一种集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法及其用途与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法及其用途。

背景技术：

恶性肿瘤依旧是引发全世界人口死亡的排前疾病，其主要治疗方式是手术、放疗、化疗。然而，手术治疗和放疗、化疗对病人损伤较大，且化疗普遍面临着多药耐药的问题。因此，寻找一种非侵入的病人能耐受的肿瘤治疗方法是临床研究的热点。

热疗是通过各种方法使全身和(或)局部组织加热至有效治疗的温度范围并维持一定时间来杀灭肿瘤细胞的一种方法。热疗本身对肿瘤细胞有直接的杀伤作用，热疗能使癌细胞的线粒体膜、溶酶体膜、内质网膜发生破坏，并且由于溶酶体酸性水解酶的大量释放，导致胞膜破裂，胞浆外溢；造成dna损伤的增加及抑制dna的合成；影响相关基因促进肿瘤细胞凋亡。

激光热疗相较于手术、放疗、化疗，有着无创或微创，恢复时间短，并发症少的优点。但由于肿瘤内部热分布不均匀，尤其是在大血管周边区域，热量随着血液循环消散，单纯热疗很难杀死所有肿瘤细胞，治疗结果差异大。因此，仍需要联合其他治疗方法来提高热疗的疗效，临床研究表明，热疗-化疗的联合治疗可以明显增强抗肿瘤疗效。

光热疗法(photothermaltherapy，ptt)是一种新出现的非侵入性的肿瘤治疗方法。它是利用各种致热源的热效应，在光照条件下将肿瘤加热至有效治疗温度并维持一定的时间以将肿瘤细胞杀死的治疗策略。其中光热剂在近红外(nir)区有吸收特性，可将光能转换成热能并局部升温，最终导致不可逆的细胞损伤(肿瘤细胞凋亡和凝固性坏死)。近红外激光诱导的ptt相较于传统的手术治疗和化疗有着明显的优势，包括无创，恢复时间短，并发率低，以及治疗过程可随时监测。然而，由于肿瘤内热分布不均匀，单独光热治疗不足以杀死所有的肿瘤细胞，导致肿瘤消融不完全、肿瘤复发等结果。联合治疗可以提高治疗的疗效同时降低副作用，已成为一种重要的肿瘤治疗策略。

迄今为止，已有多种联合热疗的治疗方法，其中以ptt联合化疗在各联合治疗中最有前景。临床研究表明，热疗化疗的联合治疗可以明显增强抗肿瘤疗效，主要由于热疗在杀死癌细胞的同时，有助于化疗药物进入肿瘤细胞和增加化疗药物的细胞毒性。ptt和化疗药物有着不同的治疗机制。前者主要通过高热来杀死肿瘤细胞，是一种物理治疗方式。近红外光的波长范围在700至1100nm之间，生物体对近红外光的吸收很小，导致近红外光对机体的穿透能力很强，可有效地渗透到生物组织并在ptt制剂的条件下选择性地加热。激光照射后光热制剂将光能转化为热能，局部升温从而造成肿瘤细胞的不可逆损伤。后者，化疗是多种肿瘤的治疗中最常用的治疗方法之一。热疗和化疗有着各自作用机制和细胞毒性，热疗联合化疗药物通常产生协同效应。

当前，纳米技术的迅猛发展，纳米材料由于其纳米尺度所固有的独特物理性质为热疗联合化疗提供了一个有效的平台，新型纳米系统的热疗化疗联合治疗研究正成为肿瘤治疗的研究热点。进来多种多功能的笼、金纳米棒、cus纳米笼、硅纳米粒等。这些载药系统所发挥的协同效用已经被体外及在体实验所证明，但是这些材料的缺点在于药物释放缓慢，且不可控制。在肿瘤的周边区域或是临近大血管的区域，热疗后温度在41℃-45℃，不足以破坏这些纳米载体从而释放药物。

温度敏感脂质体药物载体(temperature-sensitive-liposomes,tsl)是一种能携载药物并且在高温条件下有效地释放药物的脂质体。当温度达到脂质材料的相变温度时，脂质体双分子膜在由“凝胶”态转变到“液晶”态结构时，其磷脂的脂酰链紊乱度及活动度增加，膜的流动性增大，所包封的药物迅速释放。在热疗的高温不足以杀死所有肿瘤细胞的情况下，热疗产生的高热已经足以导致温度敏感性脂质体发生相变，并在瘤内释药。

技术实现要素：

为了解决现有的恶性肿瘤治疗存在的不足，本发明目的在于提供一种集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法及其用途。

本发明采取的技术方案是：

本发明的集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法的具体步骤如下：

将脂质与ir-780混溶于氯仿中，边涡旋边氮气吹干成均匀薄膜，真空抽去残留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，将脂质薄膜溶解，在水浴中超声振荡至澄清，制成ir-780脂质体，将已形成的脂质体用挤出仪从聚碳酸酯膜中反复挤出，制备成粒径均匀的脂质体，将ir-780脂质体装于透析袋中，放入pbs溶液中透析，将脂质体内部的硫酸铵替换成pbs，将阿霉素溶液逐滴加入脂质体中，边加边振荡，利用硫酸铵梯度法将阿霉素载入脂质体内核，制得本发明的纳米脂质体。

