破碎后高速低温离心，获得细胞裂解上清，与人间充质干细胞培养液混匀后浓缩，然后在冷冻干燥仪中冷冻干燥得到冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存。

优选地，本发明制备的人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：表皮生长因子含量超过10000pg/ml，碱性成纤维生长因子含量超过10000pg/ml，类胰岛素生长因子含量超过4000pg/ml，血管内皮生长因子含量超过4000pg/ml，血小板衍生生长因子含量超过7000pg/ml和干细胞生长因子含量超过2000pg/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过1000pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过2000pg/ml。

优选地，含人干细胞裂解液的培养液中表皮生长因子含量超过15ng/ml，碱性成纤维生长因子含量超过15ng/ml，类胰岛素生长因子含量超过6ng/ml，血管内皮生长因子含量超过8ng/ml，血小板衍生生长因子含量超过9ng/ml和干细胞生长因子含量超过5ng/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过3ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过5ng/ml。

优选地，浓缩液中表皮生长因子含量超过40ng/ml，碱性成纤维生长因子含量超过40ng/ml，类胰岛素生长因子含量超过10ng/ml，血管内皮生长因子含量超过20ng/ml，血小板衍生生长因子含量超过25ng/ml和干细胞生长因子含量超过10ng/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过6ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过10ng/ml。

优选地为选择含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液作为美容原料。

本发明提供的含人干细胞裂解液的培养液冻干粉，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，冻干粉加入溶媒或生理盐水溶解后，加入到面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。

本发明提供的一种人干细胞来源的再生修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：

1)5-50ml如上所述的含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液；

2)1张无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜等；

将面膜装入含浓缩液的锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。

本发明提供的一种人干细胞来源的再生修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：

取权利要求如上所述的含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液10ml，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

或取1瓶冻干粉用10ml溶媒进行溶解，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

通过本发明的方法，通过获取的人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有皱纹、色斑和瘢痕等除皱、祛斑和修复等美容作用。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道。

附图说明

图1表示由实施例2所制备人间充质干细胞的培养液、含裂解液的培养液以及浓缩液中各细胞因子表达和分泌水平图

图2表示由实施例4所制备间充质干细胞精华液对面部瘢痕受试者使用前后变化图

具体实施方式

本发明提供了一种培养人干细胞来源的生物美容原料的制备方法，其中，所述方法包括通过从培养人干细胞的培养液和裂解人干细胞获得的蛋白悬液，经超浓缩后制备成人干细胞精华液，富含细胞生长因子成分；经冷冻干燥后制备成冻干粉，可以长期在-80℃超低温冰箱保存，成为皮肤再生修复的生物美容原料。

所述人干细胞为废弃脐带来源间充质干细胞、废弃胎盘来源的间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞或内皮祖细胞和脂肪来源脂肪干细胞等，优选地，为废弃脐带和废弃胎盘来源的间充质干细胞，使用多层细胞培养器进行大规模传代培养，获得大量MSC细胞液和MSC细胞。

所述人间充质干细胞来源废弃脐带和废弃胎盘，经剪碎成1mm³大小在10ml MSC无血清培养基(含50μg/ml氢化可地松、10μg/ml抗坏血酸和50μg/ml人胰岛素)中，37℃、5％CO2培养箱中原代培养获得间充质干细胞，再进行传代培养。使用1-100ml 0.25％胰酶(0.02％EDTA)消化，从第1代10ml 75cm²培养瓶增殖培养起始，传代到第2代20ml 225cm²培养瓶中，再到第3代1-4g/L微载体旋转生物反应器中100ml体系培养，消化后放大培养再到第4代1-4g/L微载体旋转生物反应器中500ml体系培养，继续放大再到第5代1-4g/L微载体旋转生物反应器中2000ml体系培养，然后继续放大到第6代1-4g/L微载体旋转生物反应器中5000ml体系培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代间充质干细胞；放大培养共收集其培养液约7.63L；并获得第6代间充质干细胞，约7.4×10⁹细胞。

一次处理人脐带可获得50个以上的原代间充质干细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过350L MSC细胞培养液，MSC细胞数超过37×10¹⁰个。

