本发明是关于一种用作美白皮肤与抗皮肤老化的蝴蝶兰萃取物，尤其是关于一种能够抑制酪氨酸酶活性及具抗氧化活性的蝴蝶兰萃取物。
背景技术：
在现今社会物质生活愈来愈富足的情况下，现代人除了满足实质生理上的温饱外，对于个人外在的形象也愈来愈重视，从医美诊所如雨后春笋般地开设以及整形风潮的盛行下可窥见此潮流趋势。然而，关于个人外在的显现，除了身材的比例或尺寸、头发的多寡或发色外，最被人用以判定年轻与否或保养适当与否的一大标准就是皮肤的健康状况与色泽。具有美白透晰、弹性而带有些许光泽的紧致皮肤，一直是医美业者所标榜的美容目标，更是消费者期待自己达成的愿望。
皮肤组织实质上最重要的功能在于它是身体抵御外来物质最重要的屏障之一，可保护身体免于细菌、病毒等致病菌与有毒物质的入侵，亦可保持人体水分与体温维持在一定的标准。然而当皮肤暴露在阳光或其他光源的紫外线下，或是其他游离辐射或挥发性物质中时，会促使皮肤生成活性氧与自由基。当活性氧与自由基累积的数目超出个体所能承受的抗氧化能力时，就会开始与细胞内的DNA、蛋白质或脂质等产生反应，并使皮肤产生不良的变化，例如促进黑色素生成(melanogenesis)、造成皮肤的老化等(请参见Kim YJ,Yokozawa T.,Modulation of oxidative stress and melanogenesis by proanthocyanidins.Biol Pharm Bull.2009Jul；32(7):1155-9,2009)。
关于黑色素(Melanin)，其是由黑色素细胞所制造，而这些细胞位于表皮层的基底细胞之间。黑色素细胞合成黑色素颗粒后，分泌释放黑色素，使人体有不同的肤色。当皮肤被阳光/紫外线照射时(特别是受紫外线-B照射时)，角质细胞中所生成的活性氧与自由基会诱发肿瘤蛋白53(p53)表现，经过一连串的反应，促进了「酪氨酸酶」(tyrosinase)的大量表现，大量的酪氨酸酶则加速催化细胞内的酪氨酸(tyrosine)，使其氧化为二羟基苯基丙胺酸(dihydroxyphenylalanine，简称DOPA)，而二羟基苯基丙胺酸再经过酪氨酸酶催化反应成为多巴醌(dopachrome)，多巴醌最后经由氧化反应转变为黑色素。因此，人体皮肤除原有肤色外，透过紫外光等光源的照射后，将因为黑色素的生成而使皮肤变得较黑。
另一方面，同样因为紫外线照射时所生成的活性氧与自由基，会促进转录因子活化蛋白(AP1)的形成，而诱发一系列基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases)的表现，进而促进胶原蛋白、弹性蛋白及蛋白多醣的降解，导致皮肤变薄、萎缩、弹性组织变性、弹性变差、干燥、粗糙、产生皱纹、雀斑、斑点等皮肤老化现象。
鉴于上述黑色素形成的作用机转以及皮肤老化的因素，产学界莫不欲找出可控制或影响其代谢过程的化合物，以根本解决皮肤变黑与老化的问题。
目前虽然已有利用蝴蝶兰萃取物制作美容用品的创作，但关于该些萃取物的效用仍然局限于某种效用，亦即，利用目前已知方法所萃取出的萃取物，其中的有效成分比例可能不高或不平均，因此，尚未出现能够含有同时兼具美白抗老化，且具有极佳改善效果的萃取物成分的发明。
技术实现要素：
本发明的目的的一在于提供一种能够抑制与黑色素生成有关的酪氨酸酶活性的蝴蝶兰萃取物，藉由该萃取物对酪氨酸酶的抑制效果，使酪氨酸无法进行黑色素生成的代谢途径，因而能够避免皮肤变黑而具有美白皮肤的效果。
