提高Ubiad1表达的方法与流程

本发明涉及一种提高ubiad1表达的方法，具体地涉及一种使用通式(i)的肽提高ubiad1表达的方法。

背景技术：

皮肤是由包括表皮、表皮真皮连接、真皮等层组成的覆盖器官。最外面的部分是表皮，基本上由彼此紧密地连接的角化细胞组成的多覆层上皮。表皮的基层由增殖细胞(主要为角化细胞和黑素细胞)层组成，其固定于真皮表皮连接上。真皮是支撑皮肤的组织并且由包封于蛋白多糖的间隙基质中的水、弹性纤维和胶原纤维(70％的真皮纤维)组成。成纤维细胞是真皮主要的细胞成分并且是胶原纤维和弹性纤维合成的来源。

随着年龄增长的老化也会引起皮肤内的内源抗氧化机制和整体修复过程的效率的下降。此外，人类皮肤明显且长期地暴露在诸如紫外线辐射、污染和化学有机毒物等不利外界环境中。这些不良因素会加重皮肤衰老，甚至导致引起皮肤出现未老先衰的表征。

已开发出多种加强皮肤生理机能，包括使皮肤中细胞再生活化、增强皮肤中弹性基质、提高皮肤细胞中如维生素e、辅酶q10和抗坏血酸等抗氧化分子水平的产品。但是，新的与皮肤护理相关的机理/标靶的鉴定对于相关产品的开发仍然非常重要。

技术实现要素：

本发明涉及一种提高ubiad1在器官、组织或细胞中表达的方法，包括将包含通式(i)的肽或其衍生物的组合物接触所述器官、组织或细胞，

r1-(aa)n-ala-val-leu-ala-gly-(aa)p-r2(i)

其中

aa表示任意氨基酸或其衍生物，并且n和p为0-4之间的整数；

r1表示氨基酸n-末端的伯胺官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：乙酰基、苯甲酰基、甲苯磺酰基和苄氧羰基，

r2是氨基酸c-末端的羧酸的羟基官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：c1-c30烷基链、nh2、nhy基团和nyy基团，其中y是c1-c4烷基链。

在一个实施方式中，所述通式(i)的肽包括选自seqidno:1和seqidno:2的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述通式(i)的肽由seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列所组成，优选由seqidno:2所示的氨基酸序列所组成。

在一个实施方式中，所述细胞为角化细胞，优选表皮的角化细胞。

在一个实施方式中，所述器官为皮肤，包括皮肤以及皮肤附属物。

在一个实施方式中，所述组织为皮肤的表皮组织，优选表皮的棘突层和基底层。

本发明的方法可以提高ubiad1的表达，这有助于提高皮肤在包括抵御氧化应激和脂质过氧化，保持皮肤细胞质膜流动性/渗透性等方面的生理机能。本发明在皮肤护理领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1：ubiad1在正常皮肤中的表达

(a)ubiad1(绿色)的免疫检测和使用dapi染色的dna(蓝色)，ubiad1在表皮棘突和基底层中是阳性的(x20物镜；比例尺＝31μm)。

(b)ubiad1(绿色)的免疫检测和使用dapi染色的dna(蓝色)，ubiad1显示紧密的核周定位，极性定位(细胞器样)(x63物镜；比例尺＝10μm)。

(c)在培养的人角化细胞中的ubiad1(绿色)、giantin(红色)的免疫检测和使用dapi染色的dna(蓝色)，蛋白共定位(黄色)，在视野中间的细胞的皮尔逊相关系数是相对高的0.79和0.77(x63物镜；比例尺＝10μm)。

图2：本发明的肽提高ubiad1在人角化细胞中的表达及其意义

(a)在连续角化细胞培养继代后的ubiad1免疫印迹(e表示早期继代；l表示晚期继代)，和在使用1μm(1％)ubiad1诱导肽处理后的ubiad1的免疫印迹。

(b)在使用1μm(1％)ubiad1诱导肽处理后的ubiad1的qpcr数据。

(c)使用ubiad1诱导肽处理并使用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色的角化细胞的代表性电子显微镜图像(左图比例尺＝1μm；右图比例尺＝0.5μm)。

