一种萝卜缨的活性部位及其用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及从萝卜缨中制备具有抗氧化和延缓衰老活性的乙酸乙酯萃取部位及其在制备抗氧化和延缓衰老药物方面的应用。

背景技术：

我国是世界上老龄化发展速度最快的国家之一，也是老龄人口最多的国家之一。据世卫组织预测，到2050年，我国老龄人口将超过4亿，给社会带来沉重的负担。延缓衰老是推动健康老龄化的有效对策，也是提高老年人群生活质量的有效措施，延缓衰老已成为全球普遍关注的重大课题。

衰老生物体发育成熟后，在正常生理情况下随着年龄的增长，生物体自我更新和修复能力减弱、内环境稳定性下降、结构成分逐渐发生退行性变化而趋向死亡的不可逆变化过程。迄今，关于衰老的理论学说已有数十种。包括端粒学说、自由基学说、自身免疫学说、DNA损伤学说、线粒体学说等。其中Harman提出的自由基学说得到国际公认。该学说认为，机体衰老是由于机体代谢活动过程中产生过多的自由基，攻击机体大分子物质，造成细胞水平及机体水平氧化损伤，从而加速细胞及机体衰老的进程。基于自由基学说，从天然植物中筛选安全、有效的抗氧化活性成分用于延缓衰老研究，一直备受关注。

萝卜缨是十字花科植物萝卜(Raphanus sativus L.)的根生叶，又称莱菔叶。莱菔，是我国一种重要的蔬菜，全国各地均有种植，可四季栽培，全年供应，产销量很大。萝卜缨作为萝卜的副产品，资源也十分丰富。莱菔叶的营养成分丰富，美国公众科学中心的一项科学研究，即按照热量、叶黄素、维生素C、维生素K、钾和纤维素等的含量指标给85种蔬菜打分，结果显示莱菔叶位列第三名。同时，萝卜缨还具有很高的营养价值和药用价值。现代营养学研究表明，萝卜缨具有促进胃肠蠕动、治疗胃溃疡、抗氧化及降血压等多种生物活性。Ghayur和Gilani报道萝卜缨水提物具有降压作用，该水提物中含有皂苷和生物碱类物质(Ghayur MN,Gilani AH.J Health Sci,2007,53:151-155.)。Devaraj等报道萝卜缨提取物对实验性大鼠胃溃疡具有保护作用，且最大口服安全剂量可达2000mg/kg，其中乙醇粗提物、氯仿相、乙酸乙酯相和水相均具有抗乙酸诱导大鼠慢性胃溃疡作用，并定性乙酸乙酯相含有皂苷和黄酮(Devaraj VC,Gopala Krishna B,et al.Saudi Pharm J,2011,19:171-176)。Gilani报道萝卜缨提取物能通过多途径刺激胃肠蠕动和子宫收缩，24h内一次口服莱菔叶粗提物5000mg/kg无急性毒性(Gilani AH,Nabeel GM.J Ethnopharmacol,2004,95:169-172)。Beevi报道萝卜缨甲醇和丙酮提取物具有清除自由基和抗氧化作用，并初步证实其富含多酚类物质(Beevi SS,Narasu ML,Gowda BB.Plant Foods Hum Nutr,2010,65:8-17)。但到目前为止，将萝卜缨用于延缓衰老领域的研究和应用，在国内外均未见相关报道。本发明可进一步扩大萝卜缨的开发和利用，同时也为延缓衰老研究提供新资源，可产生良好的社会效益和可观的经济效益。

技术实现要素：

本发明的目的是提供萝卜缨具有抗氧化和延缓衰老活性应用潜力的有效部位。

萝卜缨提取物的各部位经过反复多次的抗氧化和延缓衰老活性筛选，确认萝卜缨70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位可明显延长果蝇的寿命，提高果蝇体超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，降低脂质过氧化产物(MDA)含量，并且在清除DPPH自由基、还原能力测定实验中表现出较好的体外抗氧化活性，表明萝卜缨的提取物具有良好的抗氧化作用，具有延缓衰老的潜力。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种萝卜缨的活性部位，具有抗氧化和延缓衰老性能，为萝卜缨70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位，按照如下方法获得：

