本发明涉及大鼠后肢侧支血管microRNA表达谱的研究领域，特别涉及一种利用miRNA-352促进大鼠后肢侧支血管生长的方法。
背景技术：
最新的《中国心血管病报告》(2014年)显示，从上世纪90年代起，心血管疾病的发病率一直呈上升态势，目前估计全国有心血管病患者人数约2.9亿；同时，中国心血管病死亡率也在上升，主要是由于缺血性心脏病死亡上升所致。由于心血管疾病患者数量庞大，且各种相关并发疾病高发，心血管病已成为我国居民的头号杀手。
早在上世纪中期，临床心内科医生就观察到动脉血管阻塞后，原先存在于主要动脉分支之间，但不具备输送血液功能的微小动脉之间的连接能发育成为具有导血功能的较大的侧支动脉血管，这一过程称为动脉生成(arteriogenesis)，也称侧支血管生长。发育成熟的侧支血管，可以部分甚至完全恢复缺血区域的血流，因此部分冠心病患者发达的侧支系统使得其并未出现心肌缺血症状。科学家们因此提出，促进侧支血管生长是治疗缺血性疾病十分理想的策略。过去半个世纪的研究，逐渐揭示了动脉生成的机制。目前一般认为其机制包括：血流切应力、炎症和生长因子三个方面。大量实验表明，给实验动物注射单核细胞趋化因子、单核细胞或生长因子，均明显地促进了侧支血管的生长。然而，当科学家们将生长因子或促炎因子用于治疗缺血性疾病的临床试验时，却没有达到明显改善局部供血的效果。这说明我们对侧支血管生长机制认识还不够。
目前，侧支血管生长理论主要是建立在对正常动物一根动脉进行急性或慢性阻塞的情况下研究得出的，而临床的实际情况是，30％的脑血管病患者、25％的缺血性疾病患者伴有动脉粥样硬化等病变。临床疾病环境的复杂性，迫使我们必须找到合适的切入点，才能做到趋利避害。
我们将目光聚焦在血流切应力(fluid shear stress,FSS)。FSS是血流与内皮细胞表面产生的摩擦力，它被公认为是侧支血管生长的始动因素。当一根主要动脉阻塞后，其远端分支的压力会减小或消失，阻塞血管的近端分支与远端分支之间原先存在的微小动脉连接的两端就形成了压力梯度，导致FSS增加，进而激活血管内皮细胞，释放多种重要细胞因子，和触发炎症反应，从而促进侧支血管生长。
根据切应力计算公式：其中，Q代表血流量，η代表血液粘稠度，R代表血管半径，可以看出，FSS与血管管径呈负相关关系。在侧支血管的生长过程中，由于侧支血管管腔的扩大，导致FSS的下降，机体自然的侧支动脉生长因此过早地停止，结果往往只能恢复正常血供的35％-40％。另外，由于原先存在的微小动脉间的连接为动脉分支的末端，血流速度和压力均较小，且血流路径较长，使得FSS梯度变化较小，无法触发强烈的侧支血管反应。通过构建动静脉短路模型(结扎股动脉后，动脉远端与伴行股静脉行侧-侧吻合)使得微动脉连接的远端血流入静脉，这样就使微动脉连接两段的压力差增大，从而产生持续的高的FSS。正常股动脉切应力为4.8×10-3dyn/cm2，而动静脉吻合模型则可达到889×10-3dyn/cm2。实验表明，在猪后肢动静脉吻合的侧支血管生长模型，吻合侧的侧支血管是单纯结扎侧的4倍，而在兔的模型中，侧支血管增加了7倍。另外，近年来，临床应用体外反搏提高血流切应力，促进了冠脉侧支生长，改善了心脏功能。FSS不仅促进了心脏和外周侧支血管的生长，且影响了腹腔侧支血管和脑侧支血管的生长。FSS激活了Rho通路，调节多种细胞骨架蛋白和收缩蛋白，从而改变肠系膜小动脉的管壁结构；Schierling等通过双侧结扎颈动脉并将一侧颈动脉与伴行颈静脉行端侧吻合模型，提高脑侧支循环的FSS，核磁共振影像(MRI)显示，基底动脉血流量增加5.5倍，吻合侧大脑后动脉血流量增加10.3倍，且细胞增殖能力增强，单核细胞增多。这些研究表明持续提高的FSS可能改变了调节侧支血管生长的有关重要基因的表达。因此，若能进一步阐明持续提高的FSS诱导的侧支血管生长机制并找到调控过程中的关键分子，将会给缺血性疾病的治疗带来革命性的变化。
microRNA(miRNA)是一类长约18-25个核苷酸的高度保守性的小分子非编码RNA，在细胞核内，基因组DNA转录生成较长的RNA分子(可长达1000nt)，即初级转录本(pri-miRNA)，被双链RNA特异的核糖核酸酶Drosha切割成长度约70-100个碱基、具有发卡结构的RNA分子，即前体miRNA(pre-miRNA)，然后通过核输出蛋白exportin5机制转运到细胞质，被第二个双链RNA特异的核糖核酸酶Dicer切割，生成具有功能的成熟miRNA。科学家最早在研究线虫发育调控过程中发现了小分子RNA lin-4，从而开启了探索miRNA调控生命活动的序幕。miRNA主要是通过特异性结合靶基因mRNA 3’非翻译区进而调控靶基因的表达，从而在细胞增殖、分化、炎症、胚胎发育以及疾病等多种生理病理过程中发挥调控作用。目前，人类已经发现超过1000个miRNA，每个miRNA参与靶向作用数百个基因；与此同时，一个基因也受到多个miRNA的调节，因此，miRNA-mRNA构成一个复杂的调控模式网。在心血管领域经过十多年的研究，科学家们发现miRNA参与调节血管发育、血管细胞功能、血管结构改变和其他血管生理和病理过程。目前，miRNA的研究已经成为血管生物研究领域的热点。miR-17-92家族是研究得较多的miRNA，它由6个成熟的miRNA组成：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92a。它们是最早被发现有促进血管生成作用的miRNA。之后，Bonauer等发现miR-92a有强烈抑制血管生成的作用，并且给后肢缺血小鼠施用antagomir-92a后，能明显改善血流供应。miR-100同样对缺血后肢适应性的血管生长有调控作用。抑制miR-100后，其靶基因雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达上调，改善了缺血小鼠后肢血供恢复。miR-132与miR-100作用正好相反，其具有促进血管生成和促动脉生成的双重功能。可见股动脉结扎引起的侧支血管适应性生长受miRNA的调节。然而并不是所有调节血管生成的miRNA都具有调控侧支血管生长的功能。van Solingen等观察到，在小鼠后肢缺血的侧支血管生长模型，miR-126促进了毛细血管的新生，但对侧支血管生长没有影响。另外，还有研究发现同一miRNA在调节毛细血管生成和动脉生成时，呈现两种截然相反的作用，如Pankratz等报道，miR-155负反馈调节毛细血管生成，而正性调节动脉生成。