图3：ubiad1表达提高对角化细胞的保护作用

(a)使用cellrox绿色测定，暴露于200μm枯烯氢过氧化物1小时的角化细胞中的细胞ros测量(x20物镜，比例尺＝31μm)。

(b)使用单向方差分析的cellrox量化图，显示以星形表示的置信区间平均值(绿色)。穿过各星形的线表示组平均值。各星形的垂直跨度表示对各组的95％置信区间。大样本平均值由水平黑线表示。

(c)在暴露于200μm枯烯氢过氧化物1小时的角化细胞中的脂质过氧化(还原的bodipy为红色；氧化的bodipy为绿色)(x20物镜，比例尺＝31μm)。

(d)使用单向方差分析的脂质过氧化量化图，显示以星形表示的置信区间平均值(绿色)。穿过各星形的线表示组平均值。各星形的垂直跨度表示对各组的95％置信区间。大样本平均值由水平黑线表示。

(e)在处于反应性氮物质应激下的角化细胞中的3-硝基酪氨酸(绿色)的免疫检测，使用鬼笔环肽染色的f-肌动蛋白(红色)和使用dapi染色的dna(蓝色)(x20物镜；比例尺＝31μm)。

(f)使用单向方差分析的3nt量化图，显示以星形表示的置信区间平均值(绿色)。穿过各星形的线表示组平均值。各星形的垂直跨度表示对各组的95％置信区间。大样本平均值由水平黑线表示。

(g)在暴露于2mm枯烯氢过氧化物1小时的角化细胞中，使用tma-dph探针(蓝色)的质膜完整性测量(x20物镜，比例尺＝31μm)。

(h)使用单向方差分析的tma-dph量化图，显示以星形表示的置信区间平均值(绿色)。穿过各星形的线表示组平均值。各星形的垂直跨度表示对各组的95％置信区间。大样本平均值由水平黑线表示。

发明详述

本发明涉及一种提高ubiad1在器官、组织或细胞中表达的方法，包括将包含通式(i)的肽或其衍生物的组合物接触所述器官、组织或细胞，

r1-(aa)n-ala-val-leu-ala-gly-(aa)p-r2(i)

其中

aa表示任意氨基酸或其衍生物，并且n和p为0-4之间的整数；

r1表示氨基酸n-末端的伯胺官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：乙酰基、苯甲酰基、甲苯磺酰基和苄氧羰基，

r2是氨基酸c-末端的羧酸的羟基官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：c1-c30烷基链、nh2、nhy基团和nyy基团，其中y是c1-c4烷基链。

ubiad1(也称为tere1)基因克隆于2001年(mcgarveytw等oncogene2001；20:1042-51)。本发明人发现ubiad1位于表皮的角化细胞中，ubiad1和穿膜蛋白(golgin家族蛋白)共定位的光学显微镜图像限定于高尔基域，而ubiad1染色还涉及线粒体网络。本发明人发现ubiad1的表达提高的期间也伴随有细胞的高尔基体和线粒体元件超微结构特征的显著改进，其积极作用对角化细胞的细胞能量学是有益的。角化细胞中线粒体dna和蛋白的氧化破坏与皮肤生理机能的下降如老化相关。

而且，本发明人还证实ubiad1在皮肤细胞抗氧化应激，防止脂质过氧化等方面具有重要作用。皮肤细胞，如角化细胞(keratinocytes)中ubiad1表达的提高可有效降低角化细胞中发生的氧化应激以及脂质过氧化。此外，ubiad1在保持细胞膜流动性/渗透性等方面也具有重要作用，ubiad1表达的增加也有助于保持细胞膜流动性/渗透性。

术语“肽”意指通过肽键彼此结合的两个或多个氨基酸的链。术语“本发明的肽”是指具有上述通式(i)的肽。本发明的肽可通过经典化学合成(在固体相或液体均质相中)或通过由组成型氨基酸生化酶合成而获得(kullmanetal.j.biol.chem.,1980,vol.225,第8234页)。在一个实施方式中，本发明的肽可为天然或合成来源。

