一种竹柳抗菌活性组分的水提制备方法及应用与流程

本发明涉及一种竹柳抗菌活性组分的水提制备方法及应用，属于天然产物有效成分的提取、分离纯化领域。

背景技术：

竹柳(Salix ssp.)又称美国竹柳，为杨柳科(Saliaceae)柳属(Salix)植物，是美国寒柳、朝鲜柳和筐柳杂交的优良品系(王子成，2008)，其在继承传统柳属植物众多的优良品性的同时表现出生长快、材质好、抗性强等优点(张健等，2009)，是常用的速生用材林树种和生物质能源树种(徐克顺，2011)。

近年来，竹柳种植面积在我国迅速扩大，据统计，其成片林已超过1300hm²(胡国涛等，2016)，竹柳的储备量丰富，但目前竹柳的产业化尚不成熟，鲜有深加工产品和高附加值产品。而同属柳树作为药用的历史悠久，明代《本草纲目》中就记载“柳为本经下品，其性苦寒、无毒，可治疗风水黄疽，疮痈肿痛，痰热淋疾，湿痹等疾症”，且其各部分都可入药，可谓“全身都是宝”。现代有关柳属植物的化学和药理活性的研究表明，其化学成分包括黄酮类、酚苷类、苯丙素类、醌类、甾体类、萜类、有机酸类等，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗菌、抗诱变、降压、利尿等药理作用(刘墨祥等，1997；封士兰等，2001；赵红娟等，2010；毛竹君等，2013)。故作为同属的竹柳，虽然目前与其化学成分和生物活性方面相关的研究鲜有报道。但已有研究表明竹柳表现出与同属植物相似的生物活性，有巨大的潜力可开发成高附加值的药品。

CN105237594A公开了一种从竹柳皮中提取水杨苷的制备方法，该方法是：将竹柳树皮粉碎后，采用连续微波干燥法，制得竹柳树皮粉，用无离子水超声逆流提取后得提取液，提取液经纯化、浓缩、干燥后获得水杨苷。该发明中仅就竹柳中的水杨苷进行了提取，而未对竹柳中其他有效成分进行提取研究。且现有技术中也未有将柳或竹柳具有抗菌活性的提取物的相关报道，及将该抗菌活性组分用于真菌感染治疗的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的竹柳化学成分、生物活性等相关研究的不足以及以竹柳为原料开发的医药产品的空白，提供一种从竹柳皮中制备抗菌活性组分的方法，并研究了该活性组分在医药产品领域中的应用。

为了实现上述目标，本发明的第一个方面在于提供一种竹柳抗菌活性组分的水提制备方法，将竹柳皮粉末，用5至20倍蒸馏水超声提取1～5次，每次30-120min，得提取液；提取液经醇沉除去水溶性杂质后，用大孔树脂分离，收集95％乙醇洗脱段，减压浓缩后，经Sephadex LH-20纯化除去色素后即得竹柳抗菌活性组分。

具体步骤如下：

A)提取：以竹柳皮为原料，以蒸馏水作为溶剂，超声波提取，提取方法为原料粒度10～40目，料液比1:5～1:20，超声频率9～18KHz，超声温度30～70℃，超声时间30～120min，超声次数1～5次；

B)醇沉：步骤A)所得提取液减压浓缩至一定体积，缓慢加入适量乙醇，使提取液最终醇浓度达到60～80％，于4℃条件下保存12～24h，离心，取上层清液，减压浓缩至无醇味；

C)大孔树脂分离：大孔树脂湿法装柱，径高比1:12，步骤B)所得样品湿法上样，分别以蒸馏水和体积分数为30％、50％以及95％的乙醇溶液为洗脱液，按1～2BV·h^-1流速梯度洗脱，收集95％乙醇洗脱段，低温减压浓缩，冷冻干燥，HPLC检测；

D)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱湿法装柱，径高比1:18，步骤C)所得粉末用适量乙醇水溶液溶解，以体积分数为90％的乙醇溶液为洗脱液，按0.4BV·h^-1流速洗脱，洗脱3BV，收集2h的洗脱液，HPLC检测；

