本发明涉及一种超声波辅助提取羔羊第四胃有效成分的快速制备方法，该提取物可作为治疗或预防各种胃病相关的药物或保健品的制备原料。
背景技术：
羔羊第四胃是羊的第四个胃，学名为反刍胃，是反刍动物特有的一种胃部结构。反刍动物拥有瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃四个胃，前三个胃没有胃腺，第四胃有胃腺，与普通单胃动物类似，能分泌消化液，故第四胃也称真胃。目前对于羊胃的研究应用主要是凝乳酶的提取，用于干酪的生产，而人们对羊胃的概念大多数仅仅停留在食用方面。《本草蒙荃》中记载：“牛羊肚健脾胃，免饮积食伤”，说明羊胃中含有对人体有益的活性成分，而羔羊第四胃中活性成分活性更高，值得被更好的利用。已有资料报道显示，羔羊第四胃内生物活性成分主要含有胃蛋白酶、凝乳酶、粘蛋白酶及双歧因子等。羔羊胃有效成分提取物目前已应用于治疗胃病的药物原料，其中凝乳酶与胃蛋白酶结合可用于分解蛋白质，促进蛋白质吸收，提高凝乳作用，改善与蛋白质溶解有关的胃功能障碍；粘蛋白可覆盖于胃黏膜表面，对胃损伤部位具有保护作用，使胃壁细胞增值，促进黏膜修复；双歧因子可促进双奇杆菌生长，对抗幽门螺旋杆菌等有害菌。新疆动植物资源丰富，畜牧业发达，羊类是其中资源最为丰富的一类畜产。以羔羊第四胃作为生产原料，与现代生物技术相结合进行生物制药，可变废为宝，将新疆得天独厚的生物资源转化为产业优势。
传统羔羊第四胃有效成分的提取方法耗时长，在工业化生产中效率低，且时间的延长必然对活性有一定的影响，因此寻找一种能快速、有效提取羔羊第四胃中活性物质的方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种超声波辅助提取羔羊第四胃有效成分的快速制备方法，该方法将脱脂羔羊第四胃粉在低温下加入22倍体积磷酸盐缓冲液溶解，在超声功率260瓦下，超声18分钟,然后利用盐酸溶液调节pH值为3.3，低温下激活，再用氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，过滤，离心，弃渣，上清液利用蒸馏水透析脱盐，离心去除透析形成的沉淀物(盐溶蛋白)后，上清液冷冻干燥，即得羔羊第四胃有效成分。通过响应面法寻找最佳超声波提取工艺，通过蛋白质含量测定、凝乳酶活性测定、胃蛋白酶活力测定及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，本发明所述方法获得的提取物蛋白含量达到71.5％，凝乳酶活性为26916Ru/g，胃蛋白酶活性为3685.2u/g，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图中凝乳酶及胃蛋白酶条带清晰。与传统搅拌自溶方法相比，本发明所述方法制备羔羊第四胃有效成分所需时间可显著缩短，且生物活性不减，易于扩大规模生产，是制备羔羊第四胃活性成分的理想方法之一。
本发明所述的一种超声波辅助提取羔羊第四胃有效成分的快速制备方法，按下列步骤进行：
a、取新鲜羔羊第四胃，利用预冷的蒸馏水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，温度-24℃下冷冻保存；
b、将步骤a所得羔羊第四胃剪碎，在温度-80℃下冷冻12小时，冷冻干燥，粉碎机粉碎，即得羔羊第四胃粉；
c、将步骤b所得羔羊第四胃粉加入石油醚机械搅拌，脱脂2次，即得脱脂羔羊第四胃粉，放在温度-24℃下冷冻保存；
d、将步骤c所得脱脂羔羊第四胃粉加入22倍体积的预冷过的磷酸盐缓冲液0.1moL/L，ph＝7.0溶解，在超声功率260瓦下，超声18分钟，得到提取液；
e、将步骤d提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下活化12小时；
f、将步骤e活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，用纱布过滤，在8000转/分下，离心8分钟，弃渣，上清液利用蒸馏水进行透析脱盐，每2小时换1次蒸馏水，透析48小时；
g、将步骤f透析的提取液，在8000转/分下，离心8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行冷冻干燥，即得羔羊第四胃有效成分，冷冻保存。
所述的方法获得的羔羊第四胃有效成分在制备治疗或预防各种胃病的药物原料中的用途。
本发明所述的一种超声波辅助提取羔羊第四胃有效成分的快速制备方法，该方法采用超声波辅助提取工艺，以凝乳酶活性，胃蛋白活性为导向，与传统搅拌自溶方法相比，在活性不减的前提下可显著缩短提取时间，提高了提取分离过程的准确性。将所得提取物进行常规测定，包括蛋白质含量测定，凝乳酶活性测定，胃蛋白酶活性测定，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定提取物蛋白质种类。通过本发明所述方法获得的提取物蛋白含量达到71.5％，凝乳酶活性为26916Ru/g，胃蛋白酶活性为3685.2u/g，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图中凝乳酶及胃蛋白酶条带清晰。
与传统搅拌自溶方法相比，该方法制备羔羊第四胃有效成分所需时间可显著缩短，且生物活性不减，易于扩大规模生产，而且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，是制备羔羊第四胃活性成分的理想方法之一。
附图说明
图1为本发明十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳-考马斯亮蓝染色图，其中1为超声波辅助提取，2为传统搅拌自溶方法提取，B为凝乳酶标准品，M为标准蛋白标记(其中从上往下数第7条带为胃蛋白酶标品)。
具体实施方式：
实施例1