为了改善抗降解性，可选地对本发明的肽进行修饰以获得其受保护的形式。修饰的形式应该是生理学或者化妆品领域可接受的方式。在一个实施方式中，本发明的肽的n-末端的伯胺官能团可以被酰化或乙酰化。优选地，n-末端保护基团可以选自乙酰基、苯甲酰基、甲苯磺酰基和苄氧羰基。在一个实施方式中，本发明的肽的c-末端的羟基官能团可以被酰胺化或酯化。优选地，c-末端保护基团可以选自c1-c30烷基链、nh2、nhy基团和nyy基团，其中y是c1-c4烷基链。

在一个实施方式中，本发明的肽具有以下序列：ala-val-leu-ala-gly(seqidno:1)。在另一个实施方式中，本发明的肽具有以下序列：ala-val-leu-ala-gly-nh2(seqidno:2)。在一个实施方式中，本发明的肽由seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列所组成，优选由seqidno:2所示的氨基酸序列所组成。在另一个实施方式中，本发明方法包括使用ala-val-leu-ala-gly(seqidno:1)和ala-val-leu-ala-gly-nh2(seqidno:2)的混合物。

在一个实施方式中，所述器官为皮肤。术语“皮肤”包括通常概念上的皮肤以及皮肤附属物。皮肤附属物包括身体表面上存在的全部角质附件，例如毛发、睫毛、眉毛、指甲和汗毛。皮肤包括表皮、表皮真皮连接、真皮等部分。表皮进一步包括角质层、颗粒层、棘突层和基底层。在一个实施方式中，所述组织为皮肤的表皮组织，优选表皮的棘突层和基底层。在一个实施方式中，所述细胞为角化细胞，优选表皮的角化细胞。

在一个实施方式中，本发明涉及一种提高ubiad1在角化细胞中表达的方法，包括使用肽或包含肽的组合物接触包含角化细胞的器官或组织，其中所述肽选自seqidno:1的肽、seqidno:2的肽和它们的混合物。

本发明还涉及一种通式(i)的肽用于提高ubiad1在角化细胞中表达的用途，

r1-(aa)n-ala-val-leu-ala-gly-(aa)p-r2(i)

其中

aa表示任意氨基酸或其衍生物，并且n和p为0-4之间的整数；

r1表示氨基酸n-末端的伯胺官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：乙酰基、苯甲酰基、甲苯磺酰基和苄氧羰基，

r2是氨基酸c-末端的羧酸的羟基官能团，是未取代的或者是由选自以下的保护基团取代：c1-c30烷基链、nh2、nhy基团和nyy基团，其中y是c1-c4烷基链。

在一个实施方式中，所述通式(i)的肽包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seqidno:1或seqidno:2，优选seqidno:2。

本发明的肽可以被溶解在一种或多种生理学或化妆品领域可接受的适宜的溶剂中，例如水、丙三醇、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环多元醇、或这些溶剂的任意混合物。术语“生理学或化妆品领域可接受的”意味着所选择的溶剂适用于与皮肤接触，而不引起毒性或不耐性反应。在一个实施方式中，本发明的肽可以被溶解在一种或多种选自以下的化妆品用溶剂：水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基二甘醇、丙氧基二甘醇、环多元醇、和它们的混合物。

本发明的肽可以进一步被包裹或包含在化妆品载体例如脂质体或在化妆品领域中使用的任何其它微胶囊中，或将肽吸收到粉末状有机聚合物、矿物质载体如滑石和膨润土上。

因此，本发明还包括一种包含通式(i)的肽的组合物，其可以提高ubiad1在皮肤角化细胞中表达。本发明还包括一种通式(i)的肽作为提高ubiad1在皮肤角化细胞中表达的美容护理组合物中活性成分的用途。本发明还包括一种提高ubiad1在皮肤角化细胞中表达的美容护理方法，包括向皮肤施用包含具有通式(i)的肽的美容护理组合物。

本发明的组合物可特别为以下形式：水、水醇或油溶液；水包油型或油包水型乳剂或复合乳剂；水或非水凝胶；胶体。这些组合物也可为适用于施用在皮肤、黏膜、唇和/或皮肤附件上的乳膏、悬浮液、或粉末形式。这些组合物可为或多或少的流体并且具有乳膏、洗液、乳、浆液、蜡、乳膏、浆料或泡沫的外观。它们还可为固体形式例如条，或可以以气溶胶形式将它们施用至皮肤。在一个实施方式中，本发明的组合物为美容护理组合物。