E)干燥及保存：步骤D)所得洗脱液减压浓缩至一定体积，冷冻干燥，经消毒、杀菌后，得到具有抗菌活性的竹柳水提物粉末。

进一步，优选的所述步骤A)竹柳皮原料粒度为24目，料液比为1：10，超声频率18KHz，超声温度50℃，超声时间90min，超声次数3次。

进一步，优选的所述步骤B)最终乙醇浓度为70％，于4℃冰箱保存18h。

进一步，优选的所述步骤C)大孔树脂型号为AB-8；所用的梯度洗脱剂为蒸馏水、体积分数为30％、50％以及95％的乙醇溶液，每个梯度梯度洗脱至流出液为无色时，更换下一个梯度，每个梯度洗脱3～5BV(柱体积)；优选的流速为1.5BV·h^-1。

进一步，所述的用于HPLC检测的色谱条件为0-20min，5-15％甲醇水，20-70min，15-55％甲醇水，70-80min，55-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

进一步，优选的所述步骤E)冷冻干燥条件为冻结时间1h，升华干燥压力为80Pa，解吸干燥压力为30Pa，解吸干燥物料温度45℃，物料厚度8mm，干燥时间12h消毒、灭菌包括辐射灭菌、水蒸气灭菌、热空气灭菌中的一种或几种组合。

本发明获得的竹柳水提物，其对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌均有较好的抑制活性，该竹柳水提物可以直接作为单方制剂用于由细菌感染所致疾病的治疗，如急性扁桃体炎、急性咽炎、急性喉炎以及急性中耳炎的治疗。

因此，本发明第二个方面，提供含有竹柳抗菌活性组分的制剂，由上述方法制备的竹柳抗菌活性组分和药学上可接受的载体或稀释剂组成。所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶液、乳液、油膏、乳膏、气雾剂或栓剂。

本发明第三个方面，提供了竹柳抗菌活性组分或含有竹柳抗菌活性组分的制剂，在医药产品领域中的应用。优选的，在制备防治由细菌感染所致疾病的药物中的应用，如急性扁桃体炎、急性咽炎、急性喉炎以及急性中耳炎。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢纳、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；所述润湿剂选自甘油、吐温80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

本发明所提供的一种竹柳抗菌活性组分的水提制备方法及应用，具有如下优点：

1.本发明创造性的以速生用材林树种和生物质能源树种的竹柳为研究对象，确定其抗菌活性组分的制备方法，为竹柳在医药产品领域中的应用奠定基础，有助于竹柳附加值的提高。

2.本发明所提供的竹柳水提物抗菌活性高，对常见的致病细菌(乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等)均有较好的抑制效果，可用于急性扁桃体炎、急性咽炎、急性喉炎以及急性中耳炎的治疗。

3.本发明制备工艺全程低温操作保证提取物化学稳定性，所用提取溶剂绿色无污染，可以循环使用，节约成本，制备的活性组分抗菌活性高，无毒副作用，适合工业化生产。

附图说明

图1为步骤C)大孔树脂分离后的竹柳提取物HPLC色谱图。

图2为步骤D)Sephadex LH-20纯化后的竹柳水提物HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

竹柳抗菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过24目筛的竹柳皮粉末100g，加入十倍量的蒸馏水，超声提取3次，每次90min，超声频率18KHz，超声温度为50℃，抽滤，提取液合并；

B)醇沉：提取液减压浓缩至50mL，缓慢加入140mL95％乙醇，使提取液含醇量达到70％，于4℃条件下保存18h，离心，取上层清液，减压浓缩至无醇味；

C)大孔树脂分离：AB-8型大孔树脂湿法装柱，径高比1:12，步骤B)所得浓缩液湿法上样，以蒸馏水、体积分数30％、50％以及95％的乙醇溶液为洗脱液，按1.5BV·h^-1流速每个梯度洗脱4BV，收集95％乙醇洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，5-15％甲醇水，20-70min，15-55％甲醇水，70-80min，55-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，检测结果如图1所示。洗脱液低温减压浓缩，冷冻干燥；

D)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱湿法装柱，径高比1:18，步骤C)所得粉末用适量乙醇水溶液溶解制成浓度为50mg/mL样品溶液，以体积分数为90％的乙醇溶液为洗脱液，按0.4BV·h^-1流速洗脱，洗脱3BV，收集2h的洗脱液，HPLC检测，检测结果如图2所示；

E)干燥及保存：步骤D)所得洗脱液减压浓缩至一定体积，冷冻干燥(冻结时间1h，升华干燥压力为80Pa，解吸干燥压力为30Pa，解吸干燥物料温度45℃，物料厚度8mm，干燥时间12h)。经辐射灭菌后，得到具有抗菌活性的竹柳水提物粉末。

实施例2

竹柳抗菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过40目筛的竹柳皮粉末100g，加入5倍量的蒸馏水，超声提取3次，每次60min，超声频率12KHz，超声温度为55℃，抽滤，提取液合并；

