一种治疗化疗脱发的药物的制作方法

本发明涉及一种治疗脱发的药物，具体涉及一种治疗脱发的由脐带间充质干细胞培养上清制备的Exosome。

背景技术：

化疗后脱发（Chemotherapy-induced alopecia，CIA）是化疗的主要毒性反应之一，可产生严重的心理不良反应。化疗药物消灭迅速分裂的癌细胞的同时，也攻击毛囊四周迅速分裂的细胞，导致脱发。对于化疗后脱发，一般服用中药配方药物予以预防，但是中药组方治疗较慢，过程较长，临床也有用西药的，但是一般副作用较大。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用从脐带间充质干细胞培养上清中提取的Exosome，其具有显著的治疗化疗所致脱发的功效。

其具体技术方案如下：

（1）脐带间充质干细胞的获取分离

取约5g脐带组织（取自当地医院妇产科，产妇及其家属已获知情权，并同意），然后缓冲液PBS反复冲洗5遍，然后用剪刀沿血管方向将脐带剪开，剪碎，生理盐水冲洗两遍；

（2）将剪碎的脐带组织小块，加入培养基(胎牛血清FBS10%和90%培养基DMEN)；

（3）培养上清液的获得

培养的脐带间充质干细胞在培养瓶中长到80%的时候，将培养基吸出来，换液传代；

（4）Exosome的获得

吸出来的培养基，离心机离心300×g离心10分钟，然后吸出上清液，去掉沉淀物，再离心16500×g，20分钟，离心结束后，取上清液，然后再离心，将上清液密封在离心管中120000× g，70分钟，收集沉淀。

脐带间充质干细胞的获取分离还可以为：将脐带从采集瓶内取出，放入大号培养皿中进行清洗，去除大体可见的血管以及其他组织，用含有抗生素的PBS溶液反复的冲洗3~5次，在超净工作台内使用剪刀将冲洗后的脐带组织剪成0.1 cm3左右大小的小块，放在等体积的0.1％胶原酶中。放置在37 ℃摇床80 r/min消化一小时，然后以800 r/min离心10 min，将上清以弃去，用体积分数为10％胎牛血清的DMEM（高糖）培养基吹打沉淀物质，制成悬液。

所述化疗药物损伤所引起的化学损伤性脱发小鼠模型建立还可以为：用石蜡/松香的混合物（1:1）热融化后，涂于小鼠背部，待凝固且变硬之后揭去致昆明小鼠脱发动物模型，然后间隔四天，两周，以小鼠背部没有毛发长出为标志。

Exosome的获得还可以为：

1）首先生长细胞的培养基中外来体血清游离。因此，加入到细胞培养基中的任何血清应该由耗尽外来体的超速在120000×g转速离心过夜，4℃之前使用；

2）将细胞悬液转移至离心管中；

3）开始离心，离心条件300×g离心10分钟，在4℃以沉淀细胞；

4）离心结束后转移上清到超速离心管中，如果没有完全加满PBS；

5）离心样品16500×g离心20分钟，在4℃以进一步除去细胞和细胞碎片；

6）通过0.2微米的过滤器过滤上清液，以除去颗粒比200nm大的；

7）超速离心机转移前的过滤上清新的超速离心管，密封管在120000 Xg,70分钟以沉淀Exosome；

8)弃上清；

9) 用生理盐水重悬Exosome。

在背部脱毛位置皮下多点注。注射时，用70％酒精棉球消毒，以左手的拇指、食指及中指将皮肤捏起，形成皱褶，右手将注射器针头刺入皮下，深约1.5~2 cm，注射0.05 mL的Exosome溶液，注射完后，用酒精棉球轻按进针部位皮肤，拔出针头，进行下一点皮下注射。

本发明所用到的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、顺铂注射液、胎牛血清（FBS）、酒精、胰蛋白酶（O.25％胰蛋白酶的配制：胰蛋白酶O.25g，溶于100mL的 PBS，充分溶解后，过滤除菌，在-20℃储存）等，均是无菌、无热源的，均可适用于临床病人。

