一种复方黄柏液涂剂的制备方法及应用与流程

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种复方黄柏液涂剂的制备方法及应用。

背景技术：

复方黄柏方由连翘、黄柏、金银花、蒲公英等药物依据中医理论配伍组方而成。连翘中所含化学成分主要有木脂素类、挥发油及萜类、苯乙醇苷类、黄酮类等。其发挥抗菌、消炎、抗病毒作用的有效成分主要为连翘酯苷和连翘苷。黄柏中主要活性成分包括盐酸小檗碱、多糖类等。金银花化学成分研究表明，其富含挥发油、黄酮类、有机酸、三萜皂苷类等。从整体上来说，金银花中的黄酮类物质，具有解热抗炎作用；挥发油具有止血作用；三萜苷类物质具有抗病毒作用；无机物质具有利胆保肝作用，有机酸类物质具有抗菌作用。蒲公英全草的化学成分复杂，目前文献报道的具有活性的成分主要包括酚酸类、黄酮类及多糖类等。蜈蚣的有效成分主要包括蛋白质、肽类、糖类和脂肪酸等。

复方黄柏液已广泛用于临床治疗疮疡、皮肤外伤感染等疾病，现有的复方黄柏液存在久储后有沉淀等问题，这主要是由于其工艺简单，仅经过提取、简单精制后配液灌封灭菌而导致的。

现有复方黄柏液工艺改进的难点在于：由于复方黄柏液各组分之间存在协同配伍关系；单一组分用量的变化会导致各组分协同性下降，影响整体效果的发挥，因此，如何在保证复方黄柏液整体性能不受影响的情况下，确定起主要作用的物质及其用量，成为复方黄柏液工艺改进的关键点。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明拟对复方黄柏液工艺进行改进，提供一种治疗疮疡及外伤感染的药用组合物即复方黄柏液涂剂，包括挥发油、连翘总苷、总生物碱、绿原酸、多糖、多肽等。制备的复方黄柏液涂剂有效成分明确，质量稳定，在治疗疮疡、皮肤外伤感染中获得了理想的效果；同时还具有较好的促进成纤维细胞迁移的作用。

本发明在治疗抗菌、镇痛抗炎、免疫调节、改善微循环、促进伤口愈合、减少瘢痕生成、外用治疗疮疡溃后、外伤感染、难愈合创面、褥疮、糖尿病足等慢性难愈合伤口等方面的疗效，较现有的市售复方黄柏液治疗周期显著缩短，每次用药量减少1/3。

与现有技术对已知组分较优用量进行工艺改进，提高提取率和纯度不同。本发明通过对复方黄柏液涂剂中的有效组分进行分析，初步确定了复合黄柏液中起主要治疗作用和协同增效作用的物质的成分和用量，提出了一种切实可行的提取方法和质控方法，不仅能够快速地对复方黄柏液涂剂的药效进行判断，同时，通过对有效含量的精确控制，大大提高了复方黄柏液涂剂的制备效率。可以对生产中出现问题的黄柏液进行及时地进行质量分析和有效地回收利用，制备的产品质量稳定、可控、不合格率低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复方黄柏液涂剂，包括如下重量组分：挥发油包合物0.5-1.5份、植物药材提取物15-50份、蜈蚣多肽提取物0.5-10份；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含连翘苷不得少于1.05％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含盐酸小檗碱不得少于0.8％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含绿原酸不得少于4.17％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含多糖不得少于3％；

其中蜈蚣多肽提取物按干燥品计算，含N量不得少于10％。

优选的，所述植物药材提取物的原料为连翘、黄柏、金银花和蒲公英。

优选的，所述挥发油包合物的原料为连翘和金银花。

通过对复方黄柏液中起主要治疗作用和协同增效作用的物质的成分和用量的确定，在提取工艺优化过程中，可以摆脱某些原有原料对提取工艺选择上的限制，从新的角度选取提取工艺，缩短了研发进程，提高了筛选效率，为复合黄柏液作用机理的研究和后续配方优化，提供了重要的技术支持和新思路；为现有的中药提取技术的发展提供了新的方向。