所述的脂质是由二棕榈酰磷脂酰胆碱，单棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000组成，三者的摩尔比为86：10：4。

ir-780与脂质的质量比为1～10：100，优选为5:100。

真空抽氯仿的时间为3h。

水浴温度为65℃。

所述的聚碳酸酯膜为200nm(脂质体直径)。

pbs溶液中透析的时间为4h。

所述的阿霉素溶液的浓度为1mg/ml，阿霉素与脂质的质量比为1:10～30，优选为1:20。

所述的硫酸铵梯度法是在制备空白脂质体后，去除脂质体外水相中的铵离子，内水相中一个铵离子电离后形成一个氨分子和一个质子，氨分子在跨膜扩散作用下同样被除去，这就形成了内外水相间的ph梯度，未载药做好了准备，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驱动下，跨膜进入脂质体内水相中，并和硫酸根离子成盐，成盐后形成胶态沉淀，聚集于内水相中，另外阿霉素分子和质子结合形成其离子态，从而失去膜通透性，而不会反向扩散出去。

本发明的方法制备的纳米脂质体可以用于制备治疗肿瘤的药物。

本发明的积极效果如下：

本发明将光敏剂ir-780包封于脂质体双侧脂质之间，同时将化疗药物阿霉素包封于脂质体中心，制备成一种针对恶性肿瘤治疗的ditsl。本发明的纳米脂质体性质稳定，粒径分布均匀，在激光作用下可产生高温，杀灭癌细胞，高温还可使纳米脂质体壳膜溶解，释放阿霉素，进一步灭活残留的癌细胞。

附图说明

图1是本发明的脂质体的制备方法的示意图。

图2是本发明的方法制备的脂质体的粒径分布图。

图3是热化疗后的细胞活性定量图；(a)加入pbs、空白脂质体、dtsl、itsl和ditsl后细胞在有无激光辐照(0.6w/cm²,5min)下的生存率。热化疗组细胞生存率最低。(b)增强激光辐照强度后(0.8w/cm²,5min)，热疗组和热化疗组细胞存活率进一步减低。

图4是各处理组治疗21天后小鼠肿瘤图，圈内示肿瘤。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

一、ditsl的制备及性质检测

1.方法

1.1dox(阿霉素)/ir-780温度敏感性脂质体的制备

取dppc，mppc，dspe-peg2000(摩尔比为86：10：4)，与ir-780(ir-780：脂质＝5：100,质量比)混溶于氯仿中，边涡旋边氮气吹干成均匀薄膜，真空3h抽去残留氯仿。加入250mm(nh4)2so4溶液，将脂质薄膜溶解，在65℃水浴中超声振荡至澄清，制成ir-780脂质体(itsl)。将已形成的脂质体用挤出仪从200nm聚碳酸酯膜中反复挤出，制备成粒径均匀的脂质体。将ir-780脂质体装于透析袋中，放入pbs溶液中透析4h，将脂质体内部的硫酸铵替换成pbs。dox溶液(1mg/ml)逐滴加入脂质体中，边加边振荡，利用硫酸铵梯度法将dox载入脂质体内核。阿霉素脂质体(dtsl)在成膜过程中只加入磷脂，其余制作方法如前所述。

1.2ditsl表征

各脂质体的粒径大小、粒径分布、分散指数(pdi)、表面电位均由马尔文zeta粒度仪在室温下测得。dtsl，itsl和ditsl的吸收光谱由紫外-可见光光谱仪测得，dox在480nm激发，ir-780在780nm激发。dox和ir-780的包封率的测量方法如下：先用荧光分光光度计得出dox和ir-780的荧光值-浓度标准曲线。将制备好的各脂质体放入超滤管，通过超速离心法(20,000r/min，30min)将脂质体和游离的药物分离出来，用荧光分光光度计结合dox和ir-780的荧光值-浓度标准曲线测得包封在脂质体内部的药物浓度，再算出包封量。药物包封率计算方法见公式(1)。

包封率(％)＝(包封的药物量)/(初始加入量)×100。(1)

1.3ditsl在生物环境下的稳定性

我们使用了不同的缓冲液来测试ditsl在不同生物环境下的稳定性，包括pbs、30％血清、50％血清和90％血清缓冲液。ditsl悬浮液(1mm脂质)在上述缓冲液中在37℃孵育24h(ib)。以未经孵育的ditsl作为空白对照(i0)，以1％tritonx-100处理过完全破裂的ditsl作为阳性对照(i100)。用荧光光谱仪测得各个条件下dox的荧光值，dox释放率计算方法见公式(2)。ditsl的稳定性以100％-dox释放率来表示。

dox释放率(％)＝(ib-i0)/(i100-i0)(2)

