一种USP22在促进乳腺癌方面的应用的制作方法

本发明生物基因涉及技术领域，尤其是涉及USP22在促进乳腺癌方面的应用。

背景技术：

雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)是类固醇激素受体家族成员之一，通过与其配体雌激素结合激活而在个体发生、生长发育和生殖功能的各方面都起着必不可缺的作用。通过直接与ERα靶基因的特定DNA结合位点结合介导靶基因转录，从而发挥其生物学功能。ERα通常定位在细胞质中，E2与ERα结合使ERα与伴侣分子分离，ERα被磷酸化，从而使ERα诱导的基因转录被激活。在此过程中，ERα的辅助调节因子被招募到ERα的靶基因启动子/增强子区域，在ERα介导的基因转录中起重要的调控作用。ERα包含有三个功能结构域：N端的活性功能域1(AF-1)，中间的高度保守的DNA结合域，和C端的配体(E2)结合域，即配体依赖的活性功能域2(AF-2)。随后，ERα二聚体结合到靶基因的雌激素反应元件区，激活靶基因的转录从而发挥生物学功能。

当今社会癌症是引起人类死亡的重要原因。其中乳腺癌是全世界女性高发的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在世界范围内呈较快增长趋势，每年约以0.2-0.3％的速度递增，且发病年龄趋向年轻化。乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。研究证实在正常乳腺上皮细胞内雌激素受体α(Estrogen Receptor α，ERα)很少高表达，而在大约60-80％的乳腺癌中，ERα呈高表达。ERα不但在女性生殖系统的正常生长和功能中起关键作用，还影响恶性乳腺上皮细胞的生长、分化、增殖和DNA复制，从而刺激肿瘤细胞的快速生长，ERα基因突变及功能异常与激素抵抗性乳腺癌转移密切关联。

近年来，越来越多的研究表明转录辅调节因子对ERα下游基因表达的调控对乳腺癌的发生发展十分关键，如pS2，cyclinD1，E2F1，Sirt1，GREB1，c-Myc等等。他们对肿瘤细胞增殖和生长起重要作用。大量研究证实，ERα辅调节因子的功能异常不仅影响乳腺癌细胞的增殖生长、侵袭转移，还与tamoxifen治疗抵抗相关。有研究证实ERα辅调节因子的差异表达是乳腺癌患者tamoxifen治疗抵抗的主要机制之一。所以，无论是雌激素受体自身的改变还是其相关转录辅因子的改变都能导致雌激素受体信号通路异常，影响乳腺癌的发生发展。因此，鉴定和解析ERα辅调节因子在ERα介导基因转录中的表观遗传学机制越来越受到关注，对于进一步研究肿瘤治疗中潜能药物靶点也具有重要的科学意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供USP22在促进乳腺癌方面的应用，USP22可以促进乳腺癌细胞的生长，并在临床乳腺癌中表达增多，在乳腺癌的发生发展中起促进作用。

本发明的技术方案是：

USP22在促进乳腺癌方面的应用。

优选地，USP22可促进乳腺癌细胞的生长。

优选地，USP22可上调ERα介导的基因转录。

优选地，USP22作为去泛素化酶通过去泛素化作用以稳定ERα蛋白，催化ERα靶基因启动子区组蛋白H2A、H2B去泛素化和H3K9和H4乙酰化，促进ERα靶基因(如pS2、GREB1、c-Myc等)的转录，从而进一步促进乳腺癌细胞的生长和迁移，并促进他莫西芬抑制乳腺癌的生长。

一种USP22在制备促进乳腺癌生长的产品中的应用。

一种USP22作为靶点在制备抑制乳腺癌生长的产品中的应用。

一种USP22在制备治疗乳腺癌疾病的制剂或药物中的应用。

一种USP22抑制剂和其他抗肿瘤药物联用在制备治疗乳腺癌疾病的制剂或药物中的应用。

最近的研究表明USP22在一些癌症(如结肠癌、食管鳞癌、甲状腺癌、胰腺导管腺癌等)中具有重要的作用，但USP22对乳腺癌的作用及其机制仍未见报道。本发明为治疗乳腺癌，特别是他莫西芬抵抗乳腺癌提供了新思路、新靶点。