步骤1、干燥萝卜缨，粉碎过200目筛；

步骤2、将过筛的萝卜缨加入到体积分数为70％～95％的乙醇的水溶液中恒温浸提；经抽滤后，对滤渣重复提取三次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，得萝卜缨乙醇提取物；

步骤3、将萝卜缨乙醇提取物用水超声分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分级萃取，各萃取3次，将相同的萃取液合并；减压浓缩合并后的溶剂，冷冻干燥分别得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位和水部位，其中乙酸乙酯部位即为所述萝卜缨的活性部位。

步骤2中，所述萝卜缨与乙醇水溶液的用量比为1g：10～20mL；所述恒温浸提的温度为35～45℃。

步骤3中，所使用的水与石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱或正丁醇的体积比均为1：0.5～1.5。

所述的萝卜缨的活性部位用于延长果蝇寿命。本发明采用果蝇这一模式生物，以整体动物实验作为检测手段，观察上述萝卜缨活性部位对果蝇寿命的影响，发现高低剂量的上述萝卜缨活性部位能显著延长果蝇的寿命。同时在体外模型中具有显著的抗氧化活性，表明萝卜缨活性部位在制备抗氧化和延缓衰老药物方面具有良好的潜力。

所述的萝卜缨的活性部位用于制备抗氧化和延缓衰老药物。

所述抗氧化和延缓衰老药物为滴丸、胶囊、片剂或颗粒剂的形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述的萝卜缨的活性部位用于与药学上可接受的辅料组成的药物组合物。

有益效果：

与现有技术相比，本发明提供了一种具有抗氧化和延缓衰老活性的萝卜缨乙醇提取物活性部位。

经检测确认萝卜缨70％～95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位可明显延长果蝇的寿命，提高果蝇体超氧化物歧化酶(内SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，降低脂质过氧化产物(MDA)含量，并且在清除DPPH自由基、还原能力测定实验中表现出较好的体外抗氧化活性，表明萝卜缨乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位萝卜缨的提取物具有良好的抗氧化作用，具有延缓衰老的潜力。

附图说明

图1为乙酸乙酯萃取部位对雌性果蝇寿命的影响；

图2为乙酸乙酯萃取部位清除DPPH自由基实验；

图3为乙酸乙酯萃取部位还原能力实验。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

萝卜缨95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位制备：

取粉碎过200目筛的萝卜缨粉100g，加入2000mL体积分数为95％的乙醇水溶液于水浴45℃下浸提，经抽滤，滤渣重复提取三次，合并滤液，真空浓缩回收乙醇，得萝卜缨乙醇提取物；萝卜缨乙醇提取物用100mL水超声分散，依次用50mL石油醚、50mL氯仿、50mL乙酸乙酯、50mL水饱和正丁醇分级萃取，各萃取3次，合并萃取液，减压浓缩回收溶剂，冷冻干燥分别得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位和水部位；其中乙酸乙酯部位即为萝卜缨乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。

实施例2

萝卜缨70％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位制备：

取粉碎过200目筛的萝卜缨粉100g，加入1000mL体积分数为70％的乙醇水溶液于水浴35℃下浸提，经抽滤，滤渣重复提取三次，合并滤液，真空浓缩回收乙醇，得萝卜缨乙醇提取物；萝卜缨乙醇提取物用100mL水超声分散，依次用50mL石油醚、50mL氯仿、50mL乙酸乙酯、50mL水饱和正丁醇分级萃取，各萃取3次，合并萃取液，减压浓缩回收溶剂，冷冻干燥分别得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、水饱和正丁醇部位和水部位；其中乙酸乙酯部位即为萝卜缨乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。

