一种竹柳抗氧化活性组分的制备方法和应用与流程

本发明涉及竹一种竹柳抗氧化活性组分的制备方法和应用，该提取物分离自竹柳皮正丁醇部位，具有抗氧化活性，属于天然产物有效成分的提取、分离纯化领域。

背景技术：

竹柳(Salix ssp.)又称美国竹柳，为杨柳科(Saliaceae)柳属(Salix)植物，是美国寒柳、朝鲜柳和筐柳杂交的优良品系(王子成，2008)，其在继承传统柳属植物众多的优良品性的同时表现出生长快、材质好、抗性强等优点(张健等，2009)，是常用的速生用材林树种和生物质能源树种(徐克顺，2011)。

近年来，竹柳种植面积在我国迅速扩大，据统计，其成片林已超过1300hm²(胡国涛等，2016)，竹柳的储备量丰富，但目前竹柳的产业化尚不成熟，鲜有深加工产品和高附加值产品。而同属柳树作为药用的历史悠久，明代《本草纲目》中就记载“柳为本经下品，其性苦寒、无毒，可治疗风水黄疽，疮痈肿痛，痰热淋疾，湿痹等疾症”，且其各部分都可入药，可谓“全身都是宝”。现代有关柳属植物的化学和药理活性的研究表明，其化学成分包括黄酮类、酚苷类、苯丙素类、醌类、甾体类、萜类、有机酸类等，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗菌、抗诱变、降压、利尿等药理作用(刘墨祥等，1997；封士兰等，2001；赵红娟等，2010；毛竹君等，2013)。故作为同属的竹柳，虽然目前与其化学成分和生物活性方面相关的研究鲜有报道。但已有研究表明竹柳表现出与同属植物相似的生物活性，有巨大的潜力可开发成高附加值的药品。

CN105237594A公开了一种从竹柳皮中提取水杨苷的制备方法，该方法是：将竹柳树皮粉碎后，采用连续微波干燥法，制得竹柳树皮粉，用无离子水超声逆流提取后得提取液，提取液经纯化、浓缩、干燥后获得水杨苷。该发明中仅就竹柳中的水杨苷进行了提取，而未对竹柳中其他有效成分进行提取研究。且现有技术中也未有将柳或竹柳具有抗氧化活性的提取物的相关报道，及将该抗氧化活性组分用于高血脂病治疗的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的竹柳化学成分、生物活性等相关研究的不足以及以竹柳为原料开发的医药产品的空白，提供一种竹柳抗氧化活性组分的制备方法，并研究了该活性组分在医药产品领域中的应用。

为了实现上述目标，本发明的第一个方面在于提供一种竹柳抗氧化活性组分的制备方法，将竹柳皮粉末，用5至20倍70％乙醇超声提取1～5次，每次30-120min，得提取液；将提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入蒸馏水溶解，先后用乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，正丁醇萃取液经减压浓缩干燥，得到粗提物粉末，经纯化后既得竹柳抗氧化活性组分。

具体包括以下步骤：

A)提取：竹柳皮粉末，粒度10～40目，按照料液比1:5～1:20加入70％乙醇溶液，超声提取条件为，频率9～18KHz，温度20～50℃，时间30～120min，超声次数1～5次，获得提取液；提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入适量蒸馏水复溶，用相同体积乙酸乙酯萃取至有机层无色，弃去乙酸乙酯层，加入与水层相同体积的水饱和正丁醇萃取至有机层无色，合并萃取液，减压浓缩至一定体积，真空干燥(600～1000Pa，40～50℃，120～180min)，得到粗提粉末；

B)Sephadex LH-20纯化：Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，径高比1:18，步骤A)所得粉末用少量95％乙醇溶液溶解，湿法上样，以95％乙醇溶液为洗脱剂，流速为0.4BV·h^-1，等度洗脱3BV，收集2h后的洗脱液，HPLC检测，得到除去色素的具有抗氧化活性的竹柳正丁醇萃取物溶液；

C)干燥及保存：步骤B)溶液减压浓缩至一定体积，真空干燥(600～1000Pa，40～50℃，120～180min)，经消毒、杀菌后，得到竹柳正丁醇萃取物粉末，即，竹柳抗氧化活性组分粉末。

优选的，所述步骤A)竹柳皮粉末原料粒度为24目，料液比为1：10，超声频率18KHz，超声温度30℃，超声时间60min，超声次数3次；真空干燥条件为800Pa，45℃条件下真空干燥150min；

