本发明涉及疫苗生产制备领域，尤其涉及联合疫苗，具体是指一种肺炎球菌-百白破联合疫苗。
背景技术：
：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)简称肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌荚膜糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。但肺炎球菌荚膜糖为胸腺非依赖性抗原(Thymusindependentantigen，TI-Ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无T淋巴细胞辅助的情况下直接与B淋巴细胞表面的IgM受体交联，所诱导的抗体主要为IgM和IgG2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。荚膜糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对荚膜糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对荚膜糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需要加入多种化学试剂参与反应，并且荚膜糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。百白破疫苗是我国现行的免疫规划程序规定的针次最多、使用最广泛的疫苗，包括无细胞百白破及全细胞百白破两种联合疫苗，近年来无细胞百白破联合疫苗由于其良好的免疫原性和安全性取代了全细胞百白破联合疫苗而广泛用于儿童的预防接种，已被纳入许多国家的常规免疫计划中。但百白破疫苗由于其疫苗本身的性质导致其具有多种副作用，难以与其他疫苗进一步联合使用。赛诺菲巴斯德公司生产的五联疫苗一度成为免疫学历史上的新高度，其中包括百白破疫苗及脊髓灰质炎病毒及b型流感嗜血杆菌荚膜糖。肺炎球菌蛋白疫苗已成为近十年来肺炎疫苗的研发主流，具有种属特异性抗原为基础的疫苗广受研发人员的重视，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的结构及理化性质的限制，很多肺炎球菌蛋白无法直接用于人体免疫，需要花费大量的人力和物力进行研究及临床验证。蛋白疫苗利用生物工程技术合成蛋白抗原，蛋白抗原由于其选用的均为高度保守的肺炎球菌特异性蛋白，从而消除了不同血清型之间的免疫差异，并且由于不需要其他类型的通用蛋白载体，消除了现有的肺炎球菌疫苗不能与通用载体蛋白同类型的疫苗同时联合使用的障碍；其蛋白抗原本身也可以作为载体蛋白与肺炎球菌荚膜糖进行自发性缀合，因此免疫效果更好，实现了特异性免疫与广泛免疫的联合实现。肺炎球菌由于其血清型多，导致其抗原本身的抗原结构大稳定性差，难以与其他疫苗联合共存使用，并且现有的肺炎球菌荚膜糖蛋白结合疫苗均用白喉或破伤风类毒素作为蛋白载体，这种疫苗的主要成分为血清型特异性的荚膜糖，对未包含在疫苗内的其他血清型肺炎球菌感染无效，即缺乏交叉免疫保护效果；并将与已在儿童常规免疫接种中使用的白喉及破伤风疫苗产生干扰，破坏现有的免疫效果。故不以肺炎球菌自身的蛋白抗原作为蛋白载体，肺炎球菌与破伤风疫苗基本上不可能联合使用，而这四种抗原所引起的疾病类型有很多的重叠并且在很多情况下会相互影响，在接种一种疫苗并间隔很长一段时间后才可以接种第二种疫苗会制约疾病的免疫效果，延误病情或错过最佳治疗时机。因此研究一款自身免疫原性够好能够稳定存在并能与百白破疫苗联合起效的肺炎球菌-百白破联合疫苗成为了疫苗研发领域的当务之急。技术实现要素：本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够实现四种疾病同时预防的肺炎球菌-百白破联合疫苗。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的肺炎球菌-百白破联合疫苗，包括肺炎球菌疫苗和百白破疫苗，具体为：a.肺炎球菌疫苗为肺炎球菌荚膜糖PS与肺炎球菌蛋白结合物；b.百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗；其中：肺炎球菌蛋白为肺炎球菌表达的高保守性并具有免疫原性的蛋白，与具有免疫原性的肺炎球菌荚膜糖自发缀合；无细胞百日咳疫苗为百日咳疫苗原液、白喉类疫苗为白喉类毒素和破伤风类疫苗为破伤风类毒素，且百白破疫苗为悬混液。肺炎球菌荚膜糖的血清型中包括：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和/或33F；更优选地肺炎球菌荚膜糖的血清型中包括：4、6B、9V、14、18C、19F和23F。肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白的每种血清型与蛋白之间的质量比为1.5～4.5:1，优选地质量比为2:1。肺炎球菌蛋白包括：肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物，优选地为肺炎球菌溶血蛋白Ply、改性肺炎球菌溶血蛋白ΔA146Ply、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyD1、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyDB、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyDT；肺炎球菌表面蛋白及其改性衍生物，优选地为肺炎球菌表面蛋白C；肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物，优选地为肺炎球菌表面黏附蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白C；肺炎球菌三组氨酸蛋白家族及其改性衍生物，优选地为肺炎球菌三组氨酸蛋白D和/或肺炎球菌黏附毒力因子，优选地为肺炎球菌黏附毒力因子A。