B)醇沉：提取液减压浓缩至50mL，缓慢加入120mL95％乙醇，使提取液含醇量达到60％，于4℃条件下保存24h，离心，取上层清液，减压浓缩至无醇味；

C)大孔树脂分离：AB-8型大孔树脂湿法装柱，径高比1:12，步骤B)所得浓缩液湿法上样，以蒸馏水、体积分数30％、50％以及95％的乙醇溶液为洗脱液，按1.0BV·h^-1流速每个梯度洗脱5BV，收集95％乙醇洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，5-15％甲醇水，20-70min，15-55％甲醇水，70-80min，55-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，洗脱液低温减压浓缩，冷冻干燥；

D)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱湿法装柱，径高比1:18，步骤C)所得粉末用适量乙醇水溶液溶解制成浓度为50mg/mL样品溶液，以体积分数为90％的乙醇溶液为洗脱液，按0.4BV·h^-1流速洗脱，洗脱3BV，收集2h的洗脱液，HPLC检测；

E)干燥及保存：步骤D)所得洗脱液减压浓缩至一定体积，冷冻干燥(冻结时间1h，升华干燥压力为80Pa，解吸干燥压力为30Pa，解吸干燥物料温度45℃，物料厚度8mm，干燥时间12h)。经热空气灭菌后，得到具有抗菌活性的竹柳水提物粉末。

实施例3

竹柳抗菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过10目筛的竹柳皮粉末100g，加入20倍量的蒸馏水，超声提取4次，每次90min，超声频率9KHz，超声温度为70℃，抽滤，提取液合并；

B)醇沉：提取液减压浓缩至50mL，缓慢加入160mL95％乙醇，使提取液含醇量达到80％，于4℃条件下保存12h，离心，取上层清液，减压浓缩至无醇味；

C)大孔树脂分离：AB-8型大孔树脂湿法装柱，径高比1:12，步骤B)所得浓缩液湿法上样，以蒸馏水、体积分数30％、50％以及95％的乙醇溶液为洗脱液，按2.0BV·h^-1流速每个梯度洗脱3BV，收集95％乙醇洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，5-15％甲醇水，20-70min，15-55％甲醇水，70-80min，55-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))，洗脱液低温减压浓缩，冷冻干燥；

D)Sephadex LH-20纯化：凝胶柱湿法装柱，径高比1:18，步骤C)所得粉末用适量乙醇水溶液溶解制成浓度为50mg/mL样品溶液，以体积分数为90％的乙醇溶液为洗脱液，按0.4BV·h^-1流速洗脱，洗脱3BV，收集2h的洗脱液，HPLC检测；

E)干燥及保存：步骤D)所得洗脱液减压浓缩至一定体积，冷冻干燥(冻结时间1h，升华干燥压力为80Pa，解吸干燥压力为30Pa，解吸干燥物料温度45℃，物料厚度8mm，干燥时间12h)。经水蒸气灭菌后，得到具有抗菌活性的竹柳水提物粉末。

对比实施例1

按实施例1中的A)、B)、C)和E)步骤制得相应粉末。

对比实施例2

实施例1中的C)步骤所得的蒸馏水洗脱液，经低温减压浓缩，冷冻干燥所制得的相应粉末。

对比实施例3

实施例1中的C)步骤所得的30％乙醇洗脱液，经低温减压浓缩，冷冻干燥所制得的相应粉末。

对比实施例4

实施例1中的C)步骤所得的50％乙醇洗脱液，经低温减压浓缩，冷冻干燥所制得的相应粉末。

实验例1

竹柳水提物抑制菌丝生长速率实验：

采用抑制菌丝生长速率法测定实施例1、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3以及对比实施例4对乙型溶血性链球菌(LQJ)、金黄色葡萄球菌(PQJ)、芽孢杆菌(YGJ)、大肠杆菌(DGJ)、铜绿假单胞菌(DBJ)的抑制率。

称取上述样品粉末适量，乙醇溶解制成浓度为5mg/mL的供试样品溶液，供试样品溶液用0.22μL针头式细菌滤器过滤后，量取2.4mL加入45mL培养基中混匀，用直径75mm培养皿制成三皿。选择已经培养好的生长均匀的菌落用打孔器制成直径5mm的菌饼。当含有供试样品溶液的培养基凝固后于培养皿中心接种菌饼。阴性对照组用2.4mL50％乙醇溶液代替供试样品溶液，阳性对照组用1mg/mL的青霉素溶液替代供试品溶液，于37℃恒温培养箱中培养，待阴性对照组培养基长满菌丝时，用十字夹叉法测量供试样品组的菌落直径，取平均值，按下述公式计算抑制率(陈年春，1991)。每组平行三次。实验结果见表1。

表1各组对5种细菌菌丝生长率的抑制活性(n＝3)

注:*代表与空白对照组相比，P＜0.01；代表与阳性对照组相比，P＜0.01；代表与实施例1相比，P＜0.01.

