包含混合草药提取物作为有效成分的用于预防和治疗男性不育症的组合物及其用途的制作方法

本发明涉及包含混合草药提取物的用于治疗和预防男性不育症的组合物，具体而言涉及包含巴戟天(Morinda Officinalis)根、菟丝子(Cuscuta)种子以及洋葱(Allium cepa)鳞茎(bulb)的混合草药提取物的用于预防和治疗男性不育症的组合物及其用途。

背景技术：

[文献1]Agarwal A,Deepinder F,Cocuzza M,Agarwal R,Short RA,Sabanegh E等(2007)Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters:new meta-analytical approach.Urology 70,532-538.

[文献2]Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A&Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility.Urology 73,461-469.

[文献3]Cheng D,Zheng XM,Li SW,Yang ZW&Hu LQ.(2006)Effects of epidermal growth factor on sperm content and motility of rats with surgically induced varicoceles.Asian J Androl 8,713-717.

[文献4]Ding H,Tian JQ,Du W,Zhang LY,Wang HZ&Wang ZP.(2012)Open non-microsurgical,laparoscopic or open microsurgical varicocelectomy for male infertility:a meta-analysis of randomized controlled trials.BJU Int 110,1536-1542.

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[文献6]Ficarra V,Cerruto MA,Liguori G,Mazzoni G,Minucci S,Tracia A等(2006)Treatment of varicocele in subfertile men:the Cochrane reviewa contrary opinion.Eur Urol 49,258-263.

[文献7]Fisch H&Hyun G.(2012)Varicocele repair for low testosterone.Curr Opin Urol 22,495-498.

[文献8]Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937.

[文献9]Mehta A&Goldstein M.(2012)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60.

[文献10]Mehta A &Goldstein M.(2013)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60.

[文献11]Sharma R,Agarwal A,Mohanty G,Hamada AJ,Gopalan B,Willard B等(2013)Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress.Reprod Biol Endocrinol 11,48.

[文献12]Tanriverdi O,Miroglu C,Horasanli K,Altay B,Caliskan KC&Gumus E.(2006)Testicular blood flow measurements and mean resistive index values after microsurgical and high ligation varicocelectomy.Urology 67,1262-1265.

[文献13]Mark sigman,Stacy Glass,Janice Campagnone,John L.Reyor,Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial,Fertility and Sterility Vol 85,No 5,2006.

技术实现要素：

技术问题

本发明涉及包含混合草药提取物的用于治疗和预防男性不育症的组合物，具体而言涉及包含巴戟天根、菟丝子种子以及洋葱鳞茎的混合草药提取物作为有效成分的用于预防和治疗男性不育症的组合物。