近来，FSS对内皮细胞miRNA表达的调节也有文献报道，Weber等在细胞培养模型中发现，持续单向流体切应力使内皮细胞miR-21表达增加，通过下调其靶基因张力蛋白类似物(PTEN)表达，从而调控PI3K/Akt/eNOS通路，抑制细胞凋亡，增加NO产物。Qin等发现层流调节了许多miRNA在内皮细胞的表达，其中包括miR-19a，它参与细胞增殖的调控。Wang等报道，miR-23b受内皮切应力的调节，对细胞增殖发挥调控作用。Chen等的研究结果显示，层流调节了miR-101的表达，通过miR-101调控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达和内皮细胞增殖。而另一方面，切应力对内皮细胞miRNA表达的调控具有时效性，如miR-19a在内皮细胞暴露于切应力后的第12小时达到高峰，之后慢慢下降；miR-23b则在施加切应力的开始12小时内只有轻微表达上调。
综上可知，单纯股动脉结扎产生的FSS是有限的，诱导生长的侧支血管只能部分恢复血供，而股动脉结扎后合并动静脉吻合能产生持续的高切应力，诱导的侧支血管生长能完全恢复血供，甚至超过正常水平，且这两种模型的侧支血管生长存在明显的基因差异；结合细胞实验切应力大小、持续时间长短等因素调控基因的表达及不同类型的血管生长方式miRNA的调节不同的报道，我们设想，两种侧支血管生长模型可能存在不同的miRNA调节机制。
本研究对两种侧支血管生长模型分离出的侧支血管进行miRNA表达谱芯片分析，对差异显著并未曾报道的miRNA进行qRT-PCR验证，应用荧光原位杂交技术对miR-352在侧支血管表达进行定位测定；通过miR-352模拟物或miR-352抑制剂体外转染血管内皮细胞培养，探讨miR-352对内皮细胞增殖、迁移和成管能力的影响；通过在体应用antagomir-352敲除miR-352的实验结合免疫荧光组织化学、组织学和血管造影等方法，研究miR-352对侧支血管生长的调控作用；应用荧光素报告酶检测、qRT-PCR、蛋白印迹(Western blot)和免疫荧光组织化学等方法，找到miR-352的靶基因，并探讨其对侧支血管生长的影响。
技术实现要素：
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用miRNA-352促进大鼠后肢侧支血管生长的方法。更深入研究miRNA调节侧支血管生长的机制、丰富侧支血管生长的分子理论和为促侧支血管生长药物的研究提供新的思路。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
利用miRNA-352促进大鼠后肢侧支血管生长的方法，
通过提高大鼠血流切应力FSS，改变miRNA的表达谱，下调miRNA-352的表达，使IGF2R表达上调，细胞自噬水平上升，激活侧支血管自噬-溶酶体酶系统，有利于细胞增殖、迁移和活性分子的表达以促进侧支血管的生长。
进一步的，所述提高大鼠FSS的方法为股动脉结扎后合并动静脉吻合。
进一步的，所述方法在促进侧支血管生成方面的应用。
进一步的，所述方法在心血管疾病治疗方面的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明方法提高大鼠后肢FSS后，侧支血管较单纯股动脉结扎侧数目明显增多，管腔面积增大；提高FSS改变了侧支血管的miRNA表达谱。提高FSS下调miR-352的表达。过表达miR-352抑制内皮细胞的增殖、迁移和内皮管形成，抑制miR-352则促进内皮细胞增殖、迁移和内皮管形成；在体抑制miR-352后，大鼠后肢侧支血管生长明显活跃。miR-352可通过靶向作用于IGF2R调控细胞自噬，从而参与调控侧支血管生长。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
试验例：
30只健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(中南大学湘雅医学院实验动物学部提供)，体重250-300g，雌雄各半，随机分为假手术组、单纯结扎组(对照组)、动静脉吻合组(高FSS组)。动物存活1周，每组15只(30侧)，分别用于血管造影、组织学检测和miRNA提取。
动静脉吻合模型的构建按以前的实验方法进行。大鼠进行适应性喂养1周，术前12h禁食水，10％水合氯醛溶液(400mg/Kg体重)腹腔注射麻醉。在手术显微镜下分离出股动、静脉。然后在腹股沟韧带稍下方缝线双结扎股动脉近心端，血管夹阻断近、远心端股静脉及远心端股动脉，显微剪于股动、静脉中段侧面平行位剪开切口，肝素钠生理盐水冲洗管腔。10-0缝合线缝合股动、静脉切口6-8针，整理吻合口，完成侧-侧吻合术。3-0缝合线依次缝合筋膜、皮肤，络合碘再次消毒，手术过程中注意无菌操作。大鼠单笼喂养，自由摄取饲料、饮用水，术后注射抗生素预防感染，并观察伤口情况及后肢活动情况。动物存活1周。
单纯结扎组大鼠仅行股动脉结扎，不进行股动、静脉吻合术；假手术组大鼠打开皮肤、筋膜后缝合伤口，不做其他处理。这两组其他步骤与动静脉吻合组操作一致。
动物模型构建成功判断标准：术中缝线结扎后未见动脉血流通过结扎部位，血管吻合完毕，开放循环，股静脉血流通畅，吻合口无渗血；血管造影可见结扎部位，侧支血管数目增多；组织学检测血管各层结构发生变化；免疫荧光组织化学检测血管细胞增殖活跃、炎症细胞浸润加强等。
取材、保存
组织学取材
10％水合氯醛溶液经腹腔注射(400mg/Kg体重)麻醉后，剪开皮肤，暴露出大腿前群肌，迅速取下含有较多侧支血管的股薄肌(据以往经验，动脉生成过程中，股薄肌通常含有2-4根侧支血管)。取下的肌肉置于标本盒，O.C.T.复合物包埋，放入盛有液氮的保温杯，快速冷冻，-80℃低温冰箱保存待用。
RNA取材
侧支血管的分离按Grundmann的方法进行液态乳胶灌注，然后在体视显微镜下，解剖出大腿内侧肌群中的侧支血管，DEPC生理盐水漂洗后，置于冻存管，液氮急冻，-80℃低温冰箱保存待用。
血管造影
本实验采用我们自己改进的明胶-氧化铅灌注法进行血管造影术，以评价大鼠模型后肢侧支血管生长情况。
(1)灌注液配制：
明胶-氧化铅溶液：20％明胶溶液(体积，mL)：红色氧化铅(质量，g)＝1：1(V/W)，磁力搅拌器加热搅拌至完全溶解；
(2)造影剂灌注和X线正位摄片：方法同乳胶灌注,灌注成功后，将动物置于碎冰的容器中，待灌注液凝固后，取仰卧位，行X线摄片。
苏木素-伊红(H.E.)染色
(1)采用恒温冷冻切片机切片，按常规苏木素-伊红(H.E.)染色
步骤进行，在普通光学显微镜下观察并拍照。
组织Ki67、CD11b和α-actin的免疫荧光染色
取大鼠股薄肌冰冻切片，按常规免疫荧光染色步骤进行，用抗荧光衰减封片剂封片，然后在荧光显微镜下拍片。miRNA提取