附图说明

图1为USP22表达质粒示意图。

图2为针对USP22的shRNA沉默效果图。

图3为USP22对ERα靶基因转录水平的影响图。

图4为USP22沉默对细胞生长增殖能力的影响图。

图5为USP22沉默对小鼠移植瘤生长的影响图。

图6为USP22在BCa和乳腺增生中的表达图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

S1、根据USP22的氨基酸序列构建FLAG标签的USP22表达质粒，如图1所示。

S2、利用针对USP22的shRNA慢病毒载体感染ERα阳性表达的乳腺癌细胞系MCF7，建立稳定沉默USP22的乳腺癌细胞系及对照细胞系；如图2所示，shcontrol中USP22正常表达，但shUSP22中USP22表达明显降低，从而达到干扰USP22表达的目的。细胞系中内参基因GAPDH表达量一致，ERα的表达也受影响。

S3、通过Realtime-PCR检测USP22对ERα的靶基因转录的影响，结果显示USP22调控ERα的一部分靶基因。

RNA提取试剂RNAiso plus(TAKARA)提取细胞RNA，测浓度，反转录试剂盒PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)(TAKARA)反转录为cDNA，将cDNA稀释10倍，用Realtime PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM II(TliRNaseH Plus)(TAKARA)进行PCR检测，结果如图3所示，USP22沉默对pS2、hTERT、E2F1、GREB1、c-Myc均有影响。

S4、流式和克隆形成实验的结果表明沉默USP22抑制了细胞的生长增殖能力。

USP22稳定敲低和对照细胞以2×105的密度接种于35mm培养皿，饥饿处理12h，然后加E2刺激24h后，吸去培养皿细胞的培养液，PBS洗两次。胰蛋白酶消化，37℃，3min，加含血清的培养基，吹打，PBS洗两次。PBS重悬细胞，制成单细胞悬液，加75％酒精固定，PBS洗两次，IP染液染色，37℃1h，上机检测。如图4A所示，USP22沉默的实验组细胞S期明显减少，说明USP22影响乳腺癌细胞MCF7的S期。

USP22稳定敲低和对照细胞以1×104的密度接种于35mm培养皿，用新鲜含5％去激素血清的培养基培养，加入10-8mol/L的E2或相应量的无水乙醇作为对照，37℃培养6天，用R-250染色后拍照。如图4B所示，USP22沉默的实验组细胞数低于对照组，说明USP22沉默抑制细胞的生长繁殖。

S5、荷瘤小鼠实验表明：USP22促进了乳腺癌细胞MCF7在小鼠体内异种移植瘤的生长。

将等体积包被基质胶的USP22稳定过表达和对照细胞以5×106细胞量分别注射入BALB/c-nu小鼠左肩和右肩皮下，并对小鼠进行编号，待肿瘤开始生长，继续饲养小鼠到第12周，每周测量肿瘤大小(短径r1和长径r2)并记录，第4周取出肿瘤，测量大小和重量。如图5所示，实验组USP22过表达组的瘤体大于对照组shCtrl。

S6、利用免疫组化的方法通过检测乳腺癌组织及乳腺增生组织样本切片中USP22的表达情况，如图6所示，USP22在乳腺癌中表达高于乳腺增生组织。

本发明利用ER-PEV果蝇转基因模型系统筛选得到雌激素受体ERα的新转录辅调节因子USP22，证实在不加入雌激素环境下USP22仍可以上调ERα介导的基因转录。USP22作为去泛素化酶通过去泛素化作用稳定ERα蛋白，并催化ERα靶基因启动子区组蛋白H2A、H2B去泛素化和H3K9和H4乙酰化，促进ERα靶基因pS2、GREB1、c-Myc等的转录，从而进一步促进乳腺癌细胞的生长和迁移，并促进他莫西芬抑制乳腺癌的生长。

由此本发明为治疗乳腺癌特别是他莫西芬抵抗乳腺癌提供了新思路、新靶点。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。