1.4激光诱导的体外升温

pbs,dtsl(dox:15μg/ml),itsl(ir-780:15μg/ml),以及ditsl(ir-780:15μg/ml,dox:15μg/ml)各1ml加入小试管中。用近红外激光(808nm,0.8w/cm²)对每个样本各照射5min。在对样本进行激光照射的同时，每隔30秒，用红外热像仪对各个脂质体溶液的温度进行测量并记录。

1.5ditsl的温度敏感性药物释放

将ditsl加入90％血清的pbs中，分别在37℃，42℃和50℃条件下进行金属浴。分别于20s,40s,1min,2min,3min,4min,5min,10min和30min取样，每次取样后及时补充相同量的、相同温度下的90％血清pbs。同时以未经孵育的ditsl的荧光值作为空白对照(i0)，ditsl用1％tritonx-100破乳后测定脂质体中dox的荧光值作为总量(i100)，每次取样样品的荧光值为it，依次累加，计算药物在各个时间点各个温度下的累计释放率。

1.6激光控制的ditsl药物释放

激光控制的药物释放实验方法如下：将ditsl和dtsl置入90％血清的pbs中,用近红外激光(808nm,0.8w/cm²)分别照射20s,40s,1min,2min,3min,4min,和5min，测得辐照不同时间两种脂质体的dox释放情况，此外，测相同时间点ditsl无激光辐照时的dox释放量。

2.检测结果

2.1脂质体的制作与表征

各脂质体的制作过程如图1所示，先薄膜水化法制备itsl(绿色)，再经过硫酸铵梯度法载入dox(红色)，ditsl呈深棕色。由于ir-780与dox的亲水性不同，ir-780溶在脂质体脂质双层中，dox包封在脂质体的亲水内核中。各载药脂质体的粒径大小、分散指数(pdi)、表面电位及包封率见表1。ditsl粒径在138.98nm左右，pdi约0.32。dtsl、itsl和空白脂质体的粒径稍小，分别约94.05nm,84.551nm和77.53nm。所有脂质体略带负电位，zeta电位约在-10左右。dox在ditsl的包封率约92.52％，ir-780在ditsl的包封率约94.47％。dtsl中dox的包封率约97.39％，itsl中ir-780的包封率约99.98％。

表1.空白脂质体、itsl、dtsl和ditsl的表征

数据为均值±标准差，n＝3,；药脂比为药与脂质的质量比；pdi为多分散指数。

从紫外-可见分光光度计测得的脂质体光学特性可见。itsl在793nm处有最大吸收峰，符合ir-780吸收特征，dtsl在492nm处有最大吸收，与dox吸收峰相似。ditsl同时在793nm和492nm有显著吸收峰，ditsl在近红外区的强烈吸收特性也证明了ir-780适合作为热疗试剂。

各脂质体在不同生物条件下的稳定性，在孵育12h以内，ditsl药物释放较慢。在90％血清缓冲液37℃孵育24h后，ditsl中的dox全部释放，在包30％血清和50％血清中，ditsl的稳定性稍好，分别释放约57％和53％的dox。而在pbs中释放的很少(约23％)。结果表明tsl在pbs中稳定性较好，但在高浓度血清中稳定性较差。2.2激光诱导的体外升温

为了评估ditsl的光热转换效率，我们用红外热像仪探测激光照射下ditsl的升温情况。在0.8w/cm²激光照射五分钟内，ditsl和itsl温度最高分别升到54.2℃和54.1℃。而dtsl和pbs组只升高了9.7℃和9.3℃，最终上升到34℃左右。在缺乏光热制剂时，激光不能有效地转化成热能，所以dtsl和pbs组只有少量的温度升高。而ditsl和itsl由于ir-780的存在温度升高明显且迅速。itsl和ditsl在温度升高一段时间后，温度会缓慢下降，这是由于ir-780光照一段时间后发生了分子之间的自猝灭。

2.3ditsl的药物释放特性

我们用不同温度的金属浴孵育ditsl，测试ditsl的温度敏感释放特性。ditsl中dox的释放在体温和高热之间有着明显的差别。dox的累计释放率有两个节点，一个是在1min内，释放最为迅速，在42℃加热1min，ditsl释放了约40％的药物。第二个节点是在5min，恒温在42℃时，加热1min和5min之间dox的累积释放率增加趋势近乎线性，释放迅速，从40％增加到70％。在加热5min后，dox释放稍减缓，加热从5min到20min，累积释放率从66.9％±4.0％增加到73.9％±3.9％。dox随着加热时间延长而持续释放，在加热30min后，ditsl释放了78％的dox。在50℃时药物1min内释放更快，释放了约61％的dox，1min到30min的释放趋势与42℃时情况相仿，加热30min后，dox的释放率约90％。而其他条件相同的情况下，37℃时ditsl的释药速度和累计释放率均明显低于42℃和50℃，在30min最终释放了约22.8％的dox。