本发明的所有操作步骤，都是药典允许的常规操作方法，包括采用无菌操作、无菌生理盐水洗涤、灭菌、无菌细胞浓缩和纯化等，所应用的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、胎牛血清、顺铂注射液等均是符合我国卫生机构的要求，操作完毕后做常规病毒、细胞检查及细菌、霉菌培养，只有合乎要求才能应用于临床。

本发明要求保护的Exosome制备的方法和治疗手段的优点：

（1）该方案可简单快速获得大量的Exosome，相较于采用试剂盒提取，大大降低成本，而且节省人力，短时间获得大量，足够使用。

（2）所使用的细胞脐带间充质干细胞，量大，易得，用以培养。

（3）相较于，目前存在的治疗方案，该方案，简单，易行，效果明显。

附图说明

图1 正常饲喂小鼠背部毛发。

图2 小鼠脱发模型。

图3 对照组小鼠背部毛发。

图4 注射Exosome治疗后小鼠背部毛发。

图5 正常小鼠皮肤组织H＆E染色。

图6 对照组小鼠皮肤组织H＆E染色。

图7 实验组小鼠皮肤组织H＆E染色。

图1是指：正常饲喂小鼠背部毛发正常组的小鼠的背部毛发情况，毛发浓密。

图2是指：小鼠脱发的模型造模成功的图片，背部光滑无毛。人为的造成脱发，然后顺铂注射液，使该部位不再生长毛发，机制同化学损伤脱发相同。

图3是指：注射顺铂注射液，不做治疗，实验结束时小鼠的背部毛发生长，缓慢，基本上生长。

图4是指：注射Exosome治疗后小鼠背部毛发，注射Exosome后，脱发部位长出毛发，实验结束时，基本恢复正常。

图5：正常小鼠皮肤组织H＆E染色，对照正常组的小鼠毛囊细胞较多，细胞核染色较深，说明大量的细胞处于细胞的分裂周期，小鼠的毛发生长旺盛

图6是指：对照组小鼠皮肤组织H＆E染色，细胞核较少，毛囊处于中空状态说明大量的细胞已经处于休止期，多数细胞已停止生长。

图7是指：实验组小鼠皮肤组织H＆E染色，毛囊周围细胞染色较深，细胞处于分裂期，促使毛囊的再生。大多数细胞都处在生长期，尤其是小鼠皮肤的表皮层处着色更深，说明Exosome可促使皮肤里面的VEGF的增多，促使细胞毛囊的生长，Exosome还可修复受损伤的细胞，刺激毛囊，使毛发再生。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

本发明所提供的治疗化疗脱发的药物包括如下步骤：

（1）脐带充质干细胞的获取分离。取约5g脐带组织（取自当地医院妇产科，产妇及其家属已获知情权，并同意），然后缓冲液PBS反复冲洗5遍，然后用剪刀沿血管方向将脐带剪开，剪碎，生理盐水冲洗两遍。

（2）将将剪碎的脐带组织小块，加入培养基(胎牛血清FBS10%和90%培养基DMEN)。

（3）培养上清液的获得。培养的脐带间充质干细胞在培养瓶中长到80%的时候，将培养基吸出来，换液传代。

（4）Exosome的获得。首先生长细胞的培养基中外来体血清游离，因此，加入到细胞培养基中的任何血清应该由耗尽外来体的超速在120000×g转速离心过夜，4℃之前使用；后将细胞悬液转移至离心管中；开始离心，离心条件300×g离心10分钟，在4℃以沉淀细胞;离心结束后转移上清到超速离心管中，如果没有完全加满PBS;离心样品16500×g离心20分钟，在4℃以进一步除去细胞和细胞碎片;通过0.2微米的过滤器过滤上清液，以除去颗粒比200nm大的;超速离心机转移前的过滤上清新的超速离心管，密封管在120000 ×g,70分钟以沉淀Exosome;弃上清；用生理盐水重悬Exosome。