按照mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Ambion)说明书操作，组织miRNA逆转录实时荧光定量PCR(RT-PCR)逆转录(RT)
qPCR
根据Universal PCR Master MixⅡ,With UNG(Applied Biosystems)说明书操作，每个样品设3个复孔，反应体系为20μL。
表1
表2
(2)将8联排管放入实时定量PCR仪，PCR反应条件为：第一步：50℃，2min；第二步：95℃，10min；第三步：95℃，15s；第四步：60℃，60s；重复进行第三、四步骤，共40个循环。
结果观察
血管造影的侧支血管数量由5个经培训的熟练观测者使用重复法计数获得，5个观测者均不知样本详细资料。
H.E.染色切片在普通光学显微镜下观察，记录结果，并拍照生成图片，将图片输入Image-Pro Plus 6.0软件，按软件操作说明进行，选取血管管腔作为对象测量面积，单位为μm2表示。
免疫荧光组织化学染色和原位杂交图像经荧光显微镜采集，侧支血管中Ki67、CD11b免疫阳性细胞的计数在荧光显微镜下扫描拍片后进行，计数采用双盲法，在40倍目镜下，对符合阳性染色且细胞核染色的细胞进行计数，阳性细胞率(％)＝(阳性细胞数量/所有细胞核数量)×100％。用Nikon EZ-C1 3.90的定量测量软件对各组血管原位杂交免疫阳性产物的荧光强度进行测量，荧光强度以Arbitary Units(AU)/μm2单位表示。
Taqman RT-qPCR结果记录Ct值，计算miRNA相对表达量＝(2-ΔCt)×1000
数据分析
以上所得实验数据用均数±标准误表示，资料的统计学分析均采用SPSS17.0统计软件和GraphPad Prism5软件分析完成。多组资料比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，多重比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法，两组计量资料采用Student t检验，计数资料采用卡方(χ2)检验。所有数据分析以P<0.05(two-sided)差异有统计学意义。
实验结果
灌注及血管造影
大鼠后肢股动脉结扎处未见灌注剂充盈，表现为股动脉血管连续性中断，股动脉结扎处远端也有显影，在动物大腿内外侧均存在数目不等的侧支血管。假手术组动物大腿内侧可见少量早先已存在的小动脉连接(1.8±0.37)，单纯股动脉结扎组动物存活1w后，可见明显增多的侧支血管(5.8±0.37)，呈网状分布，管径变粗，较弯曲；动静脉吻合组动物存活1w后，侧支血管数目为9.4±0.51，较单纯股动脉结扎组动物显著增粗，且数目增加(P<0.001)。
H.E.染色
假手术组，正常动脉血管壁各层细胞排列整齐，管壁厚薄较均匀，外膜有少量细胞；单纯股动脉结扎组，侧支血管的内膜、中膜和外膜结构都发生重塑，血管内膜稍增厚，管径变大，中膜平滑肌细胞排列较不规则，外膜成纤维细胞增加；动静脉吻合组，侧支血管各层结构重塑强烈，管径更大，内膜增厚，内皮细胞和平滑肌细胞排列不整齐，外膜成纤维细胞剧增。假手术组正常小动脉、单纯股动脉结扎和动静脉吻合的侧支血管管腔面积分别为1936±311.2μm2、4934±849.6μm2、15080±1931μm2，单纯股动脉结扎组的侧支血管管腔面积是假手术组的2.5倍(P＜0.05)，动静脉吻合组的侧支血管管腔是单纯股动脉结扎组的3倍(P＜0.01)。
侧支血管的细胞增殖情况
本实验以Ki67作为细胞增殖指标，结果显示，Ki67可表达于侧支血管各层的细胞核中。假手术组正常小动脉很少甚至没有Ki67阳性细胞，Ki67阳性细胞率为2.77±0.59％；单纯股动脉结扎组动物存活1w后，侧支血管壁可见Ki67表达增加，Ki67阳性细胞率为13.74±1.68％，较假手术组明显增加(P<0.01)，
提示侧支血管生长过程中血管细胞增殖明显；动静脉吻合组动物存活1w后，侧支血管Ki67阳性细胞显著增加，Ki67阳性细胞率为27.67±2.19％，较单纯股动脉结扎组的阳性细胞率高(P<0.01)，提示提高FSS后，侧支血管细胞增殖能力加强。
侧支血管的巨噬细胞浸润情况
本实验CD11b为巨噬细胞标志物，结果显示，假手术组的正常小动脉血管外膜可见有少量的CD11b阳性细胞，阳性细胞率为2.47±0.76％；单纯股动脉结扎组的侧支血管外膜可见CD11b阳性细胞数量增加，阳性细胞率为14.81±1.88％，提示侧支血管生长过程中，巨噬细胞浸润增多；动静脉吻合组CD11b阳性细胞率为23.87±2.30％，较单纯股动脉结扎组明显上调(P<0.01)，提示提高FSS后，侧支血管巨噬细胞浸润能力增强。
两种侧支血管生长模型的miRNA表达谱
采用miRCURY LNATMmicroRNA Array表达谱芯片(Exiqon)检测单纯股动脉结扎组和动静脉吻合组侧支血管miRNA表达谱。结果显示，芯片共检测299种miRNA，差异为2倍及2倍以上的miRNA有94种，包括44种上调的miRNA和50种下调的miRNA(表3。
5个功能未知miRNA在侧支血管的表达情况
对下调的前20个miRNA，pubmed检索其对血管、血管细胞的功能，得到5个功能未知的miRNA(表4)，采用Taqman qRT-PCR检测5个miRNA在侧支血管的表达情况。结果显示，较单纯股动脉结扎组，动静脉吻合组侧支血管5个miRNA中let-7c-2-3p、miR-352、miR-674-5p和miR-347表达均下调(P<0.01、P<0.001、P<0.01、P<0.01)，其中miR-352下调最明显(P<0.001)。
表4
本发明首次对高FSS诱导生长的侧支血管进行了miRNA的表达谱分析，得到了特异性的miRNA差异表达。通过进一步分析查阅miRNA对血管及血管细胞的作用，我们挑选5个下调的miRNA进行了RT-PCR检测，结果验证了表达谱的数据。其中miR-352表达差异最为明显，通过生物信息学软件预测，miR-352可能的一些靶基因与血管及血管细胞功能有关，因此，miR-352对侧支血管的生长可能具有调控作用。
miR-352对内皮细胞功能及侧支血管生长的作用
材料和方法
试剂及设备
(1)主要试剂：
(2)主要设备：
LNA-ISH(锁核苷酸-原位杂交)
按常规原位杂交的方法进行溶液的配制和操作：1)大鼠股薄肌冰冻切片，片厚10μm，；2)蛋白酶K溶液37℃消化20min，；3)4％多聚甲醛固定10min；4)乙酰化处理10min，5)预杂交液室温1h；
表5