肺炎球菌-百白破联合疫苗还包括蔗糖，用于作为肺炎球菌疫苗的冻干制剂的冻干保护剂。优选地，蔗糖的初始浓度不小于60％，优选为大于70％。优选地，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为不大于20％；较佳地，为4～20％；作为一种较佳的实施方式，根据所需制备的疫苗的不同为7～10％、8～10％、10～15％或12～15％；最佳为7％、8％、10％或12％。优选地，蔗糖选用工业级分析纯或药用级。作为一种优选的实施方式，肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白的结合物包括：血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F与蛋白ΔA146Ply结合物。优选地，肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白的结合物为冻干制剂，冻干保护剂为蔗糖。优选地，肺炎球菌多疫苗的血清抗体水平≥0.35μg/mL。优选地，无细胞百日咳疫苗效价≥4.0IU；白喉疫苗效价≥30IU；破伤风疫苗效价≥40IU。优选地，联合疫苗在临用前将百白破悬混液加入肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物冻干制剂中，将肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合体复溶，混合均匀后肌肉注射。作为一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F与肺炎球菌蛋白ΔA146Ply结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。作为另一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F与肺炎球菌蛋白PsaA结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。本申请的另一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F与肺炎球菌蛋白ΔA146Ply结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。本申请的另一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F与肺炎球菌蛋白PlyDT结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。本申请的另一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F与肺炎球菌蛋白ΔA146Ply结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。本申请的另一种优选的实施方式，本发明的联合疫苗为：包括由肺炎球菌荚膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F与肺炎球菌蛋白PsaA结合物组成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括无细胞百日咳疫苗、白喉类疫苗和破伤风类疫苗，优选的肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白结合物采用单一组分的蔗糖作为冻干剂型的冻干保护剂，使用时百白破疫苗作为肺炎球菌疫苗的复溶剂。与现有技术相比，本发明首创的实现了可同时实现四种疾病免疫的肺炎球菌-百白破联合疫苗，其中肺炎球菌疫苗的蛋白-荚膜糖结合体可在不同的血清型间起到诱导交叉免疫保护作用；并且蛋白本身的作为毒力因子可诱导更强的免疫保护作用，对荚膜糖在免疫上起补充作用，从而增强了疫苗的免疫保护作用；同时肺炎球菌的自身蛋白可以避免与其他疫苗如白喉疫苗、破伤风疫苗在体内产生免疫冲突，使得本结合疫苗的实现成为了可能。本结合疫苗提高了接种者的肺炎球菌感染的免疫记忆应答；肺炎球菌蛋白的加入使得肺炎球菌的免疫需要依赖胸腺免疫，因此使得肺炎球菌的免疫实现了全年龄段及全部血清型的长效、全覆盖式免疫；肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白偶联之后提高了体内免疫应答的速度及扩展了其免疫的深度和广度，二者之间的协同作用虽然没有单独每种疫苗的效果好，但减少了接种次数，提高了接种效率，减轻了被接种者的身体负担。肺炎球菌与百白破疫苗的联合从源头上解决了一系列上呼吸道感染性疾病，随着肺炎球菌蛋白荚膜糖结合疫苗的不断发展，该联合疫苗具有广泛的推广和实用价值，对肺炎球菌及相关疫苗的研究有着深远的影响。具体实施方式为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。实施例1制备肺炎球菌疫苗原液1、制备肺炎球菌荚膜糖a.取现有的7价肺炎球菌的常见致病血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的肺炎球菌培养；b.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖4、9V、14、19F及23F，寡糖18C及多糖6B；c.