本发明的组合物可包括化妆品领域常用的使用的任何添加剂以及对于它们的配制必要的佐剂，例如助溶剂(乙醇、丙三醇、苯甲醇、湿润剂等)、增稠剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、遮光剂、颜料、填料、防腐剂、香水、气味吸收剂、香精油、痕量元素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、化学或矿物过滤介质、水合剂或热水等。例如可以引用天然型的水溶性聚合物例如多糖、或多肽、甲基纤维素或羟丙基纤维素型的纤维素衍生物、或合成的聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、pva或pvp并且特别是由isp公司销售的聚合物。

在任何情况中，本领域技术人员将确保：选择这些佐剂以及它们的比例使得不抵消在根据本发明的组合物中寻求的有利性质。这些佐剂例如可以基于组合物总重量的0.01-20％的浓度存在。当本发明的组合物为乳剂时，相对于组合物的总重量，脂肪相可代表5-80重量％并且优选5-50重量％。将从所考虑的领域中常规使用的那些乳化剂和辅助乳化剂中选择组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂。例如，可以基于相对于组合物总重量的0.3-30重量％的比例使用它们。

在一个实施方式中，本发明的肽在组合物中的浓度为0.0005-500μm，优选0.01-5μm，以所述组合物的总质量计。

当然，根据本发明的肽可单独使用或与其它活性成分组合使用。例如，本发明的组合物还包括旨在用于皮肤美容，如改善皮肤生理机能的至少一种其它的活性剂，包括但不限于：再生剂、抗老化剂、抗皱剂、增稠剂、抗自由基剂、抗糖化剂、水合剂、抗细菌剂、抗真菌剂、角质软化剂、肌肉松弛剂、脱落剂和调色剂、刺激真皮大分子的合成或能量代谢的试剂、调节皮肤分化、色素沉着或除色素的试剂、刺激指甲或毛发生长的试剂、刺激微循环的试剂、遮光剂或金属蛋白酶抑制剂。

在一个实施方式中，除了根据本发明的肽以外，根据本发明的组合物还将包括：

-遮光剂、遮紫外线剂和遮红外线剂

-抗自由基剂

-dhea(脱氢表雄酮)

-至少一种细胞色素c活化化合物，和/或

-至少一种水合化合物，例如水通道蛋白活化化合物，和/或

-至少一种沉默调节蛋白活化化合物，和/或

-至少一种增加细胞粘连的化合物，和/或

至少一种增加基质蛋白质例如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺多糖的产生的化合物，和/或

-至少一种hsp蛋白质调节化合物，和/或

-至少一种提高细胞能量的化合物，和/或

-至少一种皮肤色素沉着调节化合物，如酵母、苋菜，亚麻子，豆，可可，玉米，大豆，向日葵，油菜籽或豌豆的肽提取物、和/或

-至少一种改善屏障功能的化合物，和/或

-至少一种保护线粒体的化合物，和/或

-维生素a，和特别是视黄酸，视黄醇，丙酸视黄醇酯，棕榈酸视黄酯、维生素b3，特别是烟酰胺，生育酚的烟酸酯，和/或

-维生素b5，维生素b6，维生素b12，泛醇，和/或

-维生素c，特别是抗坏血酸，抗坏血酸葡糖苷，抗坏血酸四异棕榈酸酯，抗坏血酸磷酸镁和钠，和/或

-维生素e,f,h,k,pp和辅酶q10，和/或

-金属蛋白酶抑制剂，组织抑制剂金属蛋白酶活化剂(timp)，和/或

-氨基酸，特别是精氨酸，鸟氨酸，羟脯氨酸，羟脯氨酸棕榈酸酯，棕榈酰甘氨酸，羟赖氨酸，甲硫氨酸及其衍生物，n-酰化氨基酸，和/或

-天然或合成肽，包括二肽，三肽，四肽，五肽和六肽及其亲脂性衍生物，异构体和与其它分子如金属离子(即铜，锌，锰，镁等)的络合物，以商品名collaxyl^tm、peptidevinci02^tm、chronogen^tm、laminixylis^tm出售的肽，和/或