a、取新鲜羔羊第四胃，利用预冷的蒸馏水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，温度-24℃下冷冻保存；
b、将步骤a所得羔羊第四胃剪碎，在温度-80℃下冷冻12小时，冷冻干燥，粉碎机粉碎，即得羔羊第四胃粉；
c、将步骤b所得羔羊第四胃粉加入石油醚机械搅拌，脱脂2次，即得脱脂羔羊第四胃粉，放在温度-24℃下冷冻保存；
d、将步骤c所得脱脂羔羊第四胃粉1g加入22倍体积的预冷过的磷酸盐缓冲液0.1moL/L，ph＝7.0溶解，在超声功率260瓦下，超声18分钟，得到提取液；
e、将步骤d提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下活化12小时；
f、将步骤e活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，用纱布过滤，在8000转/分下，离心8分钟，弃渣，上清液透析脱盐，每2小时换1次蒸馏水，透析48小时；
g、将步骤f透析的提取液，在8000转/分下，离心8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行冷冻干燥，即得羔羊第四胃有效成分，冷冻保存，得冻干品0.15克，即羔羊第四胃活性成分提取率为15％。
实施例2(对照)
a、取新鲜羔羊第四胃，利用预冷的蒸馏水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，温度-24℃下冷冻保存；
b、将步骤a所得羔羊第四胃剪碎，在温度-80℃下冷冻12小时，冷冻干燥，粉碎机粉碎，即得羔羊第四胃粉；
c、将步骤b所得羔羊第四胃粉加入石油醚机械搅拌，脱脂2次，即得脱脂羔羊第四胃粉，放在温度-24℃下冷冻保存；
d、将步骤c所得脱脂羔羊第四胃粉1g加入22倍体积的预冷过的磷酸盐缓冲液0.1moL/L，ph＝7.0溶解，搅拌10分钟，温度-4℃下自溶48小时，得到提取液；
e、将步骤d提取液用1moL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3，温度-4℃下活化12小时；
f、将步骤e活化后的提取液用1moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，用纱布过滤，在8000转/分下，离心8分钟，弃渣，上清液透析脱盐，每2小时换1次蒸馏水，透析48小时；
g、将步骤f透析的提取液，在8000转/分下，离心8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行冷冻干燥，即得羔羊第四胃有效成分，冷冻保存。得冻干品0.058克，即羔羊第四胃活性成分提取率为5.8％。
实施例3
蛋白质浓度的测定：
利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法对实施例1、实施例2(对照)所得羔羊第四胃有效成分提取物进行蛋白质浓度测定：
标准曲线的绘制：根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，每50倍体积的BCA试剂A溶液加1倍体积的BCA试剂B溶液，充分混匀备用；根据表1吸取试剂盒中蛋白标准品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀，各管分别取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30分钟，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm。每个做三组平行，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标进行回归运算；
表1、系列稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品
样品的测定：
精确称取2.5毫克样品，加入1mL蒸馏水溶解，10000转/分离心2分钟，按照标准曲线操作方法，取25μL样品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30分钟，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个样品做三组平行，按照标准曲线计算蛋白质的含量；
实验结果：
实施例1所述方法蛋白含量为71.5％，实施例2所述方法蛋白含量为63.8％，利用超声波辅助提取法可提高蛋白含量，这可能是因为超声波靠其空化作用破坏组织结构,释放其中的蛋白质进入提取液中,使蛋白质含量增加。
实施例4
凝乳酶活性测定：
对实施例1、实施例2(对照)所得羔羊第四胃有效成分提取物进行凝乳酶活力测定。
底物溶液的制备：取全脂奶粉12克，加入氯化钙溶液(取醋酸钠1.25克，氯化钙0.55克，加水定容至500mL，调节ph值至6.3±0.1)，研磨均匀后用氯化钙溶液定容至100mL，摇匀，本溶液现用现配；
标准品溶液的制备：精密称取12毫克凝乳酶标准品，滴入几滴pH＝6.3磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8克，磷酸二氢钠2.7克，加水溶解定容至1000mL，调节ph值为6.3±0.5)，润湿研磨后加入缓冲液定容至10mL，即得到每1mL约含1.06个活力单位(约在240秒内凝结)的标准品溶液，温度4℃保存，在配置2小时后使用；
样品溶液的制备：将实施例1-2所得提取物分别精密称取10毫克，照标准品溶液制备方法配置5mL，既浓度为2mg/mL的样品溶液；
样品测定：精密量取底物溶液10mL，置于试管中，在温度30℃(±0.5℃)恒温水浴中温预10分钟，精密加入标准品溶液1mL，摇匀并立即计时，用玻璃棒不蘸取溶液沿管壁留下，使成均匀薄层，当薄层出现片状凝结时，截止计时，记录下时间，重复测定3次，3次测定值得相对标准偏差不得大于5％，取3次的平均值作为标准品溶液的凝结时间，取样品溶液1mL，分别按上述方法操作，按下式计算：