肺炎球菌灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70％的)预冷乙醇，离心收集，得粗制荚膜糖；将粗制荚膜糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1：2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇搅拌(终浓度80％)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后得精制荚膜糖，置-20℃保存备用。2、肺炎球菌表达的高保守性并具有免疫原性的蛋白ΔA146Ply根据GenBank公布的Ply基因(序列登录号：X52474)，改性肺炎球菌溶血蛋白ΔA146Ply的设计引物序列如下：引物序列(5’-3’)F-ΔA146Ply-NGGAATTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATR-ΔA146Ply-NCGAGCTCGTCATTTTCTACCTTATCCTCTF-ΔA146Ply-CCGGCGGCCGCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGR-ΔA146Ply-CCCCTCGAGTTACTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT其中划线部分为相应的限制性内切酶酶切位点。根据常规实验方法将ΔA146Ply基因PCR扩增后，1％凝胶电泳，回收目标DNA片段，将目标DNA片段连接入pET-28a质粒中，在大肠杆菌感受态细胞BL21内转化抽提重组DNA质粒，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，确定表达量及表达形式后进行Ni-NTA树脂纯化；采用0.2％福尔马林溶液去除内毒素，即溶血活性，得到去除内毒素后的ΔA146Ply蛋白。ΔA146Ply蛋白为Ply蛋白第146位丙氨酸缺失的改性蛋白，蛋白纯度达到80％以上，检测证明具有免疫原性且残留的内毒素含量低于0.1EU/μg。3、制备肺炎球菌蛋白-荚膜糖结合体与本实施例中，采用氨基还原法将肺炎球菌表面蛋白与荚膜糖进行偶联，具体为将上述步骤获得的ΔA146Ply蛋白与多种荚膜糖以1：2～4质量比混合，以制备10mL疫苗原液为例，加入荚膜多糖4、9V、14、19F及23F各40μg，寡糖18C2μg及多糖6B80μg，ΔA146Ply蛋白160μg。经过凝胶层析柱纯化后测定荚膜糖含量。需要指出的是，由于肺炎球菌蛋白与肺炎球菌荚膜糖是同源的，因此二者之间具有协同作用，但本发明中的肺炎球菌蛋白与肺炎球菌荚膜糖之间的缀合不仅限于上述氨基还原法，只要是能实现该偶联结果的方法均应包括在本申请的发明范围中。4、制备百白破疫苗由于本发明中的联合疫苗以肺炎球菌疫苗与百白破疫苗减少相互影响，并且可以同时产生免疫为主要改进方向，故与本实施例中可采用现有技术制备百白破疫苗，具体方法在此不作赘述。但需要注意的是，本实施例中的百白破疫苗中无细胞百日咳疫苗效价≥4.0IU，白喉疫苗效价≥30IU且破伤风疫苗效价≥40IU，且优选为小水针剂型，其中含无细胞百日咳疫苗效价不低于4.0IU，白喉疫苗效价不低于30IU，破伤风疫苗效价不低于40IU。将上述分别获得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中华人民共和国药典》2010版中要求分别进行稳定性、免疫原性等疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。实施例2本实施例与实施例1的区别仅在于：肺炎球菌疫苗为冻干剂型，其中蔗糖作为冻干骨架，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到肺炎球菌荚膜糖-蛋白疫苗冻干制剂。故本实施例与实施例1的进一步不同在于，百白破疫苗可作为肺炎球菌冻干疫苗的复溶液，即临用前将百白破悬混液加入肺炎球菌冻干制剂中，复溶，混合均匀后肌肉注射。其中冻干步骤具体为：1.配制浓度为70％、经121℃灭菌处理15min的蔗糖母液；2.将实施例1所得分离纯化的肺炎球菌疫苗置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓度至10％，得混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；3.将步骤2所得半成品进行预冻，预冻时快速降温至-55℃，维持15h～20h；4.将步骤4所得预冻后半成品进行第一阶段干燥：升温至-45℃～-40℃维持50h，升温至-40℃～-33℃维持22h；5.将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥：设定不同时间内升温至0℃～30℃，不同升温阶段继续维持28h；再制备冻干原液中蔗糖浓度为10％的肺炎球菌疫苗，冻干疫苗的制备方法可参考现有技术制备，在此不做赘述。将上述分别获得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中华人民共和国药典》2010版中要求分别进行稳定性、免疫原性等疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。实施例3本实施例与实施例1的区别在于使用不同的肺炎球菌蛋白作为抗原及蛋白载体。本实施例中使用的蛋白载体为肺炎球菌表面黏附蛋白A(PsaA)。根据GenBank公布的PsaA基因(序列登录号：U53509)设计引物序列如下：引物序列(5’-3’)F-PasACATGCCATGGCTGCTAGCGGAAAAAAAGATR-PasACGCAAGCTTTTATTTTGCCAATCCTTCAG其中划线部分为相应的限制性内切酶酶切位点。