6)线性化的探针54℃杂交过夜(16-20h)小心盖上盖玻片；7)室温下，5×SSC洗片；8)杂交洗液漂洗2次，30min/次；9)0.2×SSC和0.01mol/L PBS依次漂洗；10)FITC标记的抗地高辛(1：200，绿色荧光)，4℃孵育过夜；11)0.1％Tween-20PBS漂洗4次；12)加入Cy3标记的α-SMactin(1：500，红色荧光)，孵育1h；13)加入DAPI室温孵育15min；14)抗荧光衰减封片剂封片和荧光显微镜下拍片。
大鼠主动脉内皮细胞鉴定及传代培养
SD大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)购自中国江苏齐氏生物公司，实验参照齐氏生物公司提供的RAEC细胞培养技术指导方法，对RAEC进行复苏和传代培养。运用免疫荧光细胞化学法检测CD31在RAEC的表达对细胞进行鉴定miR-352mimic及miR-352inhibitor3000转染
(1)转染前24h，将无抗生素培养的对数生长期细胞接种于96孔板5000-1×104个/孔)、48孔板(2.5×104个/孔)、24孔板(5×104个/孔)、6孔板(2×106个/孔)和Lab-tek Chamber Slide(1.5×104个/孔)，分6组：未处理组、只加转染剂组、mimic对照组、miRNA mimic组、inhibitor对照组、miRNA inhibitor组；
表6
(2)观察细胞状态及密度，将ECM换成无血清培养基：
表7
(3)Reduced Serum Medium稀释3000，充分混匀，室温放置5min；(4)OPTI-MEM培养基按所需浓度稀释RNA，充分混匀，室温放置5min；(5)将稀释的3000加入稀释的RNA(1：1比例)，充分混匀，室温孵育20min；(6)将混合物加入ECM，轻轻晃动使其分布均匀，细胞置于37℃、5％CO2静置培养；(7)细胞培养24h或48h后进行实验。
RAEC细胞小RNA提取吸出6孔板中培养基，预冷Hank’s液润洗细胞，加入500μL Lysis/Binding Buffer，轻荡数秒，细胞很快裂解，将细胞移入EP管，涡旋振荡均匀，其余步骤同第一章。
RAEC细胞miRNA逆转录qPCR(方法同第二章)。
RAEC细胞活性用常规的MTT检测
RAEC细胞CD31和Ki67的免疫荧光染色按常规免疫荧光染色方法进行
RAEC细胞迁移实验
体外RAEC细胞迁移实验使用Corning公司的Transwell系统检测。Transwell系统由Transwell小室和24孔培养板构成，本实验选用膜孔径8μm，主要步骤如下：(1)胰蛋白酶消化收集对数生长期的RAEC细胞，轻轻吹打，制成细胞悬液；(2)将细胞悬液接种于Transwell上室；(3)37℃、5％CO2条件下，细胞饥饿培养12h后，进行细胞转染。每组2个复孔；(4)Transwell下室加入含10％FBS的培养基；(5)37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h；(6)取出小室，沾有0.01mol/LPBS的棉签轻轻擦去小室上层细胞；(7)将小室放入预先装好95％酒精的24孔板内，室温固定30min；(8)吸去酒精，加入0.1％结晶紫(双蒸水配制)，室温染色10min；(9)1套复孔，自来水洗去多余染料，翻转聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置于载玻片上，中性树脂封片剂封片，普通光学显微镜拍照；(10)另1套复孔，自来水洗去多余染料，室温下晾干，置于预先装好100μL 33％醋酸(双蒸水配制)的24孔板，洗下结晶紫，酶标仪(波长570nm)测定各孔的吸光度值，记录结果。
RAEC内皮管形成实验
(1)48孔板平放于冰上，每孔加入基质胶60μL，4℃平衡5min；(2)置于37℃、5％CO2培养箱中1h；(2)胰蛋白酶消化收集转染24h的RAEC细胞接种于48孔板，约2.5×104个/孔；3)37℃、5％CO2培养6h，倒置显微镜下观察并拍照。实验动物分组及动物模型
健康成年SD大鼠20只，随机分为antagomir-352组和antagomir-cont组，动物存活1周，每组10只(20侧)，分别用于血管造影、组织学检测和miRNA及总RNA提取。
体内敲除miR-352模型构建方法采用股动脉插管渗透性迷你泵(Alzet)每小时缓释渗透antagomir-352的方法。在10％水合氯醛溶液(400mg/Kg体重)腹腔麻醉下，小心分离出股动脉。在腹股沟韧带稍下方缝线双结扎股动脉近心端，血管夹阻断远心端股动脉，显微剪于股动脉中段剪开切口，注意不要剪断血管，肝素钠生理盐水冲洗切口，小心插入股动脉导管，缝线固定，胶囊固定于大腿内侧皮下，3-0缝合线依次缝合筋膜、皮肤，碘伏再次消毒。手术过程中注意无菌操作，大鼠单笼喂养，自由摄取饲料、饮用水，术后注射抗生素预防感染，并观察伤口情况及后肢活动情况。动物存活1周。
取材、保存
方法同前
血管造影
方法同前
苏木素-伊红(H.E.)染色
组织Ki67和α-actin的免疫荧光染色
方法同前
miRNA提取与富集
方法同前
组织miRNA逆转录qPCR
方法同前
结果观察
免疫荧光细胞化学染色用荧光显微镜采集图像。Ki67免疫阳性细胞的计数在荧光显微镜下进行，计数采用双盲法，在40倍目镜下，对符合阳性染色且细胞核染色的细胞进行计数，阳性细胞率(％)＝(阳性细胞数量/所有细胞核数量)×100％。
基质胶成管形结果在倒置显微镜下扫描拍片，在40倍目镜下，5个随机视野里计算节点数目，图像输入Image J软件，计算管的累计长度。
血管造影的侧支血管数量由5个经培训的熟练观测者使用重复法计数获得，5个观测者均不知样本详细资料。
H.E.染色切片在普通光学显微镜下观察，记录结果，并拍照生成图片。然后将图片输入Image-Pro Plus 6.0软件，按软件操作说明进行，选取血管管腔作为对象测量面积，单位以μm2表示。
Taqman RT-qPCR结果记录Ct值，计算miRNA相对表达量＝(2-ΔCt)×1000
数据分析
以上所得实验数据用均数±标准误表示，资料的统计学分析均采用SPSS17.0统计软件和GraphPad Prism 5软件分析完成。多组资料比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，多重比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法，两组计量资料采用Student t检验，计数资料采用卡方(χ2)检验。所有数据分析以P<0.05(two-sided)差异有统计学意义。