已经存在报道称，男性因素不育症的最可能得到治疗的起因精索静脉曲张(varicocele)是以精索内蔓状丛的静脉的弯折和扩张为特征。精索静脉曲张的患病率在患有原发性不育的男性中为19％-41％，而在患有继发性不育的男性中为高于80％(Agarwal A,Deppinder F,Cocuzza M,Agarwal R,Short RA,Sabanegh E等(2007)Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters:new meta-analytical approach.Urology 70,pp532-538；Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A &Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility,Urology 73,pp461-469)。用于治疗由精索静脉曲张引起的男性不育症的最常实施的外科手术是自多年前开始实施的曲张精索静脉切除术，其包括非显微外科手术方法、腹腔镜或显微外科曲张精索静脉切除术(Mehta A及Goldstein M.(2012)Microsurgical varicocelectomy：a review.Asian J.Androl.，15，56-60页)。就不育症男性患者的精索静脉曲张进行的手术矫正而言，尽管在进行曲张精索静脉切除术的患者中有50％-80％显示出改善的参数(妊娠率31％-74％)(Cheng D,Zheng XM,Li SW,Yang ZW&Hu LQ.(2006)Effects of epidermal growth factor on sperm content and motility of rats with surgically induced varicoceles.Asian J Androl 8,713-717；Ding H,Tian JQ,Du W,Zhang LY,Wang HZ&Wang ZP.(2012)Open non-microsurgical,laparoscopic or open microsurgical varicocelectomy for male infertility:a meta-analysis of randomized controlled trials.BJU Int 110,1536-1542；Fisch H&Hyun G.(2012)Varicocele repair for low testosterone.Curr Opin Urol 22,495-498；Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937；Mehta A&Goldstein M.(2013)Microsurgical varicocelectomy:a review.Asian J Androl 15,56-60；Tanriverdi O,Miroglu C,Horasanli K,Altay B,Caliskan KC&Gumus E.(2006)Testicular blood flow measurements and mean resistive index values after microsurgical and high ligation varicocelectomy.Urology 67,1262-1265)，然而，一些报道认为，由于在不育症术后显示出高的妊娠失败率，因此精索静脉曲张修复对于男性而言似乎并非有效的治疗(Evers JL&Collins JA.(2003)Assessment of efficacy of varicocele repair for male subfertility:a systematic review.The Lancet 361,1849-1852；Ficarra V,Cerruto MA,Liguori G,Mazzoni G,Minucci S,Tracia A等(2006)Treatment of varicocele in subfertile men:the Cochrane review a contrary opinion.Eur Urol 49,258-263)。尽管精索静脉曲张患者的睾丸功能受损导致不育的确切机制目前为止尚未完全阐明，然而已经提出了一些假设的机制来对各种精索静脉曲张相关的睾丸机能障碍进行研究，这些障碍包括睾丸中的血流变化、阴囊温度升高、异常激素值、活性氧(ROS)过多等(Agarwal A,Sharma RK,Desai NR,Prabakaran S,Tavares A &Sabanegh E.(2009)Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility.Urology 73,461-469；Fretz PC&Sandlow JI.(2002)Varicocele:current concepts in pathophysiology,diagnosis,and treatment.Urol Clin North Am 29,921-937)。

作为重要的生理性细胞内过程的调节剂，ROS(活性氧物质)是由氧代谢和能量产生过程再生的副产物之一。少量ROS在对男性生殖道中精子功能的控制中起重要作用。在异常条件下，随着ROS水平增加或抗氧化能力降低发生氧化应激。具体而言，氧化应激引起精子中表达的蛋白质水平改变，导致分子和基因产生缺陷(Sharma R,Agarwal A,Mohanty G,Hamada AJ,Gopalan B,Willard B等(2013)Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress.Reprod Biol Endocrinol 11,48)。

正常地，健康夫妇的妊娠率在性关系后第一个月达到20％-25％，半年时达到75％，并在一年时达到85％-90％。在临床上，在将性关系后一年内妊娠失败的情况定义为“不育”的条件下，认为韩国已婚夫妇中不育患者比例为约13％-20％(约1,400,000对夫妇)。其中，35％-50％的不育是由男性健康问题引起的，并且约30％的问题是由精子活力降低造成的。男性不育是门诊患者的重要和严重疾病之一，占泌尿科医院门诊患者人数的4％。

近来，由于生殖生物学或ART(辅助生殖技术)的进步，已经开发了诸如IVF(体外受精)、显微操作技术等各种ART。然而，这些技术也有着一些缺点和问题，例如，仅有20％至40％的低妊娠率、需要过多费用、由于抱怨疼痛而难以应用于女性、发生并发症等。体外受精则可能引发遗传问题，并主要限于对自然妊娠的关注。

尽管不育症的治疗已得到发展，然而迄今为止尚未开发治疗男性不育症和提高精子活力的有效治疗剂，并且几乎没有关于可提高妊娠率的药物的研究。作为对精子活力低的男性的精液参数进行改善的现有方法之一，除内科和外科方法之外，已经开发出L-肉碱作为治疗剂，然而据报道该药物几乎未显示出明显功效(Mark sigman,Stacy Glass,Janice Campagnone,John L.Reyor,Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial,Fertility and Sterility Vol 85,No 5,2006)。

巴戟天根：据报道，属于茜草科(Rubiaceae)并分布于中国南方地区的巴戟天的根含有维生素C、糖等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp 927-928,1998)。

