一种用于治疗哮喘的款冬花提取物及其制备方法与流程

本发明涉及中药有效部位提取，具体涉及一种可用于治疗哮喘的款冬花提取物及其制备方法和用途。

背景技术：

哮喘是一种常见病、多发病是世界公认的医学难题，至今尚无根治方法，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一，它是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症。其临床的症状有咳嗽、喘息、呼吸困难、胸闷、咳痰等；典型的表现是发作性伴有哮鸣音的呼气性呼吸困难；严重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸，干咳或咯大量白色泡沫痰，甚至出现紫绀等。目前，全球哮喘患者约3亿人，中国哮喘患者约3000万。哮喘是影响人们身心健康的重要疾病。治疗不及时、不规范，哮喘可能致命。

目前治疗哮喘的西药有支气管舒张药和抗炎药物，支气管舒张药包括β2激动剂、茶碱类和抗胆碱药物，常用的抗炎药物主要是吸入性的糖皮质激素等。这些药物对消化系统、神经系统等均有不可避免的副作用，不便长期使用。我国具有丰富的中草药资源，因此研究开发一种安全有效的治疗哮喘的中药非常必要。

款冬花是菊科植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾。具有润肺下气、止咳化痰的功效。为了开发新的纯天然哮喘预防和治疗药物，本发明对款冬花进行了系统的研究，制备得到了一种款冬花提取物对哮喘具有明显的治疗作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可用于治疗哮喘的款冬花提取物及其制备方法和用途。所提取的款冬花提取物对哮喘应具有明显的治疗作用，可用于制备预防和治疗哮喘的药物。且提取工艺简单，成本低廉。

本发明提供的一种用于哮喘治疗的款冬花提取物，通过包括如下步骤的方法制备得到：

1)提取：取款冬花药材粉碎，按每千克药材加入2-10升的低极性提取溶剂，常温浸泡至少10min，超声提取1-5次，每次10-100min；

2)浓缩：取上述提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得款冬花提取物。

其中步骤1)优选条件：每千克款冬花药材加入提取溶剂4升，浸泡5h，超声提取3次，每次60min。

所述步骤1)中的低极性提取溶剂可以为石油醚或正己烷；所述的超声可以用渗漉或浸渍替代。

经过对款冬花提取物的化学表征和分析，其主要成分中至少含有如下四种结构的化合物：

药效学实验结果显示，本发明款冬花提取物对哮喘动物模型具有明显的治疗作用，可用于制备预防和治疗哮喘的药物。

本发明款冬花提取物是以单味干燥的款冬花为原料，用石油醚或正己烷为提取溶剂，通过浸泡、提取、浓缩等步骤制备得到。其提取工艺简单，成本低廉。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的款冬花提取物的¹H-NMR图谱。

图2为本发明实施例1制备的款冬花提取物中所鉴定化学成分结构式。

图3为本发明实施例3制备的款冬花提取物的¹H-NMR图谱。

图4为本发明实施例3制备的款冬花提取物中所鉴定化学成分结构式。

图5为本发明实施例1制备的款冬花提取物的液相图谱。

图6为本发明实施例1制备的款冬花提取物通过液相分析所确定化合物的结构式。

图7为本发明款冬花提取物药理实验ELISA法检测血清中IL-17细胞因子水平(各组与模型组相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

图8为本发明款冬花提取物药理实验ELISA法检测血清中IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17细胞因子水平(各组与模型组相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

图9为本发明款冬花提取物药理实验BALF细胞(嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞)分类计数结果(各组与模型组相比：P＜0.05*P＜0.01**)。

图10为本发明款冬花提取物药理实验肺组织病理切片图。

图11为本发明款冬花提取物药理实验气管病理切片图。

具体实施方式

实施例1款冬花提取物的制备

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加4L石油醚(馏程60-90℃)常温浸泡5h，超声提取3次，每次60min，提取液过滤，减压浓缩至干燥，得浸膏1.31g，即得款冬花应用于哮喘治疗的提取物。

实施例2款冬花提取物的制备

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加8L石油醚(馏程60-90℃)常温浸泡3h，超声提取4次，每次40min，提取液过滤，减压浓缩至干燥，得浸膏1.20g，即得款冬花应用于哮喘治疗的提取物。

实施例3款冬花提取物的制备

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加5L正己烷，常温浸泡4h，超声提取2次，每次100min，提取液过滤，减压浓缩至干燥，得浸膏1.26g，即得款冬花应用于哮喘治疗的提取物。

实施例4款冬花提取物的制备

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加10L正己烷进行渗漉提取，提取液过滤，减压浓缩至干燥，得浸膏1.12g，即得款冬花应用于哮喘治疗的提取物。