实验结果
miR-352的原位杂交
结果显示，miR-352的表达位于侧支血管壁的内膜侧。1w后，和单纯股动脉结扎组比较，miR-352在动-静脉吻合侧的侧支血管的表达下降。
3.2.2传代的RAEC细胞形态及鉴定结果和阴性转染对照
细胞传代48h后，倒置显微镜下可观察到细胞贴壁生长，细胞为外形光亮饱满，呈近似三角形或扁平多角形，细胞之间边界清楚；在细胞较密集时，连接成铺路鹅卵石样，为无粒的细胞质。
以内皮细胞的特异性标记物CD31，用于特异性抗体做免疫细胞化学反应鉴定，结果显示95％细胞为CD31免疫阳性细胞，阳性产物主要分布于RAEC的细胞膜和细胞质，特别是在细胞与细胞连接处表达明显增强。另外，齐氏生物公司已用vWF/FactorⅧ、CD31等内皮细胞特异性抗体鉴定，因此，可以确定此RAEC具有内皮细胞特性，并且生长状况良好，符合实验要求。
细胞转染24h后，在荧光显微镜下观察mimic阴性对照的红色荧光和DAPI蓝色荧光情况，记录四周及中央5个视野内所观察到的细胞数，计算转染率：
转染率(％)＝(红色荧光细胞数/总细胞数)×100％
RAEC转染率为86.4％。
转染后miR-352在内皮细胞的表达。
结果显示miR-352在各组培养的RAEC中均可检测到，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组无统计学差异，其中miR-352mimic组表达较mimic阴性对照组强(P<0.001)，提示miR-352过表达明显；miR-352inhibitor组表达较inhibitor阴性对照组弱(P<0.001)，提示miR-352表达受到了明显的抑制。
MTT比色法检测RAEC细胞活性
结果显示，转染4h后，各组RAEC的细胞活性无统计学差异；转染24h后，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组无统计学差异，其中miR-352mimic组较mimic阴性对照组活性低，为0.55倍(P<0.001)，提示过表达miR-352细胞活性下降；miR-352inhibitor组较inhibitor阴性对照组活性高，为1.59倍(P<0.001)，提示抑制miR-352表达后细胞活性上升。
RAEC细胞增殖(Ki67表达)
结果显示，Ki67表达于细胞核中，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组Ki67阳性细胞率分别为12.36±1.66％和17.28±1.84％无统计学差异，其中miR-352mimic组Ki67阳性细胞率为3.79±1.10％，是mimic阴性对照组0.30倍(P<0.05)，提示过表达miR-352细胞增殖下降；miR-352inhibitor组阳性细胞率为51.45±8.04％，是inhibitor阴性对照组2.98倍(P<0.05)，提示抑制miR-352表达后细胞增殖上升。
3.2.6RAEC细胞迁移
结果显示，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组RAEC结晶紫吸光度分别为0.5799±0.015和0.5943±0.019，无统计学差异，提示两组RAEC细胞迁移无差异；miR-352mimic组结晶紫吸光度为0.4237±0.010，较mimic阴性对照组低0.73倍(P<0.001)，提示过表达miR-352细胞迁移减少；miR-352inhibitor组结晶紫吸光度为0.7418±0.014，较inhibitor阴性对照组高1.25倍(P<0.001)，提示抑制miR-352表达后细胞迁移增多。
3.2.7RAEC内皮管形成
结果显示，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组RAEC管累计长度分别为5869±124.1μm和5854±141.8μm，节点数分别为44.89±1.63和44.22±1.20，无统计学差异，提示两组RAEC内皮管形成情况无差异；miR-352mimic组管累计长度为3733±105.8μm，节点数为33.89±1.09，较mimic阴性对照组，分别为0.64倍(P<0.001)和0.75倍(P<0.001)，提示过表达miR-352细胞内皮管能力下降；miR-352inhibitor组管累计长度为6941±126.5μm，节点数为54.56±0.67，较inhibitor阴性对照组，分别为1.19倍(P<0.001)和1.23倍(P<0.001)，提示抑制miR-352表达后细胞内皮管能力增强。
3.2.8miR-352在侧支血管的表达情况
采用Taqman qRT-PCR检测miR-352在侧支血管的表达情况。
结果显示，较antagomir-cont组，施用antagomir-352后侧支血管miR-352表达明显下调(P<0.001)。
3.2.9血管造影
结果显示，动物存活1w后，antagomir-cont组和antagomir-352组大鼠后肢侧支血管数目分别为5.4±0.51和8.6±0.75，施用antagomir-352治疗的大鼠后肢的侧支血管数目明显增加(P<0.01)。
用H.E.染色显示两组模型侧支血管的各层结构形态结构改变。
结果显示，动物存活1w后，antagomir-352组较antagomir-cont组，侧支血管的各层重构更强烈，内膜增厚明显，外膜成纤维细胞更多，血管管径更大。antagomir-cont组和antagomir-352组的侧支血管管腔面积分别为5564±685.9μm2、14230±812μm2，antagomir-352组的侧支血管管腔面积是antagomir-cont组的2.6倍(P＜0.01)，施用antagomir-352治疗的大鼠后肢的侧支血管管腔明显增大。
3.2.11侧支血管的细胞增殖情况
本实验以Ki67作为细胞增殖指标，用免疫荧光组织化学法检测侧支血管各层结构的细胞增殖情况。
结果显示，Ki67可表达于侧支血管各层的细胞核中。动物存活1w后，antagomir-cont组大鼠和antagomir-352组后肢侧支血管Ki67阳性细胞率分别为15.09±1.04％和29.06±2.31％，施用antagomir-352治疗的大鼠后肢的侧支血管Ki67细胞阳性率明显增加(P＜0.01)。