接着我们测试了近红外激光诱导的药物释放情况。如果没有激光辐照，ditsl的药物释放率较低，5分钟后释放率约8.9％。dtsl在激光辐照下的药物释放率与ditsl无激光情况相仿，5分钟后的药物释放率约11.2％。ditsl的药物释放率随着激光辐照的时间而增加，在一分钟内增加迅速，达到了56.0％，而后增加稍减缓，在5分钟后，药物释放率约80.1％，远远高出其他组。

二、ditsl热化疗治疗乳腺癌的体外实验

1.方法

1.1细胞培养

用dmem高糖培养基(加入10％胎牛血清以及1％青霉素和1％链霉素)于37℃，5％co2培养箱中培养4t1细胞，每3天更换培养基，0.25％胰蛋白酶消化传代。

1.2体外细胞摄取

乳腺癌4t1细胞种植在6孔板(1.2×10⁶个/孔)，将孔板置于细胞培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后，更换为含药量为5μg/ml、10μg/ml或20μg/mlditsl的新鲜培养基孵育1h、2h或3h，对照组中加入同等量的pbs溶液。孵育后pbs洗三次，洗去未被吞噬的脂质体。胰酶消化并收集细胞，用流式细胞仪分析细胞内ir-780和dox的荧光值。每个样本选一万个细胞，数据分析采用flowjo软件。

为进一步观察dtsl,itsl和ditsl在4t1的亚细胞定位，我们使用了激光共聚焦显微镜。取对数生长期的4t1乳腺癌细胞种于8孔激光共聚焦专用孔板中，每个板孔细胞数为2×10⁴，将孔板置于细胞培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后，更换分别含dtsl(10μg/mldox),itsl(10μg/mlir-780),和ditsl(10μg/mldox，10μg/mlir-780)的新鲜培养基。对照组中加入同等量的pbs溶液。在培养箱内培育3h后，吸去上层培养液，pbs洗3次，4％多聚甲醛固定15min，避光条件下dapi细胞核染色5min，pbs洗3次。dapi能够与dna强力结合，在荧光显微镜下发出蓝色荧光。dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。将孔板置于激光共聚焦下检测ditsl在4t1细胞的摄取情况。dapi的激发波长为340nm，发射波长为488nm，ir-780的激发波长为708nm，发射波长为760nm。

1.3细胞内的药物释放

取对数生长期的4t1乳腺癌细胞种于8孔激光共聚焦专用孔板中，每个板孔细胞数为2×10⁴，将孔板置于细胞培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后，再用含ditsl(10μg/mldox，10μg/mlir-780)培养基培养1h，pbs洗3次后用dapi细胞核染色，置于激光共聚焦显微镜下观察。再将染色后的细胞分为三组，分别激光照射(808nm,0.8w/cm²,5min)、37℃或42℃孵育5min，再次用激光共聚焦显微镜观察不同处理情况下细胞内dox释放的情况。

1.4体外热疗、热化疗治疗效果

取对数生长期的4t1细胞种在96孔板(4×10³个/孔)，细胞培养箱中孵育过夜。更换分别含空白脂质体、dtsl、itsl和ditsl的pbs或只有pbs(每孔100μl)，保证最后各孔dox和ir-780的浓度在0或10μg/ml。37℃培养3h后，pbs洗3次。各组分别不加激光处理或激光照射5min(808nm,0.8w/cm²)，共计10组。以只加入pbs而无激光照射的组为空白对照组，以加入pbs后激光辐照的组为激光组，以加入dtsl组为化疗组，以itsl+激光组为热疗组，以ditsl+激光组为热化疗组。培养2h后，每孔加入10μlcck-8试剂反应1h，cck-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐，它在1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-methoxypms)的作用下可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色的甲臜产物(formazan)，而死细胞无此功能，甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。在450nm波长处测定反应产物的光吸收值，可间接反映活细胞数量。各组根据其吸收值计算相对于空白组的细胞活性。

为了直观观察热疗、热化疗的治疗效果，我们进行了直接的细胞染色。首先4t1细胞种在24孔板(7×10⁴个/孔)培养过夜，更换分别含dtsl、itsl和ditsl的pbs或只有pbs(每孔400μl)，最终dox和ir-780的浓度在0或10μg/ml。3小时后，部分处理组进行激光辐照，分组如下：pbs组(空白对照组)、pbs+激光组(激光组)、dtsl组(化疗组)、itsl组、itsl+激光组(热疗组)、ditsl组、ditsl+激光组(热化疗组)。再培养2h后，细胞进行calcein-am/pi染色，显微镜下观察。calcein-am的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，calcein-am能脱去am基，产生的钙黄绿素能发出强绿色荧光，因此calcein-am仅对活细胞染色。pi是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核红染。由于钙黄绿素和pi都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。