根据常规实验方法将PsaA基因PCR扩增后，1％凝胶电泳，回收目标DNA片段，将目标DNA片段连接入pET-28a质粒中，在大肠杆菌感受态细胞BL21内转化抽提重组DNA质粒，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，确定表达量及表达形式后进行Ni-NTA树脂纯化；得到PsaA蛋白，测试浓度，蛋白纯度达到80％以上。将上述分别获得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中华人民共和国药典》2010版中要求分别进行稳定性、免疫原性等疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。实施例4本实施例与实施例3的区别仅在于：肺炎球菌疫苗为冻干剂型，其中蔗糖作为冻干骨架，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到肺炎球菌荚膜糖-蛋白疫苗冻干制剂。故本实施例与实施例3的进一步不同在于，百白破疫苗可作为肺炎球菌冻干疫苗的复溶液，即临用前将百白破悬混液加入肺炎球菌冻干制剂中，复溶，混合均匀后肌肉注射。具体的冻干步骤请参见实施例2。对比例1采用市售七价肺炎球菌荚膜糖-蛋白缀合疫苗(商品名：沛儿)作为对比例，其用量及使用方法同说明书，同上述各实施例所得疫苗一并进行疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。对比例2采用单蛋白作为对比例，具体制备方法见《粘膜免疫DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果及机制研究》，其用量及使用方法同临床数据，同上述各实施例所得疫苗一并进行疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。对比例3采用市售百白破作为对比例(商品名：吸附无细胞百白破联合疫苗)，其用量及使用方法同说明书，同上述各实施例所得疫苗一并进行疫苗效价评估实验，具体实验结果见后述。疫苗效价评估实验一、Western-blot分析肺炎球菌蛋白抗原性将抗ΔA146Ply、抗PsaA小鼠血清分别进行Western-blot分析，重组表达的ΔA146Ply蛋白、PsaA蛋白可与小鼠血清发生免疫原性结合，在ΔA146Ply蛋白在53-kDa附近见目的蛋白条带，PsaA蛋白在37-kDa附近见目的蛋白条带，表明表达的蛋白具有较好的抗原性，都保留了两种蛋白的抗原表位。二、稳定性液体肺炎球菌疫苗：4℃避光保存24个月，蛋白无变性，抗原性良好。冻干制剂肺炎球菌疫苗：-20℃避光保存24个月，蛋白无变性，抗原性良好。三、滴度评估1.肺炎球菌免疫原性评估以本发明所产生的肺炎球菌疫苗腹腔注射接种3周龄幼小鼠，接种沛儿组：第1、2、3组每只小鼠每次接种的结合疫苗中多糖含量分别为0.25μg、1.0μg、4.0μg，每次每只鼠注射量均为0.5ml，接种3次；接种完成后采血，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗PS荚膜糖19F的抗体IgG水平；接种肺炎球菌蛋白疫苗组：采用腹腔注射接种，每只小鼠均于3周龄时首种，第1组小鼠接种后l周腋动脉采血；第2组小鼠首种后l周复种1次，复种后1周腋动脉采血，；第3组小鼠首种后每隔l周复种l次，第3次接种后1周腋动脉采血；第1～3组每只小鼠每次接种的结合疫苗中含蛋白量为1μg，注射量为0.5ml；接种完成后采血，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗Ply蛋白的抗体IgG水平；肺炎球菌荚膜糖-蛋白结合物疫苗组：采用腹腔注射接种，每只小鼠均于3周龄时首种，第1组小鼠接种后l周腋动脉采血；第2组小鼠首种后l周复种1次，复种后1周腋动脉采血，；第3组小鼠首种后每隔l周复种l次，第3次接种后1周腋动脉采血；第1～3组每只小鼠每次接种的结合疫苗中含荚膜糖量为3μg，注射量为0.5ml，接种完成后用ELISA法检测小鼠血清中抗肺炎球菌荚膜糖PS及抗Ply的IgG抗体水平。小鼠血清中抗肺炎球菌荚膜糖PS及抗Ply的IgG抗体几何平均滴度GMT(OD450值)见下表1。表1：血清抗PS/抗Ply抗体IgGGMT第一组第二组第三组P值对比例118.0528.8536.09＜0.001对比例244.82107.51180.6＜0.001实施例132.25/36.2142.07/80.7172.41/138.3(0.001325)**实施例232.78/35.8841.85/80.0972.08/137.7(0.001019)**实施例331.72/36.0041.58/78.9672.33/137.9(0.001684)**实施例432.05/36.1141.93/80.3171.84/138.1(0.001101)**2.肺炎球菌-百白破联合疫苗免疫原性水平评估联合疫苗的滴度水平检测根据实施例分组进行。每组的给药剂量及给药方式同上述免疫原性评估实验，不同点在于百白破疫苗检测破伤风抗毒素GMT。对比例1的给药剂量及给药方式同上述免疫原性评估实验；百白破组注射常规百白破疫苗，每针剂量0.5mL，间隔一个月，共免疫3针；实施例1肺炎球菌-百白破联合疫苗给药剂量0.5mL，间隔一月，共免疫3针。接种完成后用ELISA法检测小鼠血清中抗肺炎球菌荚膜糖PSIgG抗体水平，采用ELISA法检测抗破伤风抗体GMT。评估结果如下表2。表2：血清抗PS抗体IgG/抗破伤风抗体GMT在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。当前第1页1 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