优选的，所述的复方黄柏液涂剂，包括如下重量组分：挥发油包合物0.5-1.0份、植物药材提取物15-35份、蜈蚣多肽提取物0.5-5份；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含连翘苷不得少于1.05％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含盐酸小檗碱不得少于0.8％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含绿原酸不得少于4.17％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含多糖不得少于3％；

其中蜈蚣多肽提取物按干燥品计算，含N量不得少于10％。优选的，所述植物药材提取物的原料为连翘、黄柏、金银花和蒲公英。

优选的，所述挥发油包合物的原料为连翘和金银花。优选的，所述复方黄柏液涂剂，包括如下重量组分：挥发油包合物1.0-1.5份、植物药材提取物35-50份、蜈蚣多肽提取物5-10份；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含连翘苷不得少于1.05％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含盐酸小檗碱不得少于0.8％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含绿原酸不得少于4.17％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含多糖不得少于3％；

其中蜈蚣多肽提取物按干燥品计算，含N量不得少于10％。

优选的，所述植物药材提取物的原料为连翘、黄柏、金银花和蒲公英。

优选的，所述挥发油包合物的原料为连翘和金银花。所述干燥品是指：复方黄柏液涂剂的干燥品。

本发明还提供了一种复方黄柏液涂剂的制备方法，包括：

以连翘、金银花为原料，水蒸气蒸馏法提取挥发油、包合，即得挥发油包合物；

以连翘、黄柏、金银花、蒲公英为原料，醇提减压浓缩、加水稀释、冷藏，即得植物药材醇提取液；

将上述醇提后的药材、水提减压浓缩后，与乙醇混合，至醇含量为50％；冷藏、过滤，除去上清液，减压浓缩至无醇味；即得植物药材水提液；

合并上述植物药材醇提液与植物药材水提液，即得植物药材提取液；

将上述植物药材提取液进行包合；得植物药材提取物；

以蜈蚣为原料，醇提，得蜈蚣醇提取液和药材残渣；

再将醇提后得蜈蚣药材残渣进行水提，得蜈蚣水提液；

合并上述蜈蚣醇提液和蜈蚣水提液，得蜈蚣多肽提取物；

分别称取上述挥发油包合物、植物药材提取物、蜈蚣多肽提取物；混合均匀，静置过夜、过滤、灌装、灭菌，即得。

本发明中的百分数为质量百分数。

通过上述提取工艺，所述复方黄柏液涂剂能够达到抗菌与促愈的平衡，复方黄柏液涂剂治疗疮疡的过程中，胶原的沉积与降解达到平衡状态，因此瘢痕较窄，同时能促进表皮下结缔组织增殖且无炎症反应，促愈效果明显。

醇提水沉法系指将中药原料用一定浓度的乙醇用渗漉法、回流法提取，即可提取出生物碱及其盐、甙类、挥发油及有机酸类等；虽然多糖类、蛋白质、淀粉等无效成分不易溶出，但树脂、油脂、色素等杂质却仍可提出。为此，醇提取液经回收乙醇后，再加水处理，并冷藏一定时间，可使杂质沉淀而除去。质量浓度为40％～50％的乙醇可提取强心甙、鞣质、蒽醌及其甙、苦味质等；质量浓度为60％～70％乙醇可提取甙类；更高浓度乙醇则可用于生物碱、挥发油、树脂和叶绿素的提取。而本发明中采用醇提减压浓缩进一步提高了挥发油的提取率，优选的醇提减压浓缩的温度为55℃。本处方中各药材中有效成分醇溶性较好，且醇提取温度低，适用于温度敏感性成分，且对于无效成分如粘液质、树胶等成分溶解性较小，同时乙醇用量较少且可回收，提取液不易发霉变质。醇提后药液，采用水沉的方法，对其中水不溶性成分进行沉淀，保证了成品的溶解性。