2.结果

2.1体外细胞摄取

4t1经不同浓度的ditsl处理不同的时间过后，流式细胞计数测的定量结果显示：4t1细胞摄取dtsl和itsl有着剂量和时间依赖性。在同一时间点中(3h)细胞的荧光强度随药物浓度的增加而增强。同时，这些细胞在同一药物浓度(10μg/ml)，随着药物培养时间的延长，细胞具有更强的荧光强度。肿瘤细胞对脂质体的摄取呈时间依赖性。4t1对ditsl的摄取略有不同，在药物浓度为5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml时，药物摄取量随浓度增加，而20μg/ml时略有下降。同时在同一药物浓度，1h、2h和3h时，4t1对药物的摄取逐渐增加，而4h时略有下降。

各脂质体在4t1的亚细胞定位结果显示。itsl和ditsl孵育后的4t1细胞内可见ir-780的荧光，ir-780均匀的分布在细胞的胞浆中，而在dtsl和ditsl处理过后，可见dox主要聚集在肿瘤细胞细胞核中。ditsl包裹的dox在4t1细胞的细胞质和细胞核中同时存在。

2.2细胞内的药物释放

我们用激光共聚焦显微镜进一步研究了药物在细胞水平的释放与细胞摄取。4t1细胞经过ditsl孵育后，加入预热的pbs并保持恒温或者直接进行激光照射，来比较不同温度和方式对细胞摄取和细胞内药物释放的影响。激光照射5min后，细胞内可见dox的荧光信号较室温下明显增强。相似的dox荧光信号增强情况在42℃恒温5分钟后也可见。而37℃恒温5min后，细胞内dox的荧光信号与室温下差别很小。各组处理前后的dox荧光强度已量化处理，在激光照射后，阿霉素的荧光强度增加明显，而在37℃恒温5min后，阿霉素的荧光强度较处理前增加不明显。

2.3体外化疗、热疗、热化疗治疗

为了评价体外情况下化疗、热疗、热化疗的细胞杀伤情况，我们采用了cck-8法测细胞活性。图3所示，脂质体载体与pbs对照组比并无细胞毒性(p>0.05)。dtsl(10μg/mldox)化疗后，细胞活性明显减低，与pbs对照组相比活性约59.4％，dtsl化疗同时激光照射后，细胞活性约53.3％，与单纯化疗后细胞活性无差别(p>0.05)。这是由于dtsl中不含有效的光热制剂，激光照射后升温不明显，不能达到热损伤的效果。itsl(10μg/mlir-780)孵育后，4t1细胞活性与对照组无差别，而itsl孵育后行激光照射的情况下，细胞活性显著减低，下降到约43.6％。说明单独热疗对细胞有一定的杀伤力。值得注意的是，在加入ditsl孵育并激光照射后，细胞活性减低至17.9％，较其他组细胞活性均低(p<0.01)。加大激光强度后(0.8w/cm²)，热疗组和热化疗组细胞活性进一步减低。热化疗组的细胞活性从17.8％降低到9.5％。

为了直观观察各处理方法的治疗效率，细胞处理后进行calcein-am/pi染色，活细胞会被calcein-am染色，在荧光显微镜下呈绿色，而死亡/晚期凋亡的细胞可被pi染色，在显微镜下呈红色。在单独激光照射后，几乎没有细胞死亡，说明所使用的激光照射强度相对安全。dtsl化疗后，死亡/晚期凋亡细胞数量增加，与ditsl处理后相似，说明在没有激光照射的情况下，ditsl治疗效果与单独化疗相似。而itsl在激光照射后，死亡/晚期凋亡细胞数量增加明显。ditsl加激光照射后，由于热杀伤和dox的迅速释放，大部分细胞被杀死，可见整个视野呈红色，只有少数细胞仍存活。各处理组结果与cck-8定量分析结果一致。热化疗组死亡细胞数较单纯化疗或热疗组明显增加，说明了ditsl对4t1细胞的毒性可被激光辐照明显增加，热化疗有着单独治疗难以比拟的治疗效果。

三、ditsl对乳腺癌移植瘤的抑制效应

1.方法

1.1瘤株及试验动物

雌性spf级balb/c小鼠，鼠龄8～10周龄，体重18～22g，由广东省动物中心提供(scxy[粤]2013-0002)，饲养在中科院深圳先进技术研究院spf级实验室。饲料、饮水、垫料均经高压蒸汽灭菌121℃，20min灭菌处理，水和饲料自由饮食。

1.2细胞培养

用dmem高糖培养基(加入10％胎牛血清以及1％青霉素和1％链霉素)于37℃，5％co2培养箱中培养4t1细胞，每3天更换培养基，0.25％胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞进行试验。

