狗肝菜多糖在制备防治糖尿病药物或保健品中的应用的制作方法

本发明属于中医药领域，涉及以狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees.全草为原料提取纯化出狗肝菜多糖及其在制备成防治糖尿病药物或保健品中的应用，

背景技术：

狗肝菜是爵床科华九头狮子草属狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees.的全草。全草味甘、微苦、性寒,归心、肝、肺经,具有清热、凉血、利湿、解毒、生津、利尿等功效,临床常用于治疗感冒发热、热病发斑、暑热烦渴、吐衄血、便血、尿血、崩漏、肺热咳嗽、咽喉肿痛、肝热目赤、眼结膜炎、小儿惊风、小便淋沥、带下、带状疱疹、痈肿疔疖、蛇犬咬伤等证。狗肝菜资源非常丰富，分布云南、广东、广西等地，为西南民间常用药材。狗肝菜为广西民间药食两用的常用壮药,主要含有多糖、有机酸、氨基酸等物质。本专利发明者前期研究发现狗肝菜多糖成分具有抗炎，抗氧化及提高机体免疫，达到改善和调节机体代谢作用,但对抗糖尿病的研究尚属首次。

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)通常指2型糖尿病(TZDM)，占DM总数的90％以上，其发病率、死率高，在世界范围内已经成为继心脑血管疾病和癌症之后的第三大严重危害人类健康的疾病。糖尿病的发生是由遗传和后天环境共同作用，以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病。随着病程发展，可以导致多组织多器官病变，严重威胁人类健康。在传统的糖尿病治疗中，西药治疗糖尿病见效快，但需长期服用，且不良反应大。现代研究发现，部分中药或其提取物在糖尿病治疗方面，具有疗效稳定且不良反应少，有着西药不可替代的特点和优势。因此从天然药物中寻找安全、有效的抗糖尿病药物具有十分重要的意义。狗肝菜药用资源丰富，获得狗肝菜多糖的成本低，适宜大量生产。检索国内外狗肝菜多糖的研究，尚未见对狗肝菜多糖防治糖尿病作用方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是以狗肝菜全草为原料提取纯化出狗肝菜多糖，并将其制备成防治糖尿病药物或保健品，这在国内尚属首次公布。

实现本发明目的的技术方案是：

狗肝菜多糖的新用途，用于制备防治糖尿病的药物或保健品，可将其制备成供口服的中药制剂，如散剂、片剂、口服液、颗粒剂，胶囊和丸剂等，其制法与现有的相应剂型的制法通用。

本发明狗肝菜多糖的制备是称取干燥的狗肝菜全草粗粉,加入石油醚回流脱脂提取1-2h，药渣挥发尽石油醚后，沸水提取1-3次，每次1-3h，合并并浓缩提取液，用氯仿与正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加无水乙醇使醇含量达到70-99％，于4℃冰箱中醇沉，抽滤，弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜粗多糖；将狗肝菜粗多糖溶于水，加样到经pH＝7-9的磷酸盐缓冲液前处理的DE52型树脂层析柱中,静止12h，用蒸馏水，流速以1-3mL/min洗脱，再经sephadex-G25凝胶层析柱，用蒸馏水，流速以0.5-1mL/min洗脱，浓缩洗脱液，再经活性炭脱除其多糖色素，真空干燥得白色粉末状狗肝菜多糖(DCP)。

本发明与现有技术相比，狗肝菜药材资源丰富，制备狗肝菜多糖工艺简单、成本低，无任何毒副作用，口感好，具有良好的开发价值。此外，本发明发掘了狗肝菜多糖适用于防治糖尿病，疗效确切，在制备防治糖尿病药物或保健品具有良好的药用价值，并为狗肝菜多糖进一步深入开发提供研究基础。

附图说明

图1为本发明实施例狗肝菜多糖对糖尿病大鼠体重的影响(n＝10)；

图2为本发明实施例狗肝菜多糖对糖尿病大鼠血糖浓度的影响；

图3为本发明实施例狗肝菜多糖对糖尿病大鼠糖耐量的影响；

图中：A、B、C、D、E、F分别对应代表空白对照组、模型组、阳性(格列本脲)组、狗肝菜多糖高、中、低剂量组，

图1和图2的横坐标中，“-1”指造模前；“0”指造模72h；“1、2、3、4、5、6”指给药周数，

图3的横坐标中，0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0指测定时间(h)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