（5）化学损伤引起的脱发小鼠模型的建立。用石蜡/松香的混合物（1:1）热融化后，涂于小鼠背部，待凝固且变硬之后揭去致昆明小鼠脱发动物模型，然后间隔四天，两周，以小鼠背部没有毛发长出为标志。

（6）Exosome治疗化学损伤引起的脱发。左手抓住小鼠，使小鼠头部向下背部朝上，以防止注射器刺入时损伤腹部器官。注射位置在小鼠下腹部正中线的两侧。针线坡面朝上，45度缓慢刺入，进针动作要轻柔。将Exosome注射液注射到小鼠背部脱发区，多点注射，缓慢拔出针头，切勿按压针眼部位。

药效试验

取自当地医院妇产科，产妇及其家属已获知情权，并同意），然后缓冲液PBS反复冲洗5遍，然后用剪刀沿血管方向将脐带剪开，剪碎，生理盐水冲洗两遍。

将将剪碎的脐带组织小块，加入培养基(胎牛血清FBS10%和90%培养基DMEN)。

培养上清液的获得。培养的脐带间充质干细胞在培养瓶中长到80%的时候，将培养基吸出来，换液传代。

后将细胞悬液转移至离心管中；开始离心，离心条件300×g离心10分钟，在4℃以沉淀细胞;离心结束后转移上清到超速离心管中，如果没有完全加满PBS;离心样品16500×g离心20分钟，在4℃以进一步除去细胞和细胞碎片;通过0.2微米的过滤器过滤上清液，以除去颗粒比200nm大的;超速离心机转移前的过滤上清新的超速离心管，密封管在120000 Xg,70分钟以沉淀Exosome;弃上清；用生理盐水重悬Exosome。

用石蜡/松香的混合物（1:1）热融化后，涂于小鼠背部，待凝固且变硬之后揭去致昆明小鼠脱发动物模型，然后间隔四天，两周，以小鼠背部没有毛发长出为标志。

左手抓住小鼠，使小鼠头部向下背部朝上，以防止注射器刺入时损伤腹部器官。注射位置在小鼠下腹部正中线的两侧。针线坡面朝上，45度缓慢刺入，进针动作要轻柔。将Exosome注射液注射到小鼠背部脱发区，多点注射，缓慢拔出针头，切勿按压针眼部位。

取雄性健康的小白鼠30只，分为三组，正常组（不作处理），对照组（不注射Exosome），实验组（注射Exosome治疗）。对照组和实验组用石蜡和松香1:1混合加热融化后，棉签均匀涂于小鼠背部，涂抹面积约为2cm×2cm，待冷却凝固后揭去去掉背部的毛发，然后给小鼠给小鼠注射配制好的顺铂注射液1mg/mL 0.05mL，每隔四天注射一次（对照组和实验组都注射），以背部涂抹处无毛光滑干净为成功标志。

治疗过程，将实验组小鼠放在超净工作台上，在注射前，用70％酒精棉球消毒，以左手的拇指、食指及中指将皮肤捏起，形成皱褶，右手将注射器针头刺入皮下，深约1.5~2cm，4位点注射0.05mL Exosome溶液。注射完后，用酒精棉球轻按进针部位皮肤，拔出针头。间隔三天，注射四次。20天后观察小鼠的毛发生长状况和皮肤组织切片H＆E染色。其中，图1 正常饲喂小鼠背部毛发。图2 小鼠脱发模型。图3 对照组小鼠背部毛发。图4 注射Exosome治疗后小鼠背部毛发。

各组在毛囊形态上有一定差异。图6可见化疗组毛囊缩短，基底变细，扭曲，成营养障碍性，毛囊管膨大，呈退行早期和退行中期。而注射Exosome图7组多数毛囊仍较粗大，毛囊着色较深，生长比较旺盛，多为生长Ⅵ期和退行早期毛囊。正常饲养组图5的小鼠毛囊密度较大，染色最深，生长十分旺盛，多为生长Ⅴ期 。