优选的，所述步骤B)HPLC检测的色谱条件为0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm)。

优选的，所述步骤C)真空干燥条件为1000Pa，40℃，120min；所述的消毒、灭菌包括辐射灭菌、水蒸气灭菌、热空气灭菌中的一种或几种组合。

本发明研究发现本发明竹柳正丁醇萃取物对ABTS^+·自由基和DPPH^·自由基有很强的清除作用，且能提高小鼠组织中的超氧化歧化酶(SOD)的活性，抑制自由基损伤，防止脂质过氧化。通过人体试验表明该活性组分可以直接作为单方制剂用于因人体内自由基过多而产生的疾病的治疗，如高血脂的治疗。

因此，本发明第二个方面，提供含有竹柳抗氧化活性组分的制剂，由上述制备方法获得的竹柳抗氧化活性组分和药学上可接受的载体或稀释剂组成。所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶液、乳液、油膏、乳膏、气雾剂或栓剂。

本发明第三个方面，提供了竹柳抗氧化活性组分或含有竹柳抗氧化活性组分的制剂，在医药产品领域中的应用。优选的，在制备防治因人体内自由基过多而产生的疾病的药物中的应用，具体的，如，在制备防治高血脂的药物中的应用。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢纳、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；所述润湿剂选自甘油、吐温80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

本发明所提供的一种竹柳抗氧化活性组分提取方法及应用，具有如下优点：

1.本发明创造性的以速生用材林树种和生物质能源树种的竹柳为研究对象，首次对竹柳正丁醇提取方法进行探索研究，获得竹柳正丁醇萃取物，即本发明竹柳抗氧化活性组分。为竹柳在医药产品领域中的应用奠定基础，有助于竹柳附加值的提高。

2.本发明对竹柳正丁醇萃取物进行了药理及毒性研究，证明该提取物可以直接作为单方制剂或是与其他组分复配用于清除自由基、防止脂质过氧化，用于因人体内自由基过多而产生的疾病的治疗，如高血脂的治疗。

3.本发明竹柳正丁醇萃取物抗氧化活性高，无毒副作用，安全性好，且采用全程低温操作工艺保证提取物化学稳定性，所用溶剂可以循环使用，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明竹柳正丁醇萃取物HPLC色谱图。

图2为不同浓度实施例1和对比实施例1样品的ABTS^+·清除率结果。

图3为不同浓度实施例1和对比实施例1样品的DPPH^·清除率结果。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

用正丁醇萃取竹柳抗氧化活性组分，步骤如下：

A)提取：精密称取粉碎后过24目筛的竹柳皮粉末100g，加入十倍量的70％乙醇溶液作为提取溶剂，超声波提取3次，每次60min，超声温度为30℃，过滤，提取液合并，45℃减压浓缩至无乙醇残留，加入80mL蒸馏水溶解制成100mg/mL的样品溶液，用相同体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，加入与水层相同体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，40℃减压浓缩至一定体积，于800Pa，45℃条件下真空干燥150min；

B)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱径高比为1:18，将A步骤所得粉末用少量95％乙醇溶液溶解制成50mg/mL样品溶液，湿法上样，以95％乙醇溶液为洗脱剂，流速为0.4BV·h^-1，等度洗脱3BV，收集2h后的洗脱液，HPLC检测(色谱条件为0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳正丁醇萃取物溶液；色谱图如图1所示。

C)干燥及保存：竹柳正丁醇萃取物溶液减压浓缩至一定体积，于1000Pa，40℃条件下，真空干燥120min，辐射灭菌，得到最终以粉末形式保存的具有抗氧化活性的竹柳正丁醇萃取物。

实施例2

用正丁醇萃取竹柳抗氧化活性组分，步骤如下：A)提取：精密称取粉碎后过40目筛的竹柳皮粉末100g，加入5倍量的70％乙醇溶液作为提取溶剂，超声波提取3次，每次45min，超声温度为30℃，过滤，提取液合并，45℃减压浓缩至无乙醇残留，加入80mL蒸馏水溶解制成100mg/mL的样品溶液，用相同体积的乙酸乙酯萃取4次，弃去乙酸乙酯层，加入与水层相同体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，40℃减压浓缩至一定体积，于800Pa，45℃条件下真空干燥150min；

B)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱径高比为1:18，将A步骤所得粉末用少量95％乙醇溶液溶解制成50mg/mL样品溶液，湿法上样，以95％乙醇溶液为洗脱剂，流速为0.4BV·h^-1，等度洗脱3BV，收集2h后的洗脱液，HPLC检测(色谱条件为0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳正丁醇萃取物溶液；