-通过水解或任何其它方法获得的肽类植物提取物如大豆提取物，单粒小麦提取物，葡萄籽提取物，油菜籽提取物，亚麻籽提取物、大米提取物，玉米提取物或豌豆提取物，角豆提取物，豆提取物，蚕提取物，和/或

-酵母提取物，卤虫盐水提取物，和/或

-脱氢乙酸(dha)，和/或

-天然或合成植物甾醇，和/或

-α-和β-羟基酸，硅烷醇，和/或

-糖胺，葡糖胺，d-葡糖胺，n-乙酰葡糖胺，n-乙酰基-d-葡糖胺，甘露糖胺，n-乙酰甘露糖胺，半乳糖胺，n-乙酰半乳糖胺，和/或

-多酚，异黄酮，类黄酮，如葡萄提取物，松树提取物，橄榄提取物，和/或

-脂质如神经酰胺或磷脂，和/或

-动物油，例如角鲨烯或角鲨烷，和/或

-植物油，例如杏仁油，椰子油，蓖麻油，霍霍巴油，橄榄油，菜籽油，花生油，向日葵油，小麦胚芽油，玉米胚芽油，大豆油，棉籽油，苜蓿油，罂粟籽油，南瓜籽油，月见草油，小米油，大麦油，黑麦油，红花油，激情油，榛子油，棕榈油，杏仁油，鳄梨油，金盏花油，乙氧基化植物油或牛油树脂。上述化合物是天然的，例如植物的肽水解产物，或合成的，例如肽化合物。

术语“接触”是指将本发明的肽或包含其的组合物施用到包含角化细胞的器官或组织的表面。本发明的肽或者包含其的组合物可以在对象中“局部施用”。术语“对象”包括哺乳动物，例如人。“局部施用”意指将根据本发明的肽或者包含其的组合物施用或涂布在皮肤或粘膜的表面上。在一个实施方式中，本发明的肽或者包含其的组合物施用于人体暴露于环境的部位，包括但不限于头部、面部、头颈部、额头、眼眶、鼻部、颈部、胳膊和腿。

术语“改善皮肤的生理机能”包括皮肤和皮肤附件的外部外观的改善，例如改善皮肤老化/光老化表征，其包括皮肤及其附属物因老化出现的全部变化，包括例如皮肤减薄、松垂、失水和张力缺失、深皱纹和细皱纹、松弛和失色、皮肤萎缩、色调均一度，黑眼圈、或因暴露于紫外线而导致的其它皮肤内部降解、雀斑和老年斑。雀斑也称为“日光性着色斑”、“老年性雀斑样痣”、“年长斑”、“老年性雀斑”，其是出现在皮肤上的斑点，与年老和因暴露于太阳紫外线的光老化有关。他们的颜色从浅棕色至红色或黑色，且出现在大部分暴露于太阳的部分，特别是头、面部、肩膀、胳膊和前额，以及秃顶的头皮。根据本发明的一个有利的方面，ubiad1在皮肤角化细胞中表达的提高可实现上述效果，如改善皮肤老化/光老化表征，减少皮肤皱纹、减少黑眼圈等。

考虑到出于说明性和非限制性目的而提供的以下实施例，本发明的其它优势和特征将变得更加清楚。

实施例

1.材料和方法

1.1ubiad1诱导肽的合成

提高ubiad1表达的诱导肽序列ala-val-leu-ala-gly-nh2(seqidno:2)，其采用人工合成的方法制备。工作溶液为1μm。

1.2抗体和探针

所用的一抗为抗-ubiad1抗体(sc-377013,santacruzbiotechnology,heidelberg,germany)、抗-giantin抗体(ab24586,abcam,cambridge,uk)和抗-3-硝基酪氨酸抗体(ab61392,abcam)。使用alexa偶联的二抗(molecularprobes,eugene,or,usa)。使用alexa594鬼笔环肽探针检测f-肌动蛋白(a12381,molecularprobes)。使用cellrox绿色探针监测细胞内ros(c10444,molecularprobes)。使用c11-bodipy(581/591)监测脂质过氧化(c10445,molecularprobes)。在细胞膜流动性实验中使用2μm的tma-dph探针(43060,sigma,st.louis,mo,usa)。