本发明使用的细胞培养基为MSC无血清培养基，如AMMS-MSC、Mesen Gro和MGro-500等商品化产品。

优选地，所述的MSC无血清培养基含0.1-200μg/ml氢化可地松、1-500μg/ml抗坏血酸和1-1000μg/ml人胰岛素。

本发明使用微载体为商品化产品，如美国GE公司、美国赛默飞公司和上海谷岩有限公司等，包括Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline，可以用于传代大规模贴壁细胞在旋转生物反应器放大培养使用。

将获得人间充质干细胞进行计数，取10⁹细胞加入1-10ml 1×PBS(pH＝7.4)混匀后并加入0.1-5ug蛋白酶抑制剂，放置于冰上在超声破碎仪中破碎3-10分钟，高速15000转每分种(rpm)离心20min，取上清加入到1L培养过人间充质干细胞的培养液中。再将该人间充质干细胞裂解液的培养液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩1-10倍，获得100ml-500ml浓缩液。

取1-5ml浓缩液加入到西林瓶中，在冷冻干燥仪中冷冻干燥得到冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存，制备成美容化妆品原料。

本发明制备的人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液及其浓缩液经酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒检测富含细胞生长因子，即：表皮生长因子含量超过10000pg/ml，碱性成纤维生长因子含量超过10000pg/ml，类胰岛素生长因子含量超过4000pg/ml，血管内皮生长因子含量超过4000pg/ml，血小板衍生生长因子含量超过7000pg/ml和干细胞生长因子含量超过2000pg/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过1000pg/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过2000pg/ml。

含人干细胞裂解液的培养液中表皮生长因子含量超过15ng/ml，碱性成纤维生长因子含量超过15ng/ml，类胰岛素生长因子含量超过6ng/ml，血管内皮生长因子含量超过8ng/ml，血小板衍生生长因子含量超过9ng/ml和干细胞生长因子含量超过5ng/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过3ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过5ng/ml。

浓缩液中表皮生长因子含量超过40ng/ml，碱性成纤维生长因子含量超过40ng/ml，类胰岛素生长因子含量超过10ng/ml，血管内皮生长因子含量超过20ng/ml，血小板衍生生长因子含量超过25ng/ml和干细胞生长因子含量超过10ng/ml；以及细胞间粘附分子-1含量超过6ng/ml和中性粒细胞胞浆因子2含量超过10ng/ml。

优选地为选择含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液作为美容原料。

本发明提供的含人干细胞裂解液的培养液冻干粉，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，即取1瓶冻干粉加入1ml溶媒或生理盐水溶解后，加入到50ml面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。

本发明提供的一种人干细胞来源的再生修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：

1)5-50ml如上所述的含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液；

2)1张无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜等；

将面膜装入含10ml浓缩液的锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。

本发明提供的一种人干细胞来源的再生修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：

取如上所述的含人干细胞裂解液的培养液的浓缩液10ml，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

或取1瓶冻干粉用10ml溶媒进行溶解，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

本发明提供了通过获取的人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有除皱、祛斑、填充和修复等美容作用。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道，将产生更佳的美容疗效。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1 人间充质干细胞的培养

收集废弃人脐带，经剪碎成1mm³大小在10ml Mesen Gro无血清培养基(含含50μg/ml氢化可地松、10μg/ml抗坏血酸和50μg/ml人胰岛素)中，37℃、5％CO2培养箱中原代培养获得间充质干细胞，再进行传代培养。

通过0.25％胰酶(0.02％EDTA)消化，从第1代10ml 75cm²培养瓶增殖培养起始，传代到第2代20ml 225cm²培养瓶中，再到第3代2g/L微载体旋转生物反应器中100ml体系培养，消化后放大培养再到第4代2g/L微载体旋转生物反应器中500ml体系培养，继续放大再到第5代2g/L微载体旋转生物反应器中2000ml体系培养，然后继续放大到第6代2g/L微载体旋转生物反应器中5000ml体系培养，每次传代培养收集其培养液并获得第6代间充质干细胞；放大培养共收集其培养液约7.63L；并获得第6代间充质干细胞，约7.4×10⁹细胞。