医院制剂以及营养保健口服液中很大一部分都应用了水提醇沉法。然而在长期的应用中，也发现存在不少问题。一是成本高，二是药物成分如生物碱、甙类、有机酸等有效成分均有不同程度的损失，而多糖和微量元素的损失尤为明显。为此，本发明选用水提液减压浓缩处理，在保证提取率和纯度的同时，克服了上述问题，优选的水提液减压浓缩的温度为75℃。对醇提后药材进行水提取，保证有效成分的提取效率，且提取方法简单，工艺可操作性强。纯化水回流提取，加热的条件下可以增大中药成分的溶解度，还可对其他成分产生助溶现象，进一步增加一些在水中溶解度小、亲脂性强的成分的溶解度。

优选的，所述植物药材提取液进行包合的具体步骤为：称取适量HP-β-CD，加入蒸馏水加热搅拌配置成质量浓度为45％～50％的溶液；缓慢滴加植物药材提取液，搅拌均匀，并持续搅拌4～4.2h；静置，冷藏，过滤，即得。

本发明还提供了采用上述任一方法制备的复方黄柏液涂剂。

上述的复方黄柏液涂剂在治疗疮疡、皮肤外伤感染中获得了理想的效果。

本发明的有益效果：

1.本发明制备的复方黄柏液涂剂有效成分明确，质量稳定，在治疗疮疡、皮肤外伤感染中获得了理想的效果；同时还具有较好的促进成纤维细胞迁移的作用，治疗效果较现有的市售复方黄柏液有较大提升，治疗周期显著缩短，每次用药量减少1/3。

2.本发明制备的复方黄柏液涂剂作用机制明确，能够达到抗菌与促愈的平衡，复方黄柏液涂剂治疗疮疡的过程中，胶原的沉积与降解达到平衡状态，因此瘢痕较窄，同时能促进表皮下结缔组织增殖且无炎症反应，促愈效果明显，社会效益良好。

3.研究证明：本发明的复方黄柏液涂剂组方合理，制备工艺切实可行，质控方法专属性强、重现性好。

4.本发明制备方法简单、操作方便、实用性强。

附图说明

图1是体外促愈实验-空白对照组。

图2是体外促愈实验-复方黄柏液涂剂处理组。

图3是体外促愈实验-蒲公英处理组。

图4是体外促愈实验-蜈蚣处理组。

图5是复方黄柏液涂剂等对转化生长因子-β1(TGF-β1)的变化规律的影响图。

图6是复方黄柏液涂剂等对表皮生长因子(EGF)的变化规律的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步说明。

实施例1

一、处方

挥发油包合物0.5-1.5ml

植物药材提取物15-50g 蜈蚣多肽提取物0.5-10g

其中植物药材提取物按干燥品计算，含连翘苷不得少于1.05％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含盐酸小檗碱不得少于0.8％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含绿原酸不得少于4.17％；

其中植物药材提取物按干燥品计算，含多糖不得少于3％；

其中蜈蚣多肽提取物按干燥品计算，含N量不得少于10％。

二、药材提取纯化工艺

2.1挥发油

(1)取连翘80g、金银花40g，粉成粗粉；

(2)加入8倍量的水，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，沸腾后保持微沸4h，收取挥发油；

(3)挥发油包合：取β-环糊精，加水溶解，加入挥发油的乙醇溶液，继续恒温搅拌，冷却至室温，置于4℃冰箱放置24h后进行抽滤，将包合物置于恒温箱中60℃干燥4h，即得挥发油包合物；