菟丝子种子：据报道，属于旋花科(Convolvulaceae)的日本菟丝子(Cuscuta japonica)等的种子含有树脂糖苷、糖、维生素A、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、teraxanthin、叶黄素等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp882-883,1998)。

洋葱鳞茎：据报道，属于百合科(Liliaceae)并源于西伯利亚或阿尔泰的洋葱的鳞茎含有硫醇、二甲基二硫化物、二烯丙基二硫化物、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等(B.S.Chung等,YoungRim Press,第二版,DohaeHyangYakDaeSaJeon.,pp155-156,1998)。

然而，任何上述引用文献中均未报道或公开包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物对于男性不育症具有治疗效果，通过引用的方式将上述文献的公开内容并入本文。

因此，本发明人经过不懈努力，发现了用于治疗和预防男性不育症的有效草药制剂，该包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药组合物对人类不育症显示出有效的治疗效果，该效果通过多种实验得以证实，例如体外精子质量促进效果评价以及体内精索静脉曲张动物模型评价方法，该方法用于对草药提取物对体内精索静脉曲张动物模型中精子计数和活力变化的影响进行研究。最后，本发明人发现，上述混合草药提取物在治疗和预防男性不育症中是有效的。

技术方案

本发明的课题在于开发通过提高精子活力来提高妊娠率、最终恢复先前的高妊娠率的新方法。通过本发明，有助于提高不育夫妇的妊娠率并有助于开发国家政策中针对出生率回复和高龄化社会的应对体系、可开发新型天然药物并创造新的附加值、可复兴工业并提高国家利益。

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于预防和治疗男性不育症的药物组合物，所述药物组合物包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防和改善男性不育症的保健功能性食品，所述保健功能性食品包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为活性成分。

在本发明中，本文公开的“提取物”包括混合草药提取物，优选巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎基于每种草药的干重的混合比例(w/w)为0.01-100:0.01-1:1-100(w/w)，更优选为0.1-50:0.1-1:1-50(w/w)，进一步更优选为1-30:1:1-30(w/w)。

具体而言，本文公开的术语“提取物”包括可溶于水、C₁-C₄醇或它们的混合物的提取物，优选可溶于水或水与乙醇的混合物的提取物，更优选可溶于水与乙醇的混合物的提取物。

具体而言，本文公开的术语“男性不育症”包括所有的男性不育症，例如但不限于由诸如顺铂、长春碱(vinblastin)、博来霉素等抗癌剂的不良反应引起的男性不育症；无精子症(精子计数无)、少精子症(精子计数≤2×10⁷/ml)、弱精子症(高活力精子比例≤40％)、畸形精子症(正常精子比例≤40％)等与精子相关的不育症(参见Korean Society for sexual medicine and andrology,Textbook of andrology,2010)。

下文对本发明进行详细说明。可根据以下常规提取方法得到单一草药提取物和混合草药提取物。

例如，本发明还提供了一种制备本发明的草药提取物的方法，所述方法包括以下步骤：在第1步骤，分别对干燥的巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎进行洗涤，并向其添加1至20倍(w/v)、优选1至10倍(w/v)体积的水、诸如甲醇、乙醇等醇或它们的混合物，优选水、乙醇或它们的混合物；在第2步骤，通过以下提取方法对各溶液进行提取：在50℃～120℃、优选约80℃～100℃的温度下，用热水、冷水或超声波提取(优选热水提取)1至5小时、优选2至4小时；在第3步骤，重复上述提取过程来过滤收集各滤液，通过冷冻干燥、自然空气干燥或热空气干燥工序(优选冷冻干燥工序)进行干燥，分别获得巴戟天根、菟丝子种子或洋葱鳞茎的干燥提取物；以及在第4步骤，基于每种草药的干重，以巴戟天根:菟丝子种子:洋葱鳞茎的混合比例(w/w)为0.01-100:0.01-1:1-100(w/w)、优选0.1-50:0.1-1:1-50(w/w)、更优选1-30:1:1-30(w/w)混合每种草药的干燥提取物，从而制备本发明的混合草药提取物。