C)干燥及保存：竹柳正丁醇萃取物溶液减压浓缩至一定体积，于1000Pa，40℃条件下，真空干燥120min，水蒸气灭菌，得到最终以粉末形式保存的具有抗氧化活性的竹柳正丁醇萃取物。

实施例3

用正丁醇萃取竹柳抗氧化活性组分，步骤如下：A)提取：精密称取粉碎后过10目筛的竹柳皮粉末100g，加入20倍量的70％乙醇溶液作为提取溶剂，超声波提取4次，每次90min，超声温度为30℃，过滤，提取液合并，45℃减压浓缩至无乙醇残留，加入80mL蒸馏水溶解制成100mg/mL的样品溶液，用相同体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，加入与水层相同体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，40℃减压浓缩至一定体积，于800Pa，45℃条件下真空干燥150min；

B)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱径高比为1:18，将B步骤所得粉末用少量95％乙醇溶液溶解制成50mg/mL样品溶液，湿法上样，以95％乙醇溶液为洗脱剂，流速为0.4BV·h^-1，等度洗脱3BV，收集2h后的洗脱液，HPLC检测(色谱条件为0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳正丁醇萃取物溶液；

C)干燥及保存：竹柳正丁醇萃取物溶液减压浓缩至一定体积，于1000Pa，40℃条件下，真空干燥120min，热空气灭菌，得到最终以粉末形式保存的具有抗氧化活性的竹柳正丁醇萃取物。

对比实施例1

按实施例1中的A)和C)步骤制得相应粉末。

对比实施例2

实施例1中的A)步骤中所得的乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩，真空干燥所得的粉末。

实验例1

竹柳抗氧化活性组分ABTS^+·自由基清除试验：

ABTS^+·自由基的产生：5mL 7mM ABTS溶液与0.88mL140mM过硫酸钾溶液混匀，甲醇稀释混合液至过硫酸钾的终浓度达到2.45mM，避光室温放置16h，生成稳定的ABTS^+·，甲醇稀释，使ABTS^+·在734nm波长下的吸光度值为0.7±0.02，备用。

将实施例1、对比实施例1和对比实施例2的样品用无水乙醇溶解，制成浓度为2mg/mL的供试品母液，随后用无水乙醇将各供试品母液稀释配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和1.00mg/mL的样品溶液。精密移取各样品溶液0.15mL，各加入2.85mL ABTS^+·溶液，混匀，室温反应10min，于734nm处测定各样品的吸光度(Miller et al,1993；Li,Zhou,&Han,(2006))，以无水乙醇为空白，每个样品重复测定3次，按公式1计算各样品的自由基清除率，不同浓度的实施例1和对比实施例1样品溶液的清除率ABTS^+·结果见图2。采用SPSS软件，计算出各样品IC₅₀值(半数抑制率时各样品浓度)，实验结果见表1。

A₀：不含样品吸光度值；A₁：样品吸光度值；A₂：空白试剂吸光度值

表1各样品清除ABTS^+·的IC₅₀值

注:代表与实施例1相比，P＜0.01。

由实验结果可以看出，对比实施例2并未表现出ABTS^+·清除活性，表明竹柳乙酸乙酯部位不具有清除ABTS^+·的能力；实施例1与对比实施例1的ABTS^+·清除能力具有较大差异，相同浓度条件下，实施例1表现出极强的ABTS^+·清除活性，实施例1的IC₅₀值可达110.0μg/mL，与对比实施例1的IC₅₀值呈现显著性差异(P＜0.01)，表明竹柳正丁醇萃取液经过纯化后，可以显著提高其ABTS^+·清除活性，证明本发明用正丁醇萃取竹柳抗氧化活性组分方法的科学性。

实验例2

竹柳抗氧化活性组分DPPH^·自由基清除试验：

将实施例1、对比实施例1和对比实施例2的样品用无水乙醇溶解，制成浓度为2mg/mL的供试品母液，随后用无水乙醇将各供试品母液稀释配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和1.00mg/mL的样品溶液。精密移取各样品溶液2mL，随后加入2mL DPPH溶液(0.14mM)，混匀，室温避光反应30min，于517nm处测定各样品的吸光度Li,Zhou,and Han(2006)，以无水乙醇为空白，每个样品重复测定3次，按公式1计算各样品的自由基清除率，用SPSS计算出各样品IC₅₀值。