一次处理人脐带可获得50个以上的原代间充质干细胞，通过上述大规模传代培养后可获得超过350L MSC细胞培养液，MSC细胞数超过37×10¹⁰个。

实施例2 人间充质干细胞来源美容原料制备

取实施例1中获得的2×10⁹人间充质干细胞分别加入10ml 1×PBS(pH＝7.4)混匀后并加入1ug蛋白酶抑制剂(大连宝生物公司)，放置于冰上在超声破碎仪(美国热电公司)中破碎8分钟，高速15000转rpm离心20min，取上清加入到培养过人间充质干细胞的培养液中。

将含人间充质干细胞裂解液的培养液加入到500分子量的透析袋(美国光谱公司)中，放置冰箱冷藏中进行透析浓缩，体积浓缩5倍。

另外，也可以将含人间充质干细胞裂解液的培养液使用500分子量的醋酸纤维素膜(美国光谱公司)进行超滤浓缩，体积浓缩5倍。

人间充质干细胞浓缩后获得10L浓缩液，取5ml人间充质干细胞浓缩液加入到西林瓶中，在冷冻干燥仪(美国热电公司)中冷冻干燥得到冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存，制备成美容化妆品原料。

实施例3 人间充质干细胞中细胞因子表达与分泌水平检测

取实施例1中制备的人间充质干细胞培养液、含人间充质干细胞裂解液的培养液及其浓缩液经ELISA试剂盒(美国R&D系统公司)检测其中细胞因子表达和分泌水平，使用步骤参照使用说明书，均以与未培养过人间充质干细胞的Mesen Gro培养基做空白对照。表1中为人间充质干细胞的培养液、含人间充质干细胞裂解液的培养液和浓缩液中各细胞因子表达和分泌水平，所述单位为ng/ml。

表1

表1中显示人间充质干细胞的培养液、含裂解液的培养液以及浓缩液中均分泌高水平的细胞生长因子，其中细胞浓缩液中进一步提高了细胞因子浓度，将更有助于这些细胞因子在皮肤美容方面将发挥再生修复的作用。特别发现在细胞培养液和细胞裂解液中均高表达细胞生长因子ICAM-1和NCF-2，其在功能上具有促进细胞增殖和皮肤修复的作用。

图1为人间充质干细胞的培养液、含裂解液的培养液以及浓缩液中各细胞因子表达和分泌水平图，与原始Mesen Gro培养基相比，人间充质干细胞具有很好的细胞因子分泌水平，添加人MSC细胞裂解液和浓缩后提高了培养液中细胞因子浓度水平。

实施例4 制备人间充质干细胞培养液的美容产品

制备人间充质干细胞来源的再生修复美容面膜，如下成分组成：

1)10ml实施例2制备的含人间充质干细胞裂解液的培养液的浓缩液；

2)1张水凝胶膜；

将面膜装入含10ml浓缩液的锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

制备人间充质干细胞来源的再生修复美容精华液，由如下成分组成：

取实施例2制备的含人间充质干细胞裂解液的培养液的浓缩液10ml，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

或取实施例2制备的1瓶冻干粉用10ml溶媒进行溶解，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤再生修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

实施例5 人间充质干细胞美容精华液

招募10名面部有皱纹较深、有色斑和瘢痕的受试者(签署知情同意书)，每天早上和完善睡觉前，用洁面露洗脸，略干后涂抹或喷洒实施例4中制备的人间充质干细胞美容精华液，连续使用14天时间。

全部受试者中面部皱纹变浅变细，有色斑者变浅或部分消失，有瘢痕者得到很好的填充变平，全部受试者面部皮肤变白细润，图2中其中面部瘢痕受试者使用前后变化图，A为使用人间充质干细胞美容精华液前的图片，B为人间充质干细胞美容精华液使用14天后的图片；可以发现其瘢痕得到很好的改善，瘢痕变浅，皮肤变得光滑、变白和细润。