2.2植物药材提取液

2.2.1提取纯化工艺

(1)取连翘80g、黄柏40g、金银花40g、蒲公英40g，加6倍量70％的乙醇超声提取2-3次；

(2)醇提液减压浓缩(55℃)至相对密度为1.00～1.05(50℃)；

(3)加入蒸馏水至3-4倍生药量，搅拌均匀，冷藏12h，即得醇提取液；

(4)醇提后药材残渣加6倍量水，煎煮提取2次，每次1h；

(5)水提液减压浓缩(75℃)至相对密度为1.10-1.15(50℃)；

(6)加入95％乙醇使含醇量达50％，搅匀，冷藏24h；

(7)过滤，取上清液，减压浓缩至无醇味，即得水提取液；

(8)合并醇提取液与水提取液，混合均匀，即得植物药材提取液；

2.2.2包合工艺

(1)称取适量HP-β-CD，加入蒸馏水加热搅拌配置成50％的溶液；

(2)缓慢滴加植物药材提取液，搅拌均匀，并持续搅拌4h；

(3)静置，冷藏，过滤，即得。

2.3蜈蚣多肽提取液

(1)蜈蚣药材适量，粉成粗粉，加入65％乙醇回流提取两次(第一次4倍量提取1.5h，第二次3倍量提取1h)，少量多次加入等体积蒸馏水，搅拌，冷藏静置，抽滤，75℃减压浓缩，得醇提液；

(2)蜈蚣残渣加入6倍量水，提取1-2次，每次1h，提取液浓缩后，加入乙醇使含醇量达50％，搅拌，冷藏静置12h，过滤，浓缩，得水提液；

(3)合并醇提液与水提液，混合均匀，定容至100ml。

三、涂剂制剂成型工艺研究

3.1处方

挥发油包合物 0.5-1.5ml 植物药材提取物 15-50g

蜈蚣多肽提取物 0.5-10g

3.2液体制剂成型工艺

(1)称取处方量的各提取物，加入纯化水中，搅拌均匀，4～10℃放置过夜；

(2)过滤，灌装，灭菌即得。

3.3冻干粉制剂成型工艺

(1)称取处方量的各提取物，加入甘露醇5～20g，混合均匀；

(2)分装，冻干，即得。

四、药理活性筛选试验

1、体外促愈实验

将细胞密度为1×10⁵个/mL的3T3细胞悬液接种在96孔板(弃四周孔)，每孔100μL，四周加入等体积的无菌蒸馏水。37℃培养箱静置培养18h后，弃去培养液用1000μL枪头在中央垂直划一均匀痕迹，PBS缓冲液洗涤划落的细胞碎片，实验分四组即正常细胞组(只划痕不加药)、高浓度药物组、中浓度药物组、低浓度药物组，正常对照含2％胎牛血清的1640培养基进行培养，每组均加样100μL，每组设6个复孔。分别在划痕后0h、10h、20h、30h、40h在倒置显微镜下观察并拍照。

(1)对照组

上皮细胞在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，细胞划痕试验很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。

(2)复方黄柏液涂剂

采用复方黄柏液涂剂(生药量浓度为0.2024g/ml)10,40,160倍稀释作用于成纤维细胞，观察高中低浓度细胞均发生明显迁移，表明复方黄柏液涂剂具有显著的促进成纤维细胞迁移的作用。

(3)蒲公英浓度2.5mg/ml

蒲公英稀释160倍即浓度为2.5mg/ml作用于成纤维细胞，在培养10h、20h、40h观察，细胞迁移明显，表明蒲公英提取物有促进成纤维细胞迁移的作用。

(4)蜈蚣浓度1.0mg/ml

蜈蚣稀释40倍即浓度为1.0mg/ml作用于成纤维细胞，在培养10h、30h、40h观察，细胞迁移明显，表明蜈蚣提取物有促进成纤维细胞迁移的作用。

其中复方黄柏液涂剂、蒲公英提取物及蜈蚣提取物具有促进细胞迁移的作用。

2、对转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)的变化规律的影响

TGF-β1对内皮细胞有一定的趋化作用,可诱导血管的新生,促进创面的愈合。EGF具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。

复方黄柏液涂剂具有促进TGF-β1、EGF分泌的作用，同时金银花具有显著的促进TGF-β1分泌的作用。黄柏，金银花，醇提液具有促进EGF分泌的作用，且其促进作用强于复方黄柏液涂剂。连翘、金银花具有与复方黄柏液涂剂相当的促进EGF分泌的功能。

检测结果如图5、图6所示。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。