1.3皮下移植瘤模型建立

动物研究均通过中科院深圳先进技术研究动物爱护和使用委员会同意。小鼠右侧腹部备皮，取对数期细胞，胰酶消化后离心3次洗去血清，制备成细胞数为1×10⁷个/ml的无血清细胞悬液，每只小鼠腹部皮下注入0.1ml的细胞悬液。每隔三天测量一次小鼠的体重和肿瘤体积，小鼠接种肿瘤细胞6天左右，待肿瘤体积长到约100mm³时进行治疗，肿瘤体积计算见公式(3)。

肿瘤体积＝1/2×长径×短径²(3)

1.4实验分组

各载药脂质体的制作方法以及脂质体的特性如前所述。待肿瘤体积长到约100mm³开始实验。随机将荷瘤小鼠随机分为七组：(1)空白对照组：每只小鼠瘤内注射0.1ml0.9％的生理盐水；(2)单纯激光组：小鼠瘤内注射0.1ml0.9％的生理盐水后，将肿瘤区域置于激光范围内进行照射5min(808nm0.8w/cm²)；(3)化疗组：每只小鼠肿瘤内注射0.1ml400μg/ml的dtsl溶液；(4)itsl组：每只小鼠瘤内注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液。(5)热疗组：每只小鼠瘤内注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液后，再对肿瘤区域进行激光照射5min(808nm，0.8w/cm²)。(6)ditsl组：每只小鼠瘤内注射0.1ml400μg/ml的ditsl溶液。(7)热化疗组：每只小鼠瘤内注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液后，再对肿瘤区域进行激光照射5min(808nm，0.8w/cm²)

1.5在体热化疗温度监测

激光参数：波长：808nm；功率：0.8w/cm²；超声照射时间：5min。小鼠肿瘤体积长到约100mm³左右行肿瘤治疗，治疗方式如前所述。单纯激光组、热疗组和热化疗组在对肿瘤区域进行激光照射的同时，每隔一分钟，用红外热像仪对肿瘤区域的温度进行测量并记录。

1.6热化疗短期治疗

采用苏木精-伊红染色的方法来评价各治疗方式的短期疗效。每组三只荷瘤小鼠，各组在治疗48h后，处死小鼠取出肿瘤，用福尔马林固定，经脱水、透明、浸蜡包埋成蜡块。于石蜡切片机上切片，切片厚度为6μm。

h&e染色观察肿瘤组织形态学改变

h&e染色流程：

a切片在二甲苯中脱蜡15min。

b移入二甲苯和纯酒精(1:1)混合液中15min。

c放入100％、95％、85％、70％酒精，时间各为5min。最后经蒸馏水转入染液。

d苏木精染液染色5min。

e水洗玻片5min洗去多余染液，0.5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。

镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10s。

g蒸馏水短洗。

h0.1～0.5％伊红染液染色1min。

i依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3min，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。

j二甲苯透明(二次)，共约30min。

k封片：擦去切片周围多余二甲苯，滴加适量中性树胶，加盖玻片封固。镜下观察细胞形态改变。

为了检测组织的凋亡情况，用tunel试剂检测各组肿瘤组织中细胞的凋亡情况。tunel实验原理：细胞在发生凋亡时，断裂的dna暴露的3’-oh在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下，和荧光素标记的dutp反应。探针在荧光显微镜下蓝光激发成绿光。其操作步骤：取出的肿瘤组织经福尔马林固定后制备成石蜡切片，切片厚度为8mm。制备好的石蜡切片脱蜡、水化后，取出样本放入含有通透液(0.1％triton-x-100溶于0.1％枸橼酸钠溶液)的染色缸中，室温，反应时间8min。pbs清洗3次。将样本放入含有抗原修复液(0.1m的柠檬酸+柠檬酸钠缓冲液ph6.0)的染色缸中，92-98℃，反应时间3-4min。pbs清洗3次。每个样本加入50μltunel反应液，阴性对照加入50μl的标记液，常温避光潮湿环境下反应60min。pbs清洗3次。滴加dba显色液,于显微镜下监控显色程度,适时终止反应,自来水冲洗。苏木素复染细胞核,显微镜下观察胞核返蓝后自来水冲洗。快速梯度乙醇、乙醇、无水乙醇脱水,二甲苯透明。

1.7体内长期治疗

小鼠肿瘤体积长到约100mm³左右行肿瘤治疗，每组7只荷瘤小鼠，治疗方式如前所述。小鼠治疗当天记为第0天，随后每隔3天测量并记录一次小鼠肿瘤体积。小方法为用电子游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。在测量肿瘤体积的同时对对鼠称重，记录小鼠体重的变化。肿瘤体积和小鼠体重的测量持续至治疗后第30天，根据动物照护与使用计划，小鼠肿瘤体积大于1000mm³对小鼠处以安乐死。以21天内的小鼠肿瘤体积变化作为肿瘤治疗后长期疗效的评价，以30天内小鼠生存情况作为治疗后的生存评价依据。