一、以下是狗肝菜多糖的提取与纯化方法：

称取干燥的狗肝菜全草粗粉2000g,加入20000ML石油醚回流脱脂提取2h。药渣挥尽石油醚后，沸水提取2次，每次1.5h，合并提取液，浓缩至200mL，用氯仿-正丁醇(4:1)多次萃取(即Sevag法)，得到除去蛋白质的上清液，加95％乙醇使醇含量达到80％，于4℃冰箱中醇沉12h。抽滤,弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜粗多糖。将狗肝菜粗多糖溶于水，将其加样到经PH＝8的磷酸盐缓冲液前处理的DE52型树脂层析柱中,静止12h，用蒸馏水，流速以2mL/min洗脱，再经sephadex-G25凝胶层析柱，用蒸馏水，流速以0.5-1mL/min洗脱，浓缩洗脱液，再经活性炭脱除其多糖色素,真空干燥得白色粉末状狗肝菜多糖(DCP)。狗肝菜多糖用葡萄糖作对照品，采用苯酚一硫酸法显色，经紫外-可见分光计测定样品中的多糖纯度达95.6％。

二、将狗肝菜多糖制备成药物制剂：

将狗肝菜多糖可加入相应辅料，制备成散剂、片剂、口服液、颗粒剂，胶囊和丸剂等。

三、狗肝菜多糖对糖尿病大鼠降糖和抑制并发症药效实验方法和结果：

1、材料、试剂和仪器

1.1动物

SPF级SD大鼠90只，雌雄各半，由桂林医学院SPF实验动物中心提供(许可证号SCXK2007-0001)。

1.2药品与试剂

狗肝菜经广西中医药大学韦松基教授鉴定为爵床科华九头狮子草属狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees.的全草。用“狗肝菜多糖的提取与纯化方法”制备得到实验用狗肝菜多糖(DCP)供试药品。

格列本脲，华润紫竹药业有限公司。链脲佐菌素(STZ)，购于Sigma公司。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)，购于南京建成生物工程研究所。胰岛素放射免疫试剂盒，购于Bio-Rad公司。糖基化终产物一肽(AGE-P)、肝糖元、肾脏醛糖还原酶(AR)和糖化血红蛋白(HbAlc)检测试剂盒，购于浙江爱康生物科技有限公司。

1.3仪器

TLL-C台式冷冻离心机，北京四环科学仪器厂；TSN-695B型放免测量仪，上海日环仪器一厂；AU600全自动生化检测仪，奥林巴斯生产；752型分光光度计，上海第三分析仪器厂；BS1105电子天平，德国sartorius公司；拜耳血糖测试仪及其试纸，德国Bayer。

2.实验方法

90只SD大鼠随机分成正常对照组(10只)和造模组(80只)，正常对照组喂以普通饲料，造模组喂以高糖高脂饲料4周。4周后所有大鼠禁食不禁水12h，造模组按35mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造模，正常对照组只注射等量檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.4)，注射后继续禁食不禁水12h。再次喂养72h后，禁食不禁水12h，用血糖仪测定造模组的空腹血糖，筛选空腹血糖≥13.8mmol/L为造模成功的糖尿病大鼠，本实验成模74只。将造模成功的大鼠按照血糖值和体重随机平均分为模型组，阳性对照组(格列本脲，20mg/kg)和狗肝菜多糖高、中、低剂量组(600、400、200mg/kg)，灌胃给药，正常对照组和模型组灌胃蒸馏水，连续灌胃共6周。实验期间观察动物的一般状况，于给药前及给药后每一周称重1次，并经动物尾静脉采血，测量全血血糖。给药6周后，禁食不禁水12h，各组大鼠分别灌胃给予葡萄糖2.5g/kg，分别于0h、0.5h、1h、2h、3h尾静脉取血测定血糖值，绘制血糖变化图，t检验比较个时间点的葡萄糖耐受程度。再次禁食不禁水4h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，取肝脏和肾脏。