为了达成前述的目的，本发明实施例提供一种蝴蝶兰萃取物，其由包括以下步骤的方法所制备：(a)提供蝴蝶兰(Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’)的花瓣、花梗或花瓣与花梗相混合的待萃取物；(b)将该待萃取物与95％(v/v)乙醇以1:20～1:5重量比混合形成混合物后，静置20～30小时以进行萃取；以及(c)过滤该混合物，以获得醇溶性蝴蝶兰萃取物。
在一实施例中，所述的蝴蝶兰萃取物，其中该步骤(b)中该待萃取物与95％(v/v)乙醇的重量比较佳可为1:10。
在另一实施例中，本发明提供一种用于美白皮肤的组成物，其包括前述的蝴蝶兰萃取物，以及载剂。
为进一步提供具有抗氧化活性的蝴蝶兰萃取物，达到抗皮肤老化的目的，在本发明的一实施例中，提供一种能够用作美白皮肤与抗皮肤老化的蝴蝶兰萃取物，其由包括以下步骤的方法所制备：(a)提供蝴蝶兰(Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’)的花瓣作为待萃取物；(b)将该待萃取物与95％(v/v)乙醇以1:20～1:5重量比混合形成混合物后；(c)将该混合物于55～65℃下加热10～20分钟后，静置20～30小时以进行萃取；以及(d)过滤该步骤(c)中经加热并静置的该混合物，以获得醇溶性蝴蝶兰萃取物。
在一实施例中，前述的蝴蝶兰萃取物，其中该步骤(b)中该待萃取物与95％(v/v)乙醇的重量比较佳可为1:10。
在一实施例中，前述的蝴蝶兰萃取物，其中该步骤(c)中该加热时间较佳可为15分钟。
在另一实施例中，本发明提供一种用于美白皮肤的组成物，其包括前述的蝴蝶兰萃取物，以及载剂。其中，该组成物可具有抑制酪氨酸酶的活性。
在另一实施例中，本发明提供一种用于抗皮肤老化的组成物，其包括前述的蝴蝶兰萃取物，以及载剂。其中，该组成物可具有抗氧化的活性。
藉由本发明实施例中蝴蝶兰萃取物抑制酪氨酸酶的特性以及抗氧化功能，可大幅阻断皮肤黑色素的生成，同时具有减缓皮肤老化的效果，可普遍应用于保养品或化妆品中。无论是作为美白皮肤的组成物或抗皮肤老化的组成物，除包括所述的蝴蝶兰萃取物外，可进一步包括制造该些保养品或化妆品所需的载剂或佐剂，例如：活性剂、防腐剂、螯合剂、增稠剂、界面活性剂、染色剂，并根据其产品类型，可制备成水性溶液、水-醇溶液、油性溶液、凝胶、乳霜、乳液、软膏、粉末，或是附着于一介质上例如面膜、贴片或贴布。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
具体实施方式
实施例1 蝴蝶兰萃取物的制备
首先，自市面购置商品名为V3的蝴蝶兰，其中文学名为大白花蝴蝶兰，英文学名则为Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’。摘取其花瓣，并同时将花梗切断以适当长度后，以无菌水清洗数次，再置入设定为45～60℃的烘箱进行干燥后备用。
本实施例以下将同时进行多种萃取方式，比较并找出具有较佳效果萃取物的萃取条件。
(1)水萃取
取前述干燥后蝴蝶兰花瓣或花梗部作为待萃取物，以1:10的重量比加入纯水，搅拌混合后形成混合物，将该混合物加热至100℃反应90分钟以进行萃取。之后将该进行萃取后的混合物以孔径6μm的滤纸进行过滤，取得水溶性蝴蝶兰萃取物溶液。
(2)水萃取后进行醇萃取
将前述(1)经水萃取后的蝴蝶兰花瓣或花梗部再次作为待萃取物，进一步进行醇萃取。将此待萃取物以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，搅拌混合后形成混合物，于室温下静置24小时进行萃取。之后将该进行萃取后的混合物以孔径6μm的滤纸进行过滤，取得经水萃取后的醇溶性蝴蝶兰萃取物溶液。