1.8肿瘤血管免疫组化分析

为了检测组织的微血管情况，用兔抗鼠cd31抗体进行免疫组化染色检测各组肿瘤组织中细胞的凋亡情况。cd31是由血管内皮细胞、血小板、单核细胞、中性粒细胞和t淋巴细胞表达的粘附分子，其结构属于免疫球蛋白超家族成员。

cd31染色步骤：

a石蜡切片于60℃烘箱内烘干1h,充分融蜡。

b常规二甲苯脱蜡(二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ各15min)。

c梯度乙醇脱水，放入100％、95％、85％、70％酒精，时间各为5min，最后蒸馏水及pbs清洗。

d蛋白酶k工作液(10-20in10mmtris/hcl，ph7.4-8)在37℃抗原修复15-30min。随后pbs清洗2次

e滴加兔抗鼠cd31单克隆抗体(1：200)，4℃孵育过夜后pbs清洗3次。

f滴加辣根酶标记的通用型二抗,37℃孵育20min,pbs清洗3次。荧光显微镜下观察cd31绿色荧光染色情况。

cd31荧光图像分析采用scnimage图像分析软件。

2.结果

2.1热疗和热化疗的体内升温作用

高温在热疗和热化疗中起着重要作用，因此我们首先检查了热疗和热化疗时肿瘤内的温度情况。小鼠在瘤内注射itsl后，激光照射前两分半钟时，温度呈线性上升，升高至61℃左右。后两分半钟温度恒定在60℃左右。热化疗情况与热疗时相似，在激光照射前两分钟内，瘤内温度快速上升，达到61.3℃左右，后三分钟内温度略有下降，约在60℃上下。瘤内注射pbs后，激光照射时温度缓慢升高，最终达到37.3℃。

2.2体内抗肿瘤作用

为了研究热化疗的抗肿瘤作用，各荷瘤小鼠分为七组，分别接受pbs、激光、化疗、热疗、itsl、ditsl和热化疗的治疗，分别评价抗肿瘤治疗的短期疗效和长期疗效。

2.2.1肿瘤治疗的短期治疗效果

以组织学染色评价短期疗效，治疗48h后处死实验鼠取出肿瘤组织制作石蜡切片。从h&e染色结果可见，空白对照组、单纯激光组和itsl组在苏木精染色下肿瘤细胞的细胞核清晰完整，细胞质呈粉红色，组织排列紊乱，细胞核增大，染色加深，呈明显的肿瘤病理特征。ditsl组和ditsl的肿瘤组织切片中，由于肿瘤细胞坏死，切片中肿瘤细胞的细胞核数量明显减少，热疗组肿瘤切片病理染色情况与化疗组类似。而热化疗组切片可见，肿瘤细胞的细胞核碎裂、溶解，只有少量的细胞的细胞核仍可见，但大多数细胞已经看不见细胞核，只剩粉红色的细胞质，肿瘤细胞大范围坏死。热化疗法有明显的杀肿瘤效果。

肿瘤组织石蜡切片进行tunel实验检测7个不同实验处理后肿瘤组织的凋亡情况。本tunel染色中包含dab显色，又经过苏木素复染，dab可将凋亡细胞染成棕色，苏木素可将细胞核染成蓝色，以此来检测肿瘤组织的凋亡情况。空白对照组、单纯激光组和itsl组在苏木精染色下组织排列紊乱，细胞核增大，形态不规则，呈明显的肿瘤病理特征，凋亡细胞较少。ditsl组和ditsl的肿瘤组织切片中，由切片中可见棕色的肿瘤凋亡细胞散在分布，肿瘤凋亡增多。热疗组肿瘤免疫组化染色结果可见部分肿瘤细胞仍存活，肿瘤细胞凋亡数量增多。而热化疗组切片可见，蓝色的细胞核明显减少，而棕色的凋亡细胞明显增多，整个视野范围呈现棕色，只有少量的细胞的细胞核仍可见，大多数细胞已经看不见细胞核，只剩棕色的凋亡细胞，肿瘤细胞大范围凋亡。细胞凋亡情况与细胞病理学染色相符合，证明了热化疗的短期杀肿瘤效果明显。

2.2.2长期肿瘤治疗效果

本研究同时研究了热化疗的长期治疗效果，以30天为限，同时监测了小鼠肿瘤生长情况、生存情况情况。小鼠肿瘤体积变化情况。小鼠瘤内注射pbs后，无论是否再行激光照射，肿瘤在九天内生长情况与化疗组和ditsl组相似，而在9天之后，肿瘤增长加速，与itsl组相似。小鼠瘤内注射itsl后，肿瘤生长呈线性，生长迅速。空白对照组、激光组与itsl组三者肿瘤生长情之间无统计学差别，说明单独激光或者是itsl并无肿瘤抑制作用。化疗组和ditsl组由于dox的持续抗肿瘤作用，肿瘤的生长受到抑制，肿瘤体积呈缓慢增加的趋势，其肿瘤体积与对照组有差别。热疗组在治疗第3天肿瘤体积明显缩小，然而在三天以后，肿瘤生长速度明显加快，这是由于本研究只进行一次治疗，在热疗后大部分肿瘤细胞被杀死，而剩下存活的肿瘤组织由于没有后续的、持续的抗肿瘤治疗，存活的肿瘤细胞会继续增殖，最终导致肿瘤由于不完全消除而复发。由图可见，热化疗后，肿瘤被完全消除，在后续的21天内不再复发。即使ir-780的光热治疗不能完全杀死所有的肿瘤细胞，迅速释放并聚集在肿瘤区域的dox会持续的抑制肿瘤生长。