1.3rna干扰

ubiad1的sirna(hss179099,invitrogen,carlsbad,ca,usa)用lipofectaminernaimax(invitrogen)进行转染。48小时后，收集细胞并通过定量pcr进行分析。使用具有中等gc含量的stealthrnainegativecontrolduplexes(invitrogen)作为阴性对照，使用参见生产商手册。

1.4细胞培养

正常人表皮角化细胞从已签署知情协议的健康女性的整形手术获得的皮肤中分离。将角化细胞在添加有重组表皮生长因子和牛垂体提取物(gibco,auckland,nz)以及0.1mg/mlprimocin^tm(invivogen,sandiego,ca,usa)的角化细胞无血清培养基中培养。

1.5逆转录pct分析

根据生产商手册(ambion,austin,tx,usa)，使用mirvanamirna分离试剂盒提取总rna。总rna通过高性能cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems,branchburg,nj,usa)逆转录。实时pcr根据taqman方法进行，使用taqmanuniversalpcrmastermix(appliedbiosystems)和steponeplus实时pcr系统(appliedbiosystems)。各个靶基因的相对表达水平根据δ-δ-ct方法计算。

1.6蛋白质印迹分析

角化细胞在包含蛋白酶抑制剂鸡尾酒和edta(thermoscientific)的ripa缓冲液(thermoscientific,rockford,il,usa)中裂解。蛋白质浓度使用bcaproteinassaykit(thermoscientific)测定，将等量的总蛋白质上样到4-12％nupagebis-trisgel(invitrogen)上，并使用iblot干印迹系统(invitrogen)转移到硝酸纤维素膜上。将非特异性结合位点封闭，随后将膜用适合的抗体标记并使用supersignalwestfemtomaximumsensitivitysubstrate试剂盒(thermoscientific)显影。

1.7免疫荧光

将甲醇固定的细胞在0.1％tritonx100中渗透，并在1％bsa溶液中封闭。细胞用在磷酸盐缓冲液中稀释的一抗孵育，随后用偶联有alexafluor(invitrogen)的二抗孵育。使用axiovert200m显微镜(carlzeiss,oberkochen,germany)进行图像获取。用连接有volocity获取软件(perkinelmer,waltham,ma,usa)的exi蓝照相机(qimaging,surrey,bc,canada)照相。ubiad1和giantin的共定位使用统计学方法(17)进行，由此去除目视判读的偏差。皮尔逊相关系数(pearsoncorrelationcoefficient)用作统计学参数以定量共定位程度。

1.8免疫组化荧光

人皮肤样品从已签署知情协议的健康女性的整形手术获得。在去除皮下脂肪后，收集用于获得6mm穿孔活组织检查的组织，在甲醛中固定，并在自动化shandonhypercenterxp(shandonltd.,runcor,uk)中处理以用于石蜡包埋。使用切片机(shandon)进行4μm厚度的切片，并收集在多聚赖氨酸包埋的载玻片上(menzelbraunschweig,germany)以用于免疫染色。在使用ubiad1抗体孵育前，进行热和胃蛋白酶酶促抗原修复。

1.9电镜

将培养的角化细胞(用1μm浓度肽处理48小时)在karnovsky溶液(emsdiasum,hatfield,pa,usa)中固定1小时，并在4℃下放置12h。随后将细胞小心从培养皿上刮下，通过短暂离心沉淀，并用0.1m二甲胂酸钠缓冲液清洗。将沉淀进行常规锇酸固定，在梯度乙醇中脱水，用低粘度环氧树脂浸透并包埋。将银灰色干扰色的超薄切片切下，并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行双染色，随后在zeiss10透射电镜下检查。用gatan数码显微镜(gatan,pleasanton,ca,usa)显微照相。

1.10统计学分析

重复全部实验，荧光定量通过测定染色的荧光强度进行(通过细胞面积进行标准化)。根据生产商手册(从590-510通道的信号的比例)进行细胞的脂质过氧化的定量。统计学分析使用jmp软件(sas,cary,nc,usa)进行。数据的正规性检验使用shapiro-wilk测试进行。单因素方差分析(anova)用来确定是否两或多个独立组的平均数之间存在任何显著差异。两个平均数之间的差异通过studentt-检验来确定。p-值≤0.05被认为是统计学上显著的(*)，p-值≤0.01被认为是统计学上非常显著的，且p-值≤0.005被认为是统计学上高度显著的(***)。