本发明的另一目的是提供一种用于预防和治疗男性不育症的药物组合物或保健功能性食品，其包含通过上述方法获得的上述巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的草药提取物作为活性成分。

本发明的巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的草药提取物对人类不育症显示出有效的治疗效果，这通过多种实验得以证实，例如体外精子质量促进效果评价以及体内精索静脉曲张动物模型评价方法，该方法用于对草药提取物对体内精索静脉曲张动物模型中精子计数和活力变化的影响进行研究，已经证实本发明的混合提取物对精子计数和精子活力显示出更有效的提升作用。因此，本发明的草药提取物可以有效地用于预防和治疗男性不育症的药物组合物、保健功能性食品和保健补充食品中。

本发明的用于治疗目标疾病的药物组合物可以基于组合物的总重量包含约0.01w/w％至99w/w％的上述本发明的草药提取物。

然而，上述组合物的量和每种组分可随患者的状况、患者疾病的发展、疾病的种类等而变化。

本发明的含有提取物的组合物可以根据使用方法而另外包含常规的载体、佐剂或稀释剂。

可将本发明所述的草药组合物配制为口服剂型，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等；局部制剂；或者注射溶液剂。本发明所述的草药组合物可以作为含有药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物提供，所述载体、佐剂或稀释剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可另外包含赋形剂，如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、稀释剂等。固体口服剂型包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等；所述固体口服剂型通过将至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等)添加至所述草药提取物来制备。可以使用诸如硬脂酸镁或滑石等的润滑剂。水性口服剂型包括混悬剂、口服溶液剂、乳剂、糖浆剂；所述水性口服剂型可包含数种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂、以及水、液体石蜡。胃肠外剂型包括无菌水溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。载体的合适实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射的酯(如油酸乙酯)。栓剂基质可包括witepsol、macrogol、吐温61、可可脂、月桂精(laurin)、甘油明胶等，但并不限于此。

本发明组合物的期望剂量根据受试者的状况和体重、疾病严重程度、药物形式、给药途径和周期而变化，并可以由本领域技术人员进行选择。然而，为了获得期望的效果，通常推荐以如下剂量的量给予本发明的组合物：0.01mg/kg重量/天至10g/kg重量/天、优选1mg/kg重量/天至1g/kg重量/天。所述剂量可以每天以单次剂量或多次剂量给予。因此，上述剂量并不以任何方式限制本发明的范围。

可以通过各种途径向诸如哺乳动物的受试动物(大鼠、小鼠、家养动物或人)给予本发明的药物组合物。所有给药模式均在预期之内，例如，可以口服给药、直肠给药或通过静脉内注射进行给药。

本发明的又一目的在于提供一种用于预防和治疗男性不育症的精子活力改善剂，其包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为活性成分。所述精子活力改善剂可以提高体外受精的受精率。另外，可将本发明的包含所述提取物的男性不育症治疗剂用作女性用阴道用药剂、阴道栓剂以及阴道用插入剂，用于增强精子活力。另一方面，本发明提供了一种用于在体外受精时提高受精率的、用于体外受精中的精子保存的添加剂，所述添加剂包含上述提取物。

本发明的又一目的在于提供一种治疗方法，所述方法包括向需要治疗或预防男性不育症的受试者给予包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物的组合物。

本发明的又一目的在于提供巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为活性成分在制造用于预防和治疗人或哺乳动物中雄性不育症的药物中的用途。

根据本发明的一方面，提供了一种用于预防或改善男性不育症的保健功能性食品，所述保健功能性食品包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为活性成分。

本文所定义的术语“保健功能性食品”包括通过将本发明的提取物添加至常规食品中以对人或哺乳动物的目标疾病进行预防或改善，具有增强的功能性(如物理功能或生理功能)，并且符合韩国保健功能性食品法6727条(the Law for Health Functional Foods 6727in Republic of Korea)规定的功能性食品。