由实验结果可以看出，与阴性对照相比，除对比实施例2组外，其余各组对上述5种细菌均表现一定的抑制效果，但是样品组只有实施例1和对比实施例1的抑制率与其呈现显著性差异(P＜0.01)，对5种细菌的菌丝生长抑制率均大于抑制率60％，表明实施例1和对比实施例1具有较强的抗菌活性，同时也表明竹柳抗菌活性制备方法中的C)步骤所述的收集95％乙醇洗脱段的合理性；对比实施例1对5种细菌的菌丝生长抑制率较实施例1的菌丝生长抑制率低，且呈现显著性差异(P＜0.01)，表明竹柳抗菌活性制备方法中的D)步骤的合理性；实施例1对5种细菌的菌丝生长抑制率与阳性对照的菌丝生长抑制率相似，表明如发明所述的制备方法制得的竹柳水提物具有较好的抗菌活性，可应用于由乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌导致的疾病的治疗。

实验例2

竹柳水提物临床应用

-治疗急性扁桃体炎、急性咽炎、急性喉炎及急性中耳炎的人体试验

①竹柳水提物片剂的制备

称取按实施例1制备的竹柳水提物80g，粉碎，过80目筛，加入12g玉米淀粉(稀释剂)、8g微晶纤维素(粘合剂和崩解剂)，混合45min，将混合物加入制粒机中加热造粒，预混合5min，当出风温度达到40℃时，喷90wt％乙醇溶液，于50℃下干燥使物料含水量控制在5.0wt％以下，然后过14目尼龙筛进行整粒，向整粒后的颗粒中加入0.5g硬脂酸镁(润滑剂)，混合10min，压片，得片重为0.5g的竹柳水提物片剂。

②一般资料

病人320例，其中急性扁桃体炎100例，急性咽炎80例，急性喉炎80例，急性中耳炎60例，年龄12～65岁，其中男性患者210人，女性患者110人。

③主要症状及病因

急性扁桃体炎：表现出寒战发热，体温升高，头痛，颈背和四肢酸痛，食欲不振，咽部疼痛，扁桃体肿大，隐窝口由黄白色脓点，下颌淋巴结肿大及压痛的症状。主要病因为感染乙型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌等致病细菌。

急性咽炎：表现出眼部干燥、灼热、疼痛，发热，畏寒，食欲不振，四肢酸痛，咽部粘膜充血，咽后壁淋巴滤泡和咽侧索红肿的症状。要病因为感染乙型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌等致病细菌。

急性喉炎：表现出喉部有异物堵塞感，声音嘶哑，畏寒、发热、头痛，喉粘膜弥漫性充血、肿胀的症状。要病因为感染乙型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌等致病细菌。

急性中耳炎：表现出耳痛、畏寒、发热、头痛，耳道可流软耳垢或脓液的症状。要病因为感染乙型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌等致病细菌。

④实验分组

将各疾病患者随机分为两组，包括治疗组和对照组，急性扁桃体每组50例，急性咽炎每组40例，急性喉炎每组40例，急性中耳炎每组30例。治疗组服用按上述方法制备的竹柳水提取片剂进行治疗，每日3次，每次1～2片，15天为一个疗程，对照组服用阿莫西林。2个疗程后观察患者病情变化。

⑤疗效判断标准

痊愈：服药后症状消失，恢复正常生活；

有效：服药后症状减轻，基本恢复正常生活；

无效：症状、体征略有减轻或无变化。

各组对4种急性炎症的治疗效果见表2。由实验结果可以看出，本发明片剂对4种不同急性炎症均有较好的治疗效果(总有效率＞90％)，其治疗效果与阳性对照的治疗效果相差不大，且治疗组患者，在服药观察期间未出现任何不良反应或毒副反应，表明该片剂在临床上可用于急性扁桃体炎、急性咽炎、急性喉炎以及急性中耳炎的治疗。

表2各组对4种急性炎症的治疗效果