(3)醇萃取
取前述干燥后蝴蝶兰花瓣或花梗部作为待萃取物，以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，搅拌混合后形成一混合物，于室温下静置24小时进行萃取。之后将该进行萃取后的混合物以孔径6μm的滤纸进行过滤，取得醇溶性蝴蝶兰萃取物溶液。
(4)醇配合加热萃取
取前述干燥后蝴蝶兰花瓣或花梗部作为待萃取物，以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，搅拌混合后形成混合物，于60℃下加热15分钟后，再于室温下静置24小时进行萃取。之后将该进行萃取后的混合物以孔径6μm的滤纸进行过滤，取得醇溶性蝴蝶兰萃取物溶液。
前述(1)～(4)萃取后的水溶性或醇溶性蝴蝶兰萃取物溶液，以冷冻干燥机/减压浓缩机或其他相类的干燥方式进行干燥，以获得粉末状的蝴蝶兰萃取物。
实施例2 体外酪氨酸酶活性试验
将前述粉末状的蝴蝶兰萃取物加入ddH2O，配置成浓度为10％(w/v)的待测样品溶液备用。取200μl配制好的待测样品溶液与800μl 0.1M的磷酸缓冲溶液(pH 6.8)，注入微量管中。控制组则以等体积0.1M磷酸缓冲溶液取代待测样品溶液。之后，分别取100μl 70unit/ml的蘑菇酪氨酸酶加入所有待测样品溶液与控制组的微量管中，最后再加入900μl 25mM的L-DOPA，将溶液充分混合均匀后，于37℃下反应30分钟。反应完成后以分光光度计测定405nm波长下的吸光值，其结果如表一所示。
若待测样品中具有抑制酪氨酸酶的成分，则原本借助酪氨酸酶催化L-DOPA以产生多巴醌的反应将不易进行，也就是说，多巴醌的产物会减少。因此，通过吸光值的判定，当405nm波长下的吸光值愈低者，表示待测样品的抑制酪氨酸酶的能力愈强。于此，关于其抑制能力将以抑制率表示，亦即，抑制百分比愈高表示待测样品的抑制酪氨酸酶能力愈佳。其中，抑制率(％)＝[1-(待测样品于405nm的吸光值/控制组于405nm的吸光值)]x 100。
表一
由表一的结果可以发现，经由水萃取的蝴蝶兰花瓣萃取物，并不具有抑制酪氨酸酶的能力，而将该待测样品于水萃取后再进行醇萃取所获得的萃取物则具有高达65.00％的抑制率，对照抑制率最高的醇萃取方式(抑制率为65.38％)，可推论蝴蝶兰萃取物中具抑制酪氨酸酶物质应是醇溶性。此外，于醇萃取过程中加入加热步骤后，其抑制率有稍微下降至58.65％，因此，以单纯经醇萃取步骤所获得的萃取物有最高的酪氨酸酶抑制率，而于醇萃取过程中加入加热步骤所获得的萃取物则具有次高的酪氨酸酶抑制率。
无论是以醇萃取方式所获得高酪氨酸酶抑制率的蝴蝶兰萃取物(抑制率高达65.38％)，或于醇萃取过程中加入加热步骤所获得的蝴蝶兰萃取物(抑制率为58.65％)，相较于目前已知其他花种花瓣的抑制率普遍低于50％的情况下，藉由本发明萃取方法所萃取出的蝴蝶兰萃取物确实具有显然高于预期抑制率的功效。
于醇萃取的实施例方法中，待萃取物与95％(v/v)乙醇的混合比例可为1:20～1:5之间，较佳为1:10，而其萃取时间则可在20～30小时的范围内，以24小时为较佳。此外，在醇萃取过程中加入加热步骤的实施例方法中，其加热温度可于55～65℃范围内，较佳为60℃，加热时间则可为10～20分钟，较佳为15分钟，萃取时间可为20～30小时，较佳24为小时。