用于预防和改善目标疾病的保健功能性食品组合物可基于组合物的总重量包含约0.01w/w％至95w/w％、优选1w/w％至80w/w％的上述本发明的草药组合物。

此外，还可将本发明的提取物用作制备用于预防或改善男性不育症、或改善睾丸功能的各种保健功能性食品和保健补充食品的主要成分或添加剂和助剂(aiding agent)。

本发明的用于预防或改善男性不育症的保健功能性食品可以制备和加工为药学上可接受的剂型(如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂等)或保健功能性食品形式(如茶袋、浸出茶(leached tea)、保健饮料等)。

本发明的又一目的在于提供一种用于预防或改善男性不育症的保健补充食品，所述保健补充食品包含巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物作为主要成分。

上述术语“作为主要成分”是指上述保健补充食品基于组合物的总重量包含约30w/w％至99w/w％、优选50w/w％至99w/w％、更优选70w/w％至99w/w％的本发明提取物(活性成分)。

当将本发明的混合草药提取物用作保健功能性饮料组合物中的组分时，不受限制地，类似于典型的饮料组合物，所述保健功能性饮料组合物可包含其它组分，如调味剂或天然碳水化合物。天然碳水化合物的实例包括单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如，诸如糊精、环糊精等糖以及诸如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。可在所述保健功能性饮料组合物中添加天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(莱鲍迪苷A、甘草甜素等))和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的量通常为在每100ml本发明组合物中添加约1g至20g、优选约5g至12g。

当将本发明的混合草药提取物用作用于预防或改善目标疾病的保健食品的食品添加剂时，所述混合草药提取物可以原样添加或根据通常方法与其它食品组分共同使用。所述食品的实例包括肉制品、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、薄脆饼(cracker)、饼干(biscuit)、比萨饼、拉面、面条制品、口香糖、诸如冰淇淋等乳制品、汤、饮料、茶、饮品、酒精饮品、维生素复合物等，但在本文中并不限于此。

除上述组成之外的其它组分为各种营养素、维生素、矿物质或电解质、诸如天然调味剂和合成调味剂等调味剂、着色剂和改良剂(在干酪、巧克力等的情况下)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体粘合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳化剂等。除上述组分之外的其它组分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁。其中，上述组分可以单独使用或组合使用。上述组分的比例并非特别重要，但是通常范围为每100w/w％本发明组合物中约0w/w％至20w/w％。

另外，可将上述提取物添加至食品或饮料以用于对目标疾病进行预防和改善。作为保健功能性食品或保健补充食品的食品或饮料中的上述提取物的量通常可以是用于保健功能性食品组合物的食品总重量的约0.01w/w％至15w/w％。并且，本发明的提取物可在每100ml保健饮料组合物中添加0.02g至5g、优选0.3g至1g。

有益效果

如本发明所述，本发明的混合草药组合物对人类不育症显示出有效的治疗效果，这通过多种实验得以证实，例如体外精子质量促进效果评价以及体内精索静脉曲张动物模型评价方法，该方法用于对草药提取物对体内精索静脉曲张动物模型中精子计数和活力变化的影响进行研究，已经证实本发明的混合提取物对精子计数和精子活力显示出更有效的提升作用。因此，本发明的草药提取物可以有效地用于预防和治疗男性不育症的药物组合物、保健功能性食品和保健补充食品中。

附图说明

图1示出了测试样品(巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药提取物)对人精液中的人精子计数和人精子活力的改善效果(在测试前，对CINTM1(10:1:10)、CINTM1(5:1:5)和CINTM1(1:1:1)的每一测试样品进行了初步测试)。

图2示出了对于每种草药的提取物和混合草药提取物，测试样品对人精液中的人精子计数和人精子活力的改善效果(CINThera-1：巴戟天根提取物；CINThera-2：菟丝子种子提取物；CINThera-3：洋葱鳞茎提取物；10:1:10表示以巴戟天根:菟丝子种子:洋葱鳞茎＝10:1:10进行混合)。