实施例5款冬花提取物的制备

取干燥的款冬花蕾1kg粉碎，加10L石油醚常温浸渍24h，取提取液过滤，减压浓缩至干燥，得浸膏1.07g，即得款冬花应用于哮喘治疗的提取物。

实施例6款冬花提取物的核磁共振(¹H-NMR)分析

取实施例1中提取物20mg，加入氘代氯仿800μL溶解，取600μL上清液加入5mm核磁管中，进行核磁共振¹H-NMR分析(图1)。结合文献数据报道和标准品对照，对提取物中含有的化合物进行结构指认，鉴定的化合物结构如图2所示。

实施例7款冬花提取物的核磁共振(¹H-NMR)分析

取实施例3中提取物20mg，加入氘代氯仿800μL溶解，取600μL上清液加入5mm核磁管中，进行核磁共振¹H-NMR分析(图3)。结合文献数据报道和标准品对照，对提取物中含有的化合物进行结构指认，鉴定的化合物结构如图4所示。

实施例8款冬花提取物液相指纹图谱研究

取实施例1中款冬花提取物25mg溶于1.5mL色谱甲醇中，微孔滤膜过滤，采用如下条件进行高效液相检测，结果如图5所示。

色谱条件：Agilent 1260高效液相色谱检测仪；艾杰尔VenusiIMP C₁₈(5μm,4.6×250mm)色谱柱。流动相A乙腈，流动相B 0.03％甲酸水；检测波长：220nm；流速1ml/min；柱温25℃，进样量10微升。结合标准品对照，该提取物中含有化学成分的结构式如图6所示。

表1洗脱梯度表

实施例9款冬花提取物喷雾剂的制备

准确称量款冬花提取物1.00g加入研钵中，加入2％的吐温-80置于上述研钵中，研磨混合均匀，之后边加入0.9％生理盐水边研磨至混合均匀制成5mg/mL初乳，将上述初乳转移至高速组织捣碎匀浆机中；准确称取维生素C 0.1g(抗氧化剂)加入到高速组织捣碎匀浆机中；18000rpm/min搅拌速度下乳化3分钟后将其转移至高压均质机中，于150MPa压力下循环均化3次，得白色均一乳状液；将制备的乳剂封装于喷雾器中，每瓶100mL，含款冬花提取物500mg，置于凉暗处储存。

实施例10款冬花提取物对小鼠哮喘模型的影响

1动物

品系：BALB/c小鼠；性别：雄性；体重：18-22g；来源：北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0008，饲养：SPF级动物房常规饲养。

2受试药物

地塞米松磷酸钠注射液，天津金耀药业有限公司(购于太原市长城药店)，溶于0.9％生理盐水，配置成0.5mg/mL溶液。取款冬花提取物加2％吐温80(w/v)溶于0.9％生理盐水，配置成5mg/mL乳剂。

3试验方法

3.1实验动物分组及模型建立和给药方法

取小鼠56只，随机分为7组，每组8只小鼠，分别为空白组、模型组、阳性药组、A组、B组、C组、D组。模型组每只小鼠于第0、7d分别腹腔注射10％OVA(100mg OVA和100mg A1(OH)₃)的乳化混悬液1mL致敏，第15d开始激发：将小鼠置于自制密闭玻璃盒中，给予1％OVA(200mg OVA溶解于20mL生理盐水中)20mL超声雾化吸人，每天1次，每次30min，连续14d。A组、B组、C组、D组同模型组处理，只在每次OVA激发前30min内分别超声波雾化喷雾给予款冬花提取物0.2g/Kg，0.4g/Kg，0.6g/Kg，0.8g/Kg，连续14d。阳性药组同模型组处理，只在每次OVA激发前30min内分别喷雾给予地塞米松药物0.5mg/Kg，连续14d。空白组每只小鼠第0、7d皮下注射1mL生理盐水，第15d在同样条件下用20mL生理盐水雾化，每天1次，每次30min，连续14d。

3.2血清中IL-17细胞因子水平

对小鼠连续给药14天，于末次给药1h后，进行摘眼球取血，每只取血量为0.8-1mL，3 000r/min、10min离心，上清保存备用，取50μL按ELISA试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)操作说明测试IL-17细胞因子水平。

4实验结果

IL-17是一种很强的前炎症细胞因子，诱导上皮细胞产生多种细胞因子从而抑制中性粒细胞(Neutrophil)凋亡，在气道、气道高反应性中发挥了重要作用。与模型组比较，4个剂量的款冬花提取物均能够降低IL-17细胞因子水平(P<0.05)，其中A组(0.2g/Kg)作用最明显(图7)。