通过生物信息学软件预测，得知miR-352潜在的一些靶基因与血管生成、血管细胞增殖和迁移等功能相关。为了研究miR-352对侧支血管生长的作用，我们首先用原位杂交对miR-352在侧支血管的表达进行了定位，发现内皮细胞和平滑肌细胞均表达miR-352。并且miR-352的表达在股动脉结扎+动静脉吻合侧的侧支血管低于单纯股动脉结扎侧的侧支血管。这一结果和miRNA芯片及RT-PCR结果一致。由于血管内皮细胞直接暴露于FSS，在侧支血管生长过程具有十分重要的作用[68]。因此，我们取内皮细胞作为体外研究miR-352作用的对象。我们通过转染miR-352mimic或inhibitor使大鼠主动脉内皮细胞过表达或抑制miR-352，随后对RAEC的功能进行检测。结果显示，内皮细胞过表达miR-352后，细胞活性下降，增殖减少，其迁移和内皮管形成的能力减弱；而抑制内皮细胞miR-352表达后，细胞活性强于对照组细胞，细胞增殖也明显加强，迁移和内皮管形成的能力较阴性对照细胞有所提高。这些结果表明，miR-352对内皮细胞有较强的抗血管生成作用。
在细胞培养实验显示miR-352对内皮细胞的活性、增殖、迁移和内皮管形成具有负调控作用的基础上，我们对miR-352对侧支血管的作用进行研究。在实验中，我们将含有antagomir-352的渗透性微量泵对结扎后的大鼠股动脉近端进行插管，以抑制侧支血管miR-352的表达。随后，我们通过血管造影、H.E.染色和免疫荧光组织化学染色等方法，检测miR-352抑制后侧支血管的生长情况。结果显示，抑制侧支血管miR-352表达后，侧支血管生长明显活跃，细胞增殖和侧支血管的数目都较单纯股动脉结扎对照组明显增多。上述实验结果验证了我们的设想，即miR-352受持续高FSS的调控，负性调节侧支血管生长。
miR-352也出现在其他研究者的miRNA表达谱中。Ji等[69]在球囊损伤后大鼠颈动脉检测到高表达miR-352；Lin等[70]在氧化应激损伤的动脉平滑肌细胞也检测到miR-352表达上调，这些研究提示miR-352可能参与调节动脉新生内膜损伤重建。Tao等[71]在MCAO大鼠脑缺血再灌注模型中，再灌注3d大脑皮层检测到表达下调的miR-352，并检测到miR-352靶基因己糖胺酶B(Hexb)表达上调，且伴随着溶酶体标志物的表达上升；在脊髓缺血再灌注的大鼠模型中，损伤48h后也有miR-352表达的下调[72]，这些提示miR-352可能与缺血再灌注损伤后血管重塑及细胞自噬-溶酶体系统的信号启动相关。
实验试剂、材料和设备
(1)主要试剂：
(2)主要材料、设备：
4.1.2靶基因验证实验
4.1.2.1双荧光素酶报告与miRNA mimic共转染实验
通过生物信息学软件miRDB(mirdb.org/miRDB)、targetScan(www.targetscan.org)、miranda(www.microrna.org)预测miR-352可能的靶基因，其中IGF2R在相同的兔模型中被报到。因此，选取其为候选靶基因。
针对大鼠IGF2R基因委托广州锐博生物有限公司构建pmiR-RB-ReportTM报告基因质粒载体及单位点突变载体阴性对照。
(1)胰蛋白酶消化收集对数生长期的RAEC细胞，轻轻吹打，制成细胞悬液；(2)细胞计数后，将细胞悬液接种于24孔板，约5×104个/孔；(3)37℃、5％CO2培养箱中培养12h，细胞贴壁后，进行共转染实验；(4)Reduced Serum Medium稀释3000，充分混匀，室温放置5min(5)OPTI-MEM培养基稀释miRNA(50nM)和靶基因3’UTR双荧光素报告酶载体质粒(100ng/μL)，充分混匀，室温放置5min；(6)将稀释的3000加入稀释的RNA(1：1比例)，充分混匀，室温孵育20min；(7)将混合物加入ECM，轻轻晃动使其分布均匀，细胞置于37℃、5％CO2静置培养；(8)细胞培养48h后进行实验；
双荧光素酶报告基因实验
根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)说明进行操作：
3)1×Stop&Reagent：将50×Stop&Substrate加入到Stop&Buffer，避光振荡10s，使终浓度成为1倍浓度，-20℃保存；siIGF2R和miRNA inhibitor共转染实验
表8
(1)胰蛋白酶消化收集对数生长期的RAEC细胞，轻轻吹打，制成细胞悬液；(2)细胞计数后，将细胞悬液接种于相应的孔板；(3)37℃、5％CO2培养箱中培养12h，细胞贴壁后，进行共转染实验；(4)Reduced Serum Medium稀释3000，充分混匀，室温放置5min；(5)OPTI-MEM培养基稀释siRNA(50nM)和miRNA inhibitor(100nM)，充分混匀，室温放置5min(6)将稀释的3000加入稀释的RNA(1：1比例)，充分混匀，室温孵育20min；(7)将混合物加入ECM，轻轻晃动使其分布均匀，细胞置于37℃、5％CO2静置培养；(8)细胞培养48h后进行实验；
RAEC细胞IGF2R的免疫荧光细胞化学染色按常规方法进行
RAEC细胞总RNA的提取按常规方法进行
RT-PCR
逆转录(RT)
按照RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的说明书进行操作，
表9
qPCR根据Faststart Universal SYBR Green Master(Roche)说明书操作进行。
表10
表11
蛋白质提取
蛋白质裂解
按照RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合物(康为世纪)说明书操作，
蛋白质浓度测定
按照蛋白质定量BCA试剂盒(康为世纪)说明书操作，
蛋白质变性
(1)按体积比1：4将5×变性Loading加入样品；(2)EP管盖好盖子，封口膜封好，胶带缠紧，EP管插入多孔橡胶板，放入沸水，煮沸10min；(3)冷却后分装，-20℃保存。
4.1.8蛋白质免疫印迹(Western blot)按化学发光的常规方法进行
RAEC细胞Ki67的免疫荧光细胞化学染色
方法同前
RAEC内皮管形成实验
方法同前
实验动物分组及动物模型
健康成年SD大鼠随机分为单纯股动脉结扎组、动静脉吻合组、antagomir-352组和antagomir-cont组。单纯股动脉结扎组、动静脉吻合组处理同第二章，antagomir-352组、antagomir-cont组处理同前
组织总RNA提取
将组织置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，其余步骤同细胞总RNA提取。RT-PCR
步骤同前。
组织IGF2R、IGF2、Beclin-1、Caspase3免疫荧光染色按常规方法进行
结果观察