图3示出了测试样品对诱导精索静脉曲张的动物组中的精子计数的改善效果(CTR：对照组，OP：手术组)。

图4显示了测试样品对诱导精索静脉曲张的动物组中的精子活力的改善效果(CTR：对照组，OP：手术组)。

具体实施方式

通过以下实施例和试验例更具体地解释本发明。

实施例

以下实施例和试验例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。

实施例1各组分(单一草药提取物)的制备

(1)巴戟天根提取物(CINThera-1)

将3,000g购自位于首尔的庆东市场的干燥巴戟天根(Dukhyundang Pharmacy)洗涤并添加至6L的95％乙醇中，用超声提取90分钟进行3次提取。用滤纸对残余物进行过滤，得到提取物，并将过滤的提取物在真空下浓缩。用冷冻干燥器(ScanVac，Labogene)对浓缩的提取物进行干燥，得到139.4g(产率：4.6％)巴戟天根提取物粉末，在4℃下储存。

在用于后续实验之前，将干燥提取物溶于生理盐水溶液中并在室温下剧烈搅拌2分钟。

(2)菟丝子种子提取物(CINThera-2)

将5.2kg购自位于首尔的庆东市场的干燥菟丝子种子(Backjangsaeng Pharmacy)洗涤、粉碎并添加至5L的95％乙醇中，用超声提取90分钟进行2次提取。用滤纸对残余物进行过滤，得到提取物，并将过滤的提取物在真空下浓缩。用冷冻干燥器(ScanVac，Labogene)对浓缩的提取物进行干燥，得到264.3g(产率：4.36％)菟丝子种子提取物粉末，在4℃下储存。

在用于后续实验之前，将干燥提取物溶于生理盐水溶液中并在室温下剧烈搅拌2分钟。

(3)洋葱鳞茎提取物(CINThera-3)

将1,000g购自位于庆尚南道(韩国)的昌宁市场的洋葱鳞茎(Backjangsaeng Pharmacy)洗涤、干燥并添加至5L的70％乙醇中，在70℃下通过回流提取2小时进行提取。用滤纸对残余物进行过滤，得到提取物，并将过滤的提取物在真空下浓缩。用冷冻干燥器(ScanVac，Labogene)对浓缩的提取物进行干燥，得到13.8g(产率：1.38％)洋葱鳞茎提取物粉末，在4℃下储存。

在用于后续实验之前，将干燥提取物溶于生理盐水溶液中并在室温下剧烈搅拌2分钟。

实施例2混合草药提取物的制备(CINThera-1:CINThera-2:CINThera-3＝10:1:10)

分别称量实施例1中制备的干燥巴戟天根提取物(CINThera-1)10mg、菟丝子种子提取物(CINThera-2)1mg和洋葱鳞茎提取物(CINThera-3)10mg，使用混合器(Vortex genie-2，scientific industries，USA)充分混合，获得混合草药提取物21mg，并在以下实验中用作测试样品。同样制备5:1:5和1:1:1的测试样品。

(以下称为“CINTM1”)

试验例1.体外精子活力促进效果评价

为了对上述实施例中获得的本发明提取物对人精子的精子计数和精子活力的影响进行研究，根据文献公开的体外精子活力促进效果评价方法(Martin Blomberg Jensen,Poul J.Bjerrum,Torben E.Jessen,John E.Nielsen,Ulla N.Joensen等(2011)Vitamin D is positively associated with sperm motility and increases intracellular calcium in human spermatozoa.Human Reproduction,Vol.26,No.6pp.1307-1317)进行了以下体外实验。

1-1.实验程序

对来自患有不育症的就诊志愿患者(韩国全北国立大学医院泌尿科分部，20至50岁，约85名患者)的人精液的精子计数和精子活力进行测定后，将精液倒入保持在37℃的培养箱中。精液充分液化后，向200μL精液中添加20μL测试样品提取物，直至终浓度为2mg/ml。加入3小时后，使用计数室(MAKLER计数室，self-Medical Instruments、Haifa、Israel)和显微镜(Axiovert25，ZEISS，USA)对精子活力进行测定。