3.实验结果

3.1大鼠一般状况的观察

正常组大鼠精神状态良好，体重增加，动作自如。糖尿病模型组大鼠出现典型的多食、多饮、多尿、体重减轻症状，且精神倦怠，活动减少，毛发没有光泽，实验期间4只死亡；狗肝菜多糖组大鼠饮水量、尿量、饮食量均较模型组显著减少，体重较糖尿病大鼠显著增加，只有低剂量出现1只死亡，说明狗肝菜多糖可改善糖尿病大鼠的症状。

3.2大鼠体重的变化

大鼠腹腔注射STZ 72h后，各造模组与造模前体重相比，均显著下降(P＜0.01)。实验期间，空白组体重逐渐增加，造模组大鼠均呈降低趋势，其中模型组大鼠体重大体均呈下降趋势，尤其在造模后的前两周内下降尤为明显，而用药组药物干预两周后，阳性组和狗肝菜多糖高剂量组从第2周起体重大体呈上升趋势，狗肝菜多糖中、低剂量组体重保持稳定。见图1。

3.3大鼠血糖水平的变化

在给药前，与空白组血糖水平比较，造模组有统计学意义(P＜0.01)，说明造模成功。给药后，从第2周起，与模型组比较，狗肝菜多糖各剂量组和阳性组血糖明显降低，均有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

3.4口服葡萄糖耐量(OGTT)实验

OGTT实验是临床上诊断DM的金标准。实验结果显示，与模型组相比，阳性组和狗肝菜多糖高、中、低剂量组都可以显著提高糖尿病大鼠葡萄糖耐量，在灌胃给予葡萄糖3h时血糖值差异极显著。见图3。

3.5狗肝菜多糖对糖尿病大鼠血清糖基化终产物-肽(AGE-P)和糖化血红蛋白(HbAlc)的影响

监测糖基化终产物-肽(AGE-P)用于DM高危人群的筛查，糖化血红蛋白(HbAlc)列为DM和其并发症诊断的主要标准之一。实验结果显示，与模型组相比，用药组大鼠AGE-P和HbAlc均有显著性降低，表明狗肝菜多糖能够改善糖尿病和其并发症，该结果表1与图2结果相一致。

表1狗肝菜多糖(DCP)对糖尿病大鼠AGE-P和HbAlc的影响

与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01(下表表示和剂量同)。

3.6狗肝菜多糖对糖尿病大鼠肝组织肝糖元、肾脏醛糖还原酶(AR)活性和水平的影响

肝糖元的作用是维持血糖浓度的相对稳定，在高血糖状况下(如糖尿病)，己糖激酶被饱和，这时醛糖还原酶激活，促使体内的肾脏病变。实验结果显示，与模型组相比，用药组大鼠肝糖元升高和肾脏AR显著性降低，表明狗肝菜多糖能够调控糖尿病血糖浓度和抑制肾脏的并发症。见表2。

表2狗肝菜多糖(DCP)对对糖尿病大鼠肝糖元和A R的影响

3.7狗肝菜多糖对糖尿病大鼠血清中血脂因子TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影响

与空白组相比，模型组大鼠TC、TG、LDL-C水平均显著性升高，HDL-C水平显著性降低，表明糖尿病大鼠的血脂代谢出现严重紊乱。经过6周的药物干预,与模型组相比，狗肝菜多糖各剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平均显著性降低，HDL-C水平显著性升高，表明狗肝菜多糖可对糖尿病大鼠的血脂环境具有改善作用。见表3。

表3狗肝菜多糖(DCP)对糖尿病大鼠血清中LDL-C，HDL-C，TG和TC的影响

通过以上实验，发现狗肝菜多糖能够可改善糖尿病大鼠的症状，抑制死亡，维持体重，降低血糖和提高耐糖量，显示其良好的降糖作用。此外，狗肝菜多糖能够降低糖尿病大鼠血清糖基化终产物-肽(AGE-P)、糖化血红蛋白(HbAlc)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和肾脏醛糖还原酶(AR)活性或含量，升高肝糖元和高密度脂蛋白(HDL-C)含量，说明其通过抑制肝脏、肾脏病变和改善血脂环境，达到抑制糖尿病并发症的作用。