双荧光素报告酶系统将各孔hRluc的荧光值与hluc的荧光值比较，将比值与对照孔的比值进行统计分析。
免疫荧光细胞化学染色和组织染色图像经荧光显微镜采集，采用Nikon EZ-C1 3.90FreeViewer定量测量软件对各组IGF2R、IGF2、Beclin-1免疫阳性产物的荧光强度和数量进行测量，荧光强度以Arbitary Units(AU)/μm2单位表示。Caspase3免疫阳性细胞的计数在荧光显微镜下扫描拍片后进行，计数采用双盲法，在40倍目镜下，对符合阳性染色且细胞核染色的细胞进行计数，阳性细胞率(％)＝(阳性细胞数量/所有细胞核数量)×100％。
RT-qPCR结果记录Ct值，计算mRNA相对表达量＝(2-ΔCt)×1000
蛋白免疫印迹实验获得的胶片，用激光扫描仪扫描获得图片，用Image-pro plus(IPP)6.0软件测定各蛋白条带的积分光密度(Integral Optical Density，IOD)值，计算相对蛋白量：
相对蛋白量＝目的蛋白条带的IOD值/相应内参蛋白条带的IOD值
统计学分析
以上所得实验数据用均数±标准误表示，资料的统计学分析均采用SPSS17.0统计软件和GraphPad Prism 5软件分析完成。多组资料比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，多重比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法，两组计量资料采用Student t检验，计数资料采用卡方(χ2)检验。所有数据分析以P<0.05(two-sided)差异有统计学意义。
实验结果
miR-352的靶基因预测及验证
miR-352的靶基因预测
miRNA主要是通过与靶基因3’非翻译区(3’UTR)结合，从而抑制靶基因的表达，实现对细胞功能的调控。通过miRNA靶基因生物信息学预测软件miRDB、targetScan、miranda对miR-352下游靶基因进行预测。IGF2R在3个软件中均预测为miR-352的潜在靶基因，我们通过targetscan对IGF2R与miR-352的结合位点进行分析。
双荧光素报告酶系统验证
为了证实IGF2R是miR-352的靶基因，我们将含miR-352结合位点的IGF2R靶基因3’UTR片段荧光素酶检测报告质粒或IGF2R的3’UTR缺失miRNA结合位点的突变序列报告质粒与miR-352mimic或mimic阴性对照共转染RAEC。
结果显示，IGF2R野生型质粒与miR-352mimic共转染后，Renilla与Luiciferase的比值为0.540±0.067，而突变型质粒与miR-352mimic共转染后，比值为1.373±0.022，高于前者(P<0.05)；而mimic阴性对照与野生型和突变型的质粒共转染后，比值分别为1.389±0.141、1.311±0.081，没有统计学差异，表明miR-352能够与IGF2R的3’UTR结合，调控其表达。
RAEC细胞转染miRNA后IGF2R表达情况
用免疫荧光细胞化学法、RT-PCR和Western blot分别检测细胞转染后IGF2RmRNA及蛋白表达情况。
RAEC细胞IGF2R的免疫荧光细胞化学染色
结果显示，miR-352mimic组IGF2R免疫荧光强度较mimic阴性对照组减弱，IGF2R在胞浆和胞膜的表达减少；miR-352inhibitor组IGF2R免疫荧光强度较inhibitor阴性对照组增强，可见胞浆和胞膜中有较多IGF2R阳性颗粒。
RAEC细胞IGF2R mRNA表达水平
结果显示，IGF2R在各组培养的RAEC中均可检测到，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组无统计学差异，其中miR-352mimic组表达较mimic阴性对照组弱(P<0.001)，提示miR-352过表达后，IGF2R mRNA水平下调；miR-352inhibitor组表达较inhibitor阴性对照组强(P<0.001)，提示miR-352表达受到抑制后，IGF2R mRNA水平上调。
RAEC细胞IGF2R蛋白表达水平
结果显示，各组培养的RAEC中均可检测到IGF2R蛋白表达，位于300kd处。mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组无统计学差异，其中miR-352mimic组IGF2R表达较mimic阴性对照组弱(P<0.001)，提示miR-352过表达后，IGF2R蛋白表达下调；miR-352inhibitor组IGF2R表达较inhibitor阴性对照组强(P<0.001)，提示miR-352表达受到抑制后，IGF2R蛋白表达上调。
RAEC细胞共转染siRNA后IGF2R mRNA表达水平
为明确IGF2R-siRNA的抑制效果，我们分别提取miRNA inhibitor和siRNA共转染细胞，RT-PCR检测细胞内IGF2R mRNA表达水平。结果显示，共转染siIGF2R后，较共转染siNC阴性对照组，细胞IGF2R mRNA水平下调(P<0.001，P<0.001)，提示siIGF2R转染后能有效抑制细胞IGF2R mRNA水平。
RAEC细胞共转染siRNA后细胞增殖(Ki67)
结果显示，共转染siNC阴性对照后，miR-352抑制剂和抑制剂对照组Ki67阳性细胞率分别为51.45±8.04％和17.28±1.84％；共转染siIGF2R后，Ki67阳性细胞率分别为12.36±1.66％和4.12±0.85％，Ki67阳性细胞率下调分别为0.24倍(P<0.01)和0.24倍(P<0.01)，提示抑制IGF2R后能有效抑制细胞增殖。
RAEC内皮管形成
结果显示，共转染siNC阴性对照后，miR-352抑制剂和抑制剂对照组RAEC管累计长度分别为6911±169.5μm和5944±163.3μm，节点数分别为55.11±1.21和44.33±1.55；共转染siIGF2R后，RAEC管累计长度分别为4498±123.0μm和2664±111.9μm，节点数分别为26.89±2.17和19.11±1.14，管累计长度(P<0.001，P<0.001)和节点数(P<0.001，P<0.001)都有明显减少，提示抑制IGF2R后内皮管形成能力下降。
RAEC细胞转染后LC3b的蛋白表达水平
LC3b作为自噬标志物，在自噬体形成时，胞浆型LC3b(即LC3b-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型LC3b(即LC3-Ⅱ)，LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值可以反映细胞自噬水平。