作为对照组，使用3H缓冲液{Hams F-10(N6635，Sigma chemical Co.，USA)+0.4％HAS(A1635，Sigma Chemical Co.，USA)+12mM HEPES(H4034，Sigma Chemical Co.，USA)[3H，pH 7.4]。将测试样品溶解在与上述相同的3H缓冲液中，调节至pH 7.4，并通过离心装置(A32010(1)，LABOGENE，13,000rpm，2分钟，4℃)离心，得到上清液用于测定。

根据以下经验公式1计算精子活力。

[经验公式1]

1-2.实验结果

为了确定巴戟天根、菟丝子种子以及洋葱鳞茎的混合天然提取物的比例，对于由上述患有不育症的就诊志愿者获得的精液进行测定的结果，在分别使用三种本发明组合(CINTM1(10:1:10)、CINTM1(5:1:5)和CINTM1(1:1:1))处理的组中，分别在组CINTM1(10:1:10)：浓度为0.05mg/ml时为70％；组CINTM1(5:1:5)：浓度为0.5mg/ml时为62％；组CINTM1(1:1:1)：浓度为0.005mg/ml时为63％的情况下显示出最高的精子活力增加值。在测试样品组中，与不同混合比的其它组相比，组CINTM1(10:1:10)显示出最高的精子活力增加效力(参见图1)。

对于由上述患有不育症的就诊志愿者获得的精液进行测定的结果，在分别使用CINThera-1、CINThera-2、CINThera-3和CINTM1(10:1:10)处理的试验组中，在0.05mg/ml的同一浓度下分别显示出55％、53.5％、48.0％以及59.5％的最高的精子活力增加值。在测试样品组中，与其它单独的天然提取物组相比，混合天然提取物组CINTM1(10:1:10)显示出最高的精子活力增加效力(参见图2)。

试验例2.使用体内精索静脉曲张动物模型对混合草药提取物的效果进行评价

为了对上述实施例中获得的本发明提取物在体内精索静脉曲张动物模型中对人精子的精子计数和精子活力的影响进行研究，根据文献中记载的体内精索静脉曲张动物模型评价方法(Zhang LT,Kim HK,Choi BR,Zhao C,Lee SW,Jang KY等(2014)Analysis of testicular-internal spermatic vein variation and the recreation of varicocoele in a Sprague-Dawley rat model.Andrology.2,466-73)进行了以下体内试验。

2-1.体内精索静脉曲张动物模型的建立

为了建立体内精索静脉曲张动物模型，获取购自KOATECH.Ltd(位于韩国平泽市)的重量为300至350g的9周龄Sprague-Dawley大鼠，经一周时间适应环境后，饲养于塑料笼中，每笼四只大鼠。在饲养场所中，将人工照明调节为在早7时至晚7时的12小时内进行，室内温度维持在18至23℃，相对湿度维持在40至60％。供给标准大鼠饲料并允许自由饮水。使用氯胺酮+赛拉嗪(50mg/kg+25mg/kg)的混合物对每只大鼠进行腹膜内麻醉，沿中线切开腹部，并经切口接近左肾后暴露出与腔静脉相连的左肾静脉。以具有平行金属探针(外径：0.85mm)的5.0尼龙缝合线结扎左肾静脉，随后取出金属探针，使得左肾静脉在结扎点处直径减小50％，并且血管持续收缩。结扎ISV(精索内静脉)枝以诱导精索静脉曲张，用作诱导精索静脉曲张的动物组，并且在结扎后四周，口服给予溶解于生理盐水溶液中的测试样品。