表2各样品清除DPPH^·的IC₅₀值

注:代表与实施例1相比，P＜0.01。

由实验结果可以看出，对比实施例2并未表现出DPPH^·清除活性，表明竹柳乙酸乙酯部位不具有清除DPPH^·的能力；实施例1与对比实施例1的DPPH^·清除能力具有较大差异(如图3所示)，相同浓度条件下，实施例1表现出极强的DPPH^+·清除活性，实施例1的IC₅₀值可达141.0μg/mL，与对比实施例1的IC₅₀值呈现显著性差异(P＜0.01)，表明竹柳正丁醇萃取液经过纯化后，可以显著提高其DPPH^·清除活性，证明本发明用的竹柳正丁醇萃取物提取竹柳抗氧化活性组分方法的科学性。。

实验例3

竹柳抗氧化活性组分对小鼠组织中的超氧化歧化酶(SOD)活性的影响：

取昆明种小鼠40只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，即实施例1组、对比实施例1组、对比实施例2组和生理盐水对照组。各组按20mL·kg^-1的剂量灌胃给药，每日1次，连续30d，对照组灌胃生理盐水。各组小鼠于末次给药后12h后称重并摘眼球取血，血于-80℃冷冻保存，同时迅速处死小鼠，剖取心、肝、脑组织，用4℃的生理盐水冲洗组织表明，滤纸吸干水分，称重并在低温条件下进行组织匀浆，匀浆液于-80℃保存，随后采用试剂盒测定小鼠血、肝、脑中SOD(超氧化物歧化酶)含量，实验结果见表3。

表3各样品对小鼠全血、SOD活力的影响(n＝10，)

注:*代表与对照组相比，P＜0.01；代表与实施例1相比，P＜0.01。

由实验结果可以看出，与对照组相比，对比实施例2组的结果与对照组未见明显差异，表明竹柳乙酸乙酯萃取物不能提高小鼠血、肝、脑的SOD活力，而实施例1组和对比实施例1组小鼠血、肝、脑中的SOD含量较高，且呈显著性差异(P＜0.01)，表明实施例1和对比实施例1可以提高小鼠血、肝、脑中的SOD含量，且实施例1与对比实施例1相比，其能显著升高小鼠血、肝、脑中的SOD含量(P＜0.01)丁醇萃取物经纯化后，其提高机体SOD活力的能力可显著升高，SOD是机体内清除自由基的关键酶，其含量高低可以间接反映机体清除自由基的能力，因此，可以通过服用本发明竹柳抗氧化活性组分方式提高机体清除自由基的能力。

实验例4

竹柳抗氧化活性组分临床应用-治疗高血脂的人体试验

①竹柳抗氧化活性组分片剂的制备

称取按实施例1制备的竹柳抗氧化活性组分粉末80g，粉碎，过80目筛，加入12g玉米淀粉(稀释剂)、8g微晶纤维素(粘合剂和崩解剂)，混合45min，将混合物加入制粒机中加热造粒，预混合5min，当出风温度达到40℃时，喷90wt％乙醇溶液，于50℃下干燥使物料含水量控制在5.0wt％以下，然后过14目尼龙筛进行整粒，向整粒后的颗粒中加入0.5g硬脂酸镁(润滑剂)，混合10min，压片，得片重为0.5g的竹柳正丁醇萃取物片剂。

②一般资料

高血脂患者100例，年龄20～65岁，病程在1个月到5年之间。

③主要症状

血浆总胆固醇含量≥6.2mmol/L，甘油三酯含量≥2.3mmol/L，患者可伴有肥胖、头晕等症状。

④实验分组

将患者随机分为两组，包括治疗组和对照组，每组50例。治疗组服用按上述方法制备的竹柳抗氧化活性组分片剂进行治疗，每日3次，每次1～2片，一个月为一个疗程，对照组服用力平之。

⑤疗效判断标准

痊愈：服药后临床症状消失，总胆固醇及甘油三酯恢复正常；

有效：服药后症状减轻，总胆固醇及甘油三酯下降≥20％；

无效：症状略有减轻或无变化，总胆固醇及甘油三酯下降＜20％。

各组对高血脂的治疗效果见表4。由实验结果可以看出，本发明片剂高血脂具有较好的治疗效果(总有效率＞90％)，且治疗组患者，在服药观察期间未出现任何不良反应或毒副反应，表明该片剂在临床上可用于高血脂的治疗。

表4各组对高血脂的治疗效果