实施例11款冬花提取物对大鼠哮喘模型的影响

1动物

品系：SD大鼠；性别：雄性；体重：200-220g；来源：北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-001，饲养：SPF级动物房常规饲养。

2受试药物

地塞米松磷酸钠注射液，天津金耀药业有限公司(购于太原市长城药店)，溶于0.9％生理盐水，配置成0.5mg/mL溶液。取款冬花提取物加2％吐温80(w/v)溶于0.9％生理盐水，分别配置成5mg/mL乳剂。

3试验方法

3.1实验动物分组及模型建立和给药方法

取大鼠60只，随机分为6组，每组10只大鼠，分别为空白组、模型组、阳性药组、A组、B组、C组。模型组每只大鼠于第0、7d分别腹腔注射10％OVA(100mg OVA和100mg A1(OH)₃)的乳化混悬液1mL致敏，第15d开始激发：将大鼠置于自制密闭玻璃盒中，给予1％OVA(200mg OVA溶解于20mL生理盐水中)20mL超声雾化吸人，每天1次，每次30min，连续14d。A组、B组、C组及阳性药组同模型组处理，只在每次OVA激发前30min内分别超声波喷雾给予款冬花提取物0.1g/Kg，0.2g/Kg，0.4g/Kg，及地塞米松0.5mg/Kg，连续给药14天。空白组每只大鼠第0、7d皮下注射1mL生理盐水，第15d在同样条件下用20mL生理盐水雾化，每天1次，每次30min，连续14d。

3.2血清中IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17细胞因子水平

对大鼠连续给药14天，于末次给药1h后，进行股动脉取血，每只取血量为9-10mL，3 000r/min、10min离心，上清保存备用，分别取50μL按ELISA试剂盒(上海生工)操作说明测试IFN-γ，Ig-E，IL-4，IL-17细胞因子水平。

3.3支气管灌洗液(BLAF)细胞分类计数

大鼠取血后，打开胸腔，暴露肺组织，气管切开插管，结扎右主支气管，取PBS缓冲液(pH为7.2-7.4)于气管插管处注入，缓慢灌洗左肺3次，每次1mL并回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，1 800r/min离心15min，取上清分装于EP管，-80℃保存用于细胞计数，计噬酸性粒细胞(Eosinophils，EOS),中性粒细胞(Neutrophil，NEU)，淋巴细胞(Lymphocytes，LYM)，单核细胞(Monocyte，MON)占总细胞数的百分比。

3.4肺组织及气管病理学观察

剪取大鼠左上肺组织，置于10％多聚甲醛溶液固定，石蜡切片后进行HE染色，显微镜下观察肺组织和气管中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞等炎症细胞的浸润情况。

4实验结果

4.1与模型组比较，3个剂量的款冬花提取物均能够降低Ig-E、IL-4及IL-17，升高IFN-γ因子水平，且具有显著性差异(P＜0.05)。Thl细胞主要分泌IFN-γ介导细胞免疫应答，对哮喘起保护作用。而Th2细胞分泌的IL-4同时促进B细胞的增殖，介导免疫球蛋白亚型的转变，促进IgE的生成，从而介导超敏。IL-17则是一种强大的前炎症细胞因子，诱导上皮细胞产生多种细胞因子从而抑制中性粒细胞(Neutrophil)凋亡，在气道、气道高反应性中发挥了重要作用(图8)。

4.2与模型组比较款冬花提取物能够降低BALF中EOS、NEU及MON，升高LYM的含量，且存在显著性差异(P＜0.05)。气道EOS炎症是哮喘的重要发病机制；NEU炎症反应在重型哮喘、激素抵型哮喘的发病机制中起重要作用；LYM在免疫调节中发挥了重要作用(图9)。

4.3肺部及气管病理切片如图10、11所示：正常对照组大鼠肺组织无实质性异常炎症改变，气道黏膜上皮及肺泡结构完整，肺泡间隔窄，气道平滑肌薄，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠气道和支气管壁周围有大量的炎性细胞浸润，支气管平滑肌层肥大、增生，黏膜充血、水肿，气道腔内上皮脱落、受损，管腔内充满大量的黏性分泌物，肺泡结构亦出现紊乱、融合现象，表明哮喘模型复制成功。阳性药组和款冬花提取物给药组A组，B组，C组的炎性细胞浸润情况均有不同程度减轻，气道粘膜上皮及肺泡结构均有不同程度恢复，气道官腔内上皮均有不同程度愈合，其中C组效果最好。