每1mg含凝乳酶活力单位数
式中S为标准品的活力，Ru/mg；
TS为标准品溶液的平均凝结时间，秒；
T为样品溶液的平均凝结时间，秒；
WS为标准品溶液每1mL中含凝乳酶标准品的量，g；
W为样品取样量，g；
N为样品稀释倍数。
实验结果：
实施例1所述方法凝乳酶活性为26916Ru/g，实施例2(对照)所述方法凝乳酶活性为25361Ru/g，实施例1所述方法凝乳酶活性没有减少。
实施例5
胃蛋白酶活力的测定：
按照药典方法，对实施例1、实施例2(对照)所得羔羊第四胃有效成分提取物进行胃蛋白酶活力测定。
对照品溶液的制备：精密称取酪氨酸(经温度105℃±0.5℃干燥，至恒重)50毫克，加盐酸溶液(取1mol/L盐酸溶液65mL，加水至1000mL)定容至100mL；
样品的制备：分别取实施例1-2所得羔羊第四胃有效成分提取物，精密称定，用盐酸溶液制成每1mL中含有2毫克样品的溶液；
测定法：每一个提取物样品均做3次平行，按下列方法测定。取3支试管各加入对照品溶液1mL，另取3支各精密加入样品溶液1mL，置温度37℃(±0.5℃)水浴中，保温5分钟，精密加入预热至温度37℃(±0.5℃)的血红蛋白试液5mL，摇匀，在温度37℃(±0.5℃)水浴锅中反应10分钟，立即加入浓度为5％三氯醋酸溶液5mL，摇匀，过滤，滤液备用；另取试管2支，各加入血红蛋白试液5mL，置温度37℃(±0.5℃)水浴中保温10分钟，再加入浓度为5％三氯醋酸溶液5mL，其中1支加样品溶液1mL，摇匀过滤，滤液备用，作为样品对照；另1支加上述盐酸溶液1mL，摇匀，过滤，滤液备用，作为对照品的空白对照，用紫外-可见分光光度计在275nm波长处测定吸光度，算出平均值AS和A，按下式计算胃蛋白酶活力(u/g)。
试中AS为对照品的平均吸光度；
A为样品的平均吸光度；
WS为每1mL对照品溶液中含酪氨酸的量，μg；
W为样品取样量，g；
n为样品稀释倍数。
实验结果：
实施例1所述方法胃蛋白酶活性为3685.2u/g，实施例2(对照)所述方法胃蛋白酶活性为3521.6u/g，两种提取方法胃蛋白酶活性相当。
实施例6
利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对实施例1、实施例2(对照)所得羔羊第四胃有效成分提取物蛋白质种类进行确定：
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合缓冲液(0.5moL/L pH＝6.8)、2mL的10％十二烷基硫酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：精密称取样品3毫克溶于1mL蒸馏水中，摇匀，与样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10分钟，10000转/分，离心5分钟；
电极缓冲液：将15.1克三羟甲基氨基甲烷、94克甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸钠溶解并定容至4L；
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液：30％(W/V)超纯级丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N-亚甲双丙烯酰胺；
12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的分离胶配制：3.3mL的H2O、4mL的30％(V/V)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液、2.5mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合缓冲液(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.1mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.006mL的四甲基乙二胺；
5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的积层胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液、0.13mL三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合缓冲液(0.5moL/L pH＝6.8)、0.01mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的四甲基乙二胺；
电泳条件：恒压75伏，40分钟，然后恒压150伏，90分钟；
考马斯亮蓝固定液：25％异丙醇、10％的冰醋酸、65％水；
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤，棕色瓶储存；
考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；
电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2小时，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2小时，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止。
实验结果：
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图中实施例1及实施例2(对照)中含有多种活性蛋白，其中凝乳酶及胃蛋白酶条带清晰。