另一方面，当以蝴蝶兰的花梗进行萃取时，有着与利用花瓣萃取相近的效果趋势。同样地，经水萃取的蝴蝶兰花梗萃取物，仅具有极低的抑制酪氨酸酶的能力，但将该待测样品以醇萃取后所获得的萃取物则具有高达61.92％的抑制率。虽然于醇萃取过程中加入加热步骤后，其抑制率有稍微下降，但仍高达60.19％，因此，以单纯经醇萃取步骤所获得的蝴蝶兰花梗的萃取物有最高的酪氨酸酶抑制率，而于醇萃取过程中加入加热步骤所获得的萃取物则具有次高的酪氨酸酶抑制率。
由以上结果可知，为获得高酪氨酸酶抑制率的蝴蝶兰萃取物，除可利用花瓣外亦可从花梗获得，因此萃取时可选用花瓣、花梗或二者的混合进行萃取。
实施例3抗氧化力试验
关于抗氧化力的测试于本实施例中是以蝴蝶兰萃取物清除α,α-二苯–β–味基胼基(α,α-diphenyl–β–picrylhydrazyl,DPPH)自由基的能力评估其抗氧化能力。
取0.2ml不同浓度的待测样品溶液，加入1.8ml新鲜配制的0.1mM DPPH甲醇溶液，振荡混合均匀后，于避光环境下置于室温下反应30分钟，之后以分光亮度计检测517nm波长下的吸光值。控制组则以等体积0.1mM DPPH乙醇溶液取代待测样品溶液后进行前述相同的反应试验，其结果如表二所示。
由于具抗氧化力的物质会提供氢予DPPH自由基，使氧化链锁反应受到抑制，因此，供氢能力越强，吸光值会因为DPPH被还原而愈低，亦即具有较佳的抗氧化能力。于此，关于抗氧化能力将以DPPH自由基清除率表示，即清除百分比愈高表示待测样品的供氢能力愈佳，抗氧化力也愈强。其中，清除率(scavenging effect％)＝[1-(待测样品于517nm的吸光值/控制组于517nm的吸光值)]x 100。
表二
由表二的结果可知，将蝴蝶兰花瓣待测样品于水萃取后再进行醇萃取所获得的萃取物仅有25.73％的清除率，而以醇萃取方式者清除率提高为54.98％，但于醇萃取过程中加入加热步骤的方法中，其清除率大幅提升至60.77％，因此，于醇萃取过程中加入加热步骤所获得的蝴蝶兰花瓣萃取物有最高的自由基清除率，而以单纯经醇萃取步骤所获得的萃取物则具有次高的自由基清除率。
于醇萃取的实施例方法中，待萃取物与95％(v/v)乙醇的混合比例可为1:20～1:5之间，较佳为1:10，而其萃取时间则可在20～30小时的范围内，以24小时为较佳。此外，在醇萃取过程中加入加热步骤的实施例方法中，其加热温度可于55～65℃范围内，较佳为60℃，加热时间则可为10～20分钟，较佳为15分钟，萃取时间可为20～30小时，较佳24为小时。
对照表一与表二可知，若欲使蝴蝶兰萃取物同时具有较佳的酪氨酸酶抑制率与自由基清除率，可以醇萃取方式获得，若欲取得更高自由基清除率的萃取物，则可以醇萃取过程中加入加热步骤的方法进行。
藉由本发明实施例经醇萃取或醇萃取过程中加入加热步骤方法所萃取的蝴蝶兰萃取物，因为具有极高的酪氨酸酶抑制活性，因而可抑制黑色素的形成，除可利用于美白皮肤外，也可避免皮肤进一步的变黑，而有维持皮肤肤色的功效。同时，其亦具有极佳的自由基清除率，因此具备优异的抗氧化效果，除可避免黑色素形成路径中酪氨酸的形成而同时有减缓皮肤变黑的效果外，亦因可去除自由基，降低了转录因子活化蛋白(AP1)的形成与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases)的表现，因而可改善皮肤变薄、萎缩、弹性组织变性、弹性变差、干燥、粗糙、产生皱纹、雀斑、斑点等老化现象。
藉由本发明实施例所萃取的蝴蝶兰萃取物，可普遍应用于保养品或化妆品中，作为美白皮肤的组成物或抗皮肤老化的组成物，或是将该组成物附着于一介质上例如面膜、贴片或贴布等，用于皮肤保养或美白。