结果显示，mimic阴性对照组和inhibitor阴性对照组LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值无统计学差异，其中miR-352mimic组LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值较mimic阴性对照组低(P<0.01)，提示miR-352过表达后，LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值下调；miR-352inhibitor组LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值较inhibitor阴性对照组强(P<0.001)，提示miR-352表达抑制后，LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值上调。siIGF2R与miR-352inhibitor共转染组与siRNA阴性对照与miR-352inhibitor共转染组相比，LC3b-Ⅱ与LC3b-Ⅰ比值下调(P<0.001)。
侧支血管IGF2R、IGF2、Beclin-1、ATG5、LAMP1、CSTL、CTSS的mRNA表达水平
前面部分结果显示miR-352与溶酶体水解酶转运及细胞自噬密切相关，为了明确提高FSS或抑制miR-352后，侧支血管溶酶体-自噬途径情况，我们检测了侧支血管的IGF2R、IGF2，自噬相关Beclin-1、ATG5、LC3A、LC3B及溶酶体标志物LAMP1，溶酶体酶CSTL和CTSS的mRNA表达情况。结果显示，单纯股动脉结扎组和antagomir阴性对照组IGF2R、IGF2、Beclin-1、ATG5、LC3A、LC3B、LAMP1、CTSL、CTSS表达均无统计学差异，其中动静脉吻合组IGF2R、IGF2、Beclin-1、ATG5、LC3A、LC3B、LAMP1、CTSL、CTSS表达较单纯股动脉结扎组强(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.05、P<0.001)，提示提高FSS后，侧支血管以上指标mRNA表达均下调；antagomir-352组IGF2R、IGF2、Beclin-1、ATG5、LC3A、LC3B、LAMP1、CTSL、CTSS表达较antagomir阴性对照组强(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)，提示miR-352表达抑制后，侧支血管以上的mRNA表达均上调。
侧支血管IGF2R的免疫荧光组织化学染色情况
我们采用免疫荧光组织化学染色法检测IGF2R，结果显示，IGF2R与内皮细胞标志物CD31存在共表达(箭头所示)，单纯股动动脉结扎组、动静脉吻合组、antagomir阴性对照组和antagomir-352组IGF2R荧光强度分别为36.32±0.946AU/μm2、40.06±0.556AU/μm2、34.91±1.215AU/μm2、46.03±0.911AU/μm2。单纯股动脉结扎组和antagomir阴性对照组IGF2R表达无统计学差异，其中动静脉吻合组IGF2R表达较单纯股动脉结扎组强，为1.10倍(P<0.05)，提示提高FSS后，侧支血管IGF2R上调；antagomir-352组IGF2R表达较antagomir阴性对照组强，为1.32倍(P<0.01)，提示miR-352表达抑制后，侧支血管IGF2R表达均上调。
侧支血管IGF2的免疫荧光组织化学染色情况
采用免疫荧光组织化学染色法检测IGF2表达情况，探究高FSS或miR-352对侧支血管IGF2R-IGF2通路调节情况。
结果显示，IGF2表达于侧支血管内膜及中膜，单纯股动脉结扎组、动静脉吻合组、antagomir阴性对照组和antagomir-352组IGF2荧光强度分别为17.05±0.633AU/μm2、91.17±7.341AU/μm2、22.01±1.969AU/μm2、41.27±1.096AU/μm2。单纯股动脉结扎组和antagomir阴性对照组IGF2表达无统计学差异，其中动静脉吻合组IGF2表达较单纯股动脉结扎组强，为5.35倍(P<0.001)，提示提高FSS后，侧支血管IGF2表达均上调；antagomir-352组IGF2表达较antagomir阴性对照组强，为1.88倍(P<0.001)，提示miR-352表达抑制后，侧支血管IGF2表达上调。
侧支血管Beclin-1的免疫荧光组织化学染色情况
我们采用免疫荧光组织化学染色法检测Beclin-1，进一步明确提高FSS或抑制miR-352后，侧支血管溶酶体-自噬途径情况。
结果显示，Beclin-1表达于侧支血管的内膜与中膜，单纯股动脉结扎组、动静脉吻合组、antagomir阴性对照组和antagomir-352组Beclin-1荧光强度分别为44.01±1.924AU/μm2、54.06±1.741AU/μm2、35.97±5.139AU/μm2、62.04±7.158AU/μm2。单纯股动脉结扎组和antagomir阴性对照组Beclin-1表达无统计学差异，其中动静脉吻合组Beclin-1表达较单纯股动脉结扎组强，为1.23倍(P<0.05)，提示提高FSS后，侧支血管Beclin-1表达上调，细胞自噬增强；antagomir-352组Beclin-1表达较antagomir阴性对照组强，为1.72倍(P<0.05)，提示miR-352表达抑制后，侧支血管Beclin-1表达上调，细胞自噬增强。
侧支血管细胞凋亡情况
本实验以Caspase3作为细胞凋亡指标，用免疫荧光组织化学法检测侧支血管各层结构的细胞凋亡情况。
结果显示，Caspase3可表达于侧支血管各层的细胞核中。结果显示，单纯股动脉结扎组和antagomir阴性对照组Caspase3阳性细胞率分别为26.76±0.619％、26.24±1.008％，无统计学差异，其中动静脉吻合组Caspase3阳性细胞率为14.38±0.650％，较单纯股动脉结扎组Caspase3表达下降(P<0.001)，提示提高FSS后，侧支血管细胞凋亡减少；antagomir-352组侧支血管Caspase3阳性细胞率为18.68±1.030％，较antagomir阴性对照组显著减少(P<0.01)，提示miR-352表达抑制后，侧支血管细胞凋亡减少。