2.实验结果

2.1人皮肤表皮中的ubiad1表达和定位

如图1a和1b所示，人皮肤切片上的ubiad1免疫染色显示了所述酶主要定位在表皮中，尽管真皮的一些细胞也是阳性的。在表皮内，ubiad1最主要定位于棘突和基底层中，其在层状颗粒中几乎检测不到。在细胞核和很多细胞质囊泡附近的强荧光聚集而质膜则几乎没有染色所示，ubiad1显示了具体的亚细胞定位。这种不对称的核周定位强烈表明所述酶定位在胞质细胞器内。

2.2体外角化细胞内的ubiad1表达和定位

对培养细胞的内源ubiad1的免疫荧光染色显示两种不同的分布模式：第一种为点状染色，而第二种为高尔基体相关的核周定位。如图1c所示，ubiad1显示出与穿膜蛋白(giantin)的实质共定位，穿膜蛋白定位在高尔基复合体中。皮尔逊相关系数是相对高的(0.79,0.77)。这些观察结果强烈表明ubiad1与跨高尔基体网络(tgn)相关。穿膜蛋白阴性，ubiad1阳性的区域被认为是线粒体定位。

2.3ubiad1表达在角化细胞晚期继代中降低

为了测定ubiad1表达在角化细胞老化期间是否降低，通过在连续继代早期和晚期培养的角化细胞中的免疫印迹来测量ubiad1的水平。如图2a所示，在体外继代早期和晚期的细胞培养物之间，观察到ubiad1表达减少。

2.4ubiad1诱导肽提高角化细胞中的ubiad1的表达

我们使用ubiad1诱导肽ala-val-leu-ala-gly-nh2(seqidno:2)来提高角化细胞中的ubiad1的表达。如图2a和2b所示，经过ubiad1诱导肽的处理，ubiad1的表达显著增加，qpcr测量数据(+102％)和免疫印迹测量数据(+53％)。

2.5ubiad1在皮肤角化细胞中的保护作用

在转染后48小时，sirna诱导的ubiad1沉默提供了84％的mrna表达降低。为了研究细胞的对于抵御氧化应激和随后的脂质过氧化的补偿机制，我们量化了cyp1a1的表达，这是因为cyp1a1具有宽泛的底物特异性，cyp1a1是最重要的解毒酶之一。观察到ubiad1的沉默与较高的cyp1a1表达相关，表明用以处理氧化应激的补偿机制。

使用ubiad1诱导肽ala-val-leu-ala-gly-nh2(seqidno:2)提高角化细胞中的ubiad1的表达。如图2c所示，经诱导肽处理的角化细胞的透射电子显微镜像显示对照和处理物之间在细胞形态中的显著差异。诱导肽处理与细胞的线粒体和高尔基体含量的大规模增加相关，导致角化细胞形态的高度“活化”状态。线粒体显示具有在细胞溶质内扩大且连通的外观，同时高尔基复合体在聚集体数量和跨高尔基组件方面变得非常显著。

使用枯烯氢过氧化物诱导角化细胞中出现大量ros积累(图3a)，与对照的情况相比+151％(图3b)。结果显示，使用诱导肽处理的角化细胞对ros积累(图3a和3b)和脂质过氧化(图3c和3d)的抗性更高，这与ubiad1表达升高的趋势相符，表明ubiad1调节在对抗氧化应激中起作用。

此外，ubiad1赋予针对sin-1过氧亚硝酸盐-介导的氧化的保护作用，通过3-硝基酪氨酸的免疫标记评估亚硝化应激，其为过氧亚硝酸盐(onoo-)和其他反应性氮物质的足迹标记。表达较高水平的ubiad1的角化细胞显示对亚硝化应激的抗性更高(图3e和3f)。

使用tma-dph(三甲胺-二苯基己三烯)检测角化细胞的膜渗透性。作为在掺入质膜后显示荧光的疏水探针，枯烯氢过氧化物与观察到的细胞膜渗透性的变化相关(图3g)(与对照的情况相比，荧光强度+83％)(图3h)。结果显示，在表达较高水平的ubiad1的角化细胞中，则没有观察到这种膜流动性的破坏(图3h)。

序列表

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