2-2.体内精索静脉曲张动物模型中的混合天然提取物的效力评价

对于将左肾静脉部分结扎以诱导精索静脉曲张的精索静脉曲张手术组以及正常对照组，在手术后28日(对照组为在安定后28日)内，每日口服给予测试样品(CINTM1(10:1:10))或生理盐水溶液2ml(正常对照组：生理盐水2ml/天、混合草药提取物100mg/kg/2ml/天、混合草药提取物200mg/kg/2ml/天；精索静脉曲张手术组：生理盐水2ml/天、混合草药提取物100mg/kg/2ml/天、混合草药提取物200mg/kg/2ml/天)，然后称量大鼠体重。在全身麻醉下切除大鼠的输精管，对其中的精子计数和活力进行测定，并对双侧睾丸和附睾的重量进行称重以进行比较。

2-3.实验结果

作为给药后28日时精子计数的测定结果，观察到诱导精索静脉曲张的组中，给予混合天然提取物的组获得的精液中精子计数有所增加。在诱导精索静脉曲张的组中，给予生理盐水的组中，获得的精液中的精子计数仅为18.25±9.53×10⁶/ml，而100mg/kg/2ml/天以及200mg/kg/2ml/天的混合天然提取物的组中，观察到精子计数分别为20.91±12.25×10⁶/ml和28.63±8.90×10⁶/ml，产生了大幅增加(参见图3)。

作为给药后28日时精子活力的测定结果，观察到诱导精索静脉曲张的组中，给予混合天然提取物的组获得的精液中精子活力有所增加。在诱导精索静脉曲张的组中，给予生理盐水的组中，获得的精液中的精子活力仅为31.3±18.8％，而100mg/kg/2ml/天以及200mg/kg/2ml/天的混合天然提取物的组中，确认精子活力分别为53.8±20.7％和53.3±12.1％，精子活力强化效果优异(参见图4)。

在下文中，将对包含本发明的提取物和多种赋形剂的组合物的制剂例进行描述，然而以下内容仅为进行具体描述，并非旨在限制本发明。

制剂例1.散剂的制备

混合草药提取物(CINTM1) 20mg

乳糖 100mg

滑石 10mg

将上述组分混合后，通过填充密封包装制备散剂。

制剂例2.片剂的制备

将上述组分混合后，通过常规片剂制造方法制备片剂。

制剂例3.胶囊剂的制备

将上述组分混合后，通过常规胶囊剂制备方法填充明胶胶囊制备胶囊剂。

制剂例4.注射剂的制备

通过常规注射剂制备方法，溶解上述成分并以每安瓿(2ml)中填入如上所述含量的全部组分来制备注射剂。

制剂例5.液体剂的制备

通过常规液体剂制备方法，向蒸馏水中添加各活性组分并溶解，加入适量柠檬香料后，将上述成分混合后添加蒸馏水，然后将所有组分添加蒸馏水调节至100ml后，填充至棕色瓶中并灭菌，从而制备液体剂。

制剂例6.保健食品的制备

尽管上述维生素和矿物质的混合物的组成比是按照比较适合于保健食品的成分的优选实施例混合组成的，然而也可任意改变其配合比例来实施。根据常规的保健食品的制备方法，可将上述成分混合后，制造颗粒，并依照常规方法将其用于制备保健食品组合物。

制剂例7.保健饮料的制备

通过常规保健饮料的制备方法，通过将上述成分混合后，在85℃下搅拌加热1小时，随后将所得溶液过滤并灭菌，填充于2L容器中，密封灭菌后冷藏保管，从而制备本发明的保健饮料组合物。

尽管上述组成比是按照比较适合于嗜好饮料的成分的优选实施例混合组成的，然而也可根据所需水平、所需国家、所需用途等地域、民族偏好而任意改变其配合比例来实施。

工业实用性

如本发明所述，本发明的巴戟天根、菟丝子种子和洋葱鳞茎的混合草药组合物对人类不育症显示出有效的治疗效果，这通过多种实验得以证实，例如体外精子质量促进效果评价以及体内精索静脉曲张动物模型评价方法，该方法用于对草药提取物对体内精索静脉曲张动物模型中精子计数和活力变化的影响进行研究，已经证实本发明的混合提取物对精子计数和精子活力显示出更有效的提升作用。因此，本发明的草药提取物可以有效地用于预防和治疗男性不育症的药物组合物、保健功能性食品和保健补充食品中。