实施例3

乙酸乙酯萃取部位延缓果蝇寿命的作用

1.实验材料

野生型黑腹果蝇由南京农业大学遗传学研究室提供；

2.剂量选择

设一个空白对照组合二个剂量组，各剂量组培养基含受试物浓度为0、5mg/kg和15mg/kg。

3.果蝇基础培养基

玉米粉8.5％、蔗糖6.5％、琼脂分0.75％、丙酸0.5％、酵母粉0.75％、水83％，pH＝7。

4.果蝇寿命实验

挑选10h内孵出的未发生交配的雌性果蝇，经乙醚麻醉，随机分为空白对照组、样品高剂量组、样品低剂量组，每管20只，每组10管，在温度25±1℃、湿度55～65％、12h光照交替的培养箱中培养。每根管放约2mL的培养基，用双层纱布封口。前两周均饲喂基础培养基，15天后各样品处理组开始喂饲加样品的培养基。每天上午定时观察并记录死亡的果蝇数目，4天更换一次培养基，观察果蝇至完全死亡为止。实验过程中剔除非正常原因死亡和操作过程中不慎飞走的果蝇数量。统计各组果蝇的平均寿命和最高寿命。平均寿命的计算用每组全部果蝇生存天数之和除以果蝇数目；最高寿命取每组最后死亡的10只果蝇生存天数的平均值。结果见图1、表1。

表1乙酸乙酯萃取部位对雌性果蝇寿命的影响

5.果蝇体内SOD、CAT和MDA的测定

挑选10h内孵出的未发生交配的雌性果蝇，经乙醚麻醉，随机分为空白对照组、样品高剂量组、样品低剂量组，每管20只，每组10管，在温度25±1℃、湿度55～65％、12h光照交替的培养箱中培养。在喂饲被测样品的第45天经乙醚麻醉处理，称重后，用9倍的生理盐水制备10％的组织匀浆，混匀后，6000rpm/min离心10min，吸取上清液，参照试剂盒方法进行SOD、CAT活力和MDA含量的测定。结果见表2。

表2乙酸乙酯萃取部位对雌性果蝇体内SOD、CAT活力和MDA含量的影响

实施例4

乙酸乙酯萃取部位体外抗氧化活性测定：

1.DPPH自由基清除实验

称取3mg的乙酸乙酯萃取部位样品溶解在3mL甲醇中配制得到1000μg/mL的母液，用甲醇梯度稀释母液，得到50—1000μg/mL的一系列浓度的样品溶液。往试管中加入2mL的0.2mmol/L DPPH溶液和1mL的不同浓度样品溶液或1mL的甲醇溶液做空白对照，并充分混匀，暗处放置30min后在517nm处测定吸光度(A)，重复测三次，然后取平均值。DPPH自由基清除率的计算方法如下：

其中，A_空白为空白对照样的吸光度，A_样品为样品的吸光度。

数据表明，乙酸乙酯萃取部位具有清除DPPH自由基能力。结果见图2。

2.还原能力实验

取1mL不同浓度的样品提取物溶液，加入2.5mL磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 6.6)和2.5mL的1％铁氰化钾溶液，在50℃水浴20min，然后加2.5mL 10％的三氯乙酸(TCA)终止反应，3000rpm离心10min，吸取2.5mL上清液，相继加2.5mL蒸馏水和0.5mL0.1％的FeCl₃，充分混匀，室温下静置反应10min，测定在700nm处的吸光值，测定3次取平均值。数据表明，乙酸乙酯萃取部位具有较强的还原能力。结果见图3。

实施例5

滴丸的制备

分别称取400g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，再加入乙酸乙酯萃取部位冻干粉末，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80一90℃下滴入冷却过的液体石蜡中(温度±4℃)，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得乙酸乙酯萃取部位滴丸1000粒。

实施例6

胶囊剂的制备

乙酸乙酯萃取部位冻干粉末100g，与药用淀粉50g，混合均匀，烘干，按每粒0.45g制成胶囊。

实施例7

片剂的制备

乙酸乙酯萃取部位冻干粉末100g，淀粉50g，混合均匀，用乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.35g。

实施例8

颗粒剂的制备

乙酸乙酯萃取部位冻干粉末150g，淀粉100g，糖粉40g，混合均匀，用乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。