各组治疗21天后小鼠肿瘤图片，从图4可见，空白对照组、激光组和itsl组小鼠肿瘤体积较大，化疗组、ditsl组肿瘤体积较小，热疗组由于肿瘤局部温升过高，肿瘤区域表面皮肤结痂，残余的肿瘤在痂皮附近复发。热化疗组在激光照射后肿瘤区域表面皮肤也会结痂，过9-15天，痂皮自然脱落，新生组织自然愈合，肿瘤不再复发。

各组小鼠生存率，根据动物照护与使用计划，当小鼠肿瘤体积大于1000mm³时，对小鼠处以安乐死，以30天为观察节点。空白对照组在第15天最先有一只小鼠肿瘤体积大于1000mm³，截止到30天，空白对照组、激光组和itsl组所有的小鼠肿瘤均大于1000mm³，化疗组与ditsl组生存情况一致，热化疗组生存率为100％。

实施例2

本发明的集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法的具体步骤如下：

将脂质与ir-780混溶于氯仿中，边涡旋边氮气吹干成均匀薄膜，真空抽去残留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，将脂质薄膜溶解，在水浴中超声振荡至澄清，制成ir-780脂质体，将已形成的脂质体用挤出仪从聚碳酸酯膜中反复挤出，制备成粒径均匀的脂质体，将ir-780脂质体装于透析袋中，放入pbs溶液中透析，将脂质体内部的硫酸铵替换成pbs，将阿霉素溶液逐滴加入脂质体中，边加边振荡，利用硫酸铵梯度法将阿霉素载入脂质体内核，制得本发明的纳米脂质体。

所述的脂质是由二棕榈酰磷脂酰胆碱，单棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000组成，三者的摩尔比为86∶10∶4。

ir-780与脂质的质量比为1∶100。

真空抽氯仿的时间为3h。

水浴温度为65℃。

所述的聚碳酸酯膜为200nm。

pbs溶液中透析的时间为4h。

所述的阿霉素溶液的浓度为1mg/ml，阿霉素与脂质的质量比为1:10。

所述的硫酸铵梯度法是在制备空白脂质体后，去除脂质体外水相中的铵离子，内水相中一个铵离子电离后形成一个氨分子和一个质子，氨分子在跨膜扩散作用下同样被除去，这就形成了内外水相间的ph梯度，未载药做好了准备，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驱动下，跨膜进入脂质体内水相中，并和硫酸根离子成盐，成盐后形成胶态沉淀，聚集于内水相中，另外阿霉素分子和质子结合形成其离子态，从而失去膜通透性，而不会反向扩散出去。

实施例3

本发明的集光热及化疗于一体的纳米脂质体的制备方法的具体步骤如下：

将脂质与ir-780混溶于氯仿中，边涡旋边氮气吹干成均匀薄膜，真空抽去残留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，将脂质薄膜溶解，在水浴中超声振荡至澄清，制成ir-780脂质体，将已形成的脂质体用挤出仪从聚碳酸酯膜中反复挤出，制备成粒径均匀的脂质体，将ir-780脂质体装于透析袋中，放入pbs溶液中透析，将脂质体内部的硫酸铵替换成pbs，将阿霉素溶液逐滴加入脂质体中，边加边振荡，利用硫酸铵梯度法将阿霉素载入脂质体内核，制得本发明的纳米脂质体。

所述的脂质是由二棕榈酰磷脂酰胆碱，单棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000组成，三者的摩尔比为86：10：4。

ir-780与脂质的质量比为10：100。

真空抽氯仿的时间为3h。

水浴温度为65℃。

所述的聚碳酸酯膜为200nm。

pbs溶液中透析的时间为4h。

所述的阿霉素溶液的浓度为1mg/ml，阿霉素与脂质的质量比为1:30。

所述的硫酸铵梯度法是在制备空白脂质体后，去除脂质体外水相中的铵离子，内水相中一个铵离子电离后形成一个氨分子和一个质子，氨分子在跨膜扩散作用下同样被除去，这就形成了内外水相间的ph梯度，未载药做好了准备，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驱动下，跨膜进入脂质体内水相中，并和硫酸根离子成盐，成盐后形成胶态沉淀，聚集于内水相中，另外阿霉素分子和质子结合形成其离子态，从而失去膜通透性，而不会反向扩散出去。

实施例2和3制备的脂质体也具有与实施例1制备的脂质体同样的抗肿瘤效果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。