一种用于预防/治疗脑损伤的含有黄芪萃取物的组合物及其制备方法与流程

本非临时申请案依据美国专利法35U.S.C.§119(a)主张优先权，主张美国专利申请号No(s).[61/977,322]，申请日为[4月9日,2014年]，本案所有的专利内容与优先权的参考专利内容相附合。

技术领域

本发明提供一种黄芪多糖萃取物用于脑损伤与脑中风预防、治疗及预后的用途。脑损伤包含创伤性脑损伤和后天性脑损伤。脑中风包含缺血性脑中风或出血性脑中风。

背景技术：

脑部为人类身体最重要的部分之一，并同样为各种认知、情感以及活动的中心，然而不论外力或非外力对脑部所造成的伤害，通常都将带给人类脑部重大的影响或难以恢复的伤害。

脑损伤的发生是由于一个非常广泛的条件下，如:疾病、伤害、或应为一广泛的脑损伤医源性疾病可能的原因，其包括出生缺氧、长时间缺氧(氧气不足)、致畸胎物(teratogens)的毒害(包括酒精)、感染和神经疾病。化学治疗可导致脑损伤对其神经干细胞和和突胶质细胞，使其产生髓磷脂。造成局部病灶脑损伤的常见原因是物理创伤，例如：创伤性脑损伤、中风、动脉瘤、手术、其他神经疾病，以及重金属中毒包括汞和铅及其化合物。

脑损伤(BI)是脑细胞被破坏或退化，脑损伤可分为非外力和外力因素所造成，绝大部分创伤性脑损伤(TBI)是从外部物理所造成的头部损伤，而后天性脑损伤(ABI)是指由疾病或出生后因疾病产生造成的脑损伤。

中风，也被称为脑血管意外(CVA)，脑血管损伤(CVI)，或脑中风，是指由于脑部供血受阻而使得脑细胞死亡。中风分为两种类型：一种是由血栓或栓塞所造成的缺血(缺乏血液供应)，称为缺血性脑中风；一种是由出血所造成的，称为出血性脑中风。约87％的中风是缺血性脑中风，其余属于出血性脑中风。有些脑内出血的病患会并发缺血性中风，此状况被称为“出血性转化”，然而目前尚无法厘清有多少出血性中风为缺血性中风所造成。中风导致大脑失去部分正常功能，其症状包括肢体一侧麻木偏瘫、理解力丧失、讲话困难、晕眩、或视野缺损等等，而这些急性症状通常于短时间内可察觉，如果症状持续不到一两个小时，它被称为一个短暂性脑缺血发作(TIA)。出血性中风也与造成剧烈头痛有关。中风的症状可能是永久性的，长期并发症可包括肺部疾病或丧失控制膀胱的能力。

中风的预后可以单独或合并地影响人的生理、精神、情感层面。且依据中风病灶的大小和位置不同所造成的后遗症具有很大差异，而其失能区对应到已被损坏的脑部区域。

中风所造成的生理失能包括肌肉无力、麻木、压疮(褥疮)、肺炎、尿失禁、失用症(大脑认知障碍，无法执行先前所学过的技巧)、处理日常行为具有困难、食欲减退、言语丧失、视力减退和疼痛，如果中风严重的话或发生在特定的位置(如部分脑干)，将会导致昏迷或死亡。

脑出血是属于颅内出血的一种亚型，其出血位置好发于脑组织。颅内出血(ICH)是由脑损伤引起的，或由自发性脑出血中风所导致。非创伤性颅内出血是一种脑部自发出血并进入脑组织，其发生与异常脑压(如:张力或压力)的增加有关。ICH占所有中风入院治疗的10-30％，并导致重大的残疾、发病率和30-50％的6个月死亡率，其长期预后不佳，只有20％的患者于6个月后能重新恢复日常生活功能独立。虽然目前对动脉瘤的蜘蛛网膜下腔出血和脑梗塞的治疗已经有进展，但脑出血治疗方式仍然有限。根据脑内出血的原因，脑出血可区分为原发性或继发性。原发性脑出血是由慢性高血压或淀粉样变性血管病损坏小动脉或小动脉自发破裂发起，继发性脑出血是由外伤、动脉瘤破裂、血管畸形、凝血功能障碍、或其他原因出血的结果。

脑缺血是指大脑中血流量无法满足代谢需求，导致脑部供氧不足或脑缺氧，进而使脑组织死亡或脑梗塞/缺血性中风。它是伴随蜘蛛网膜下腔出血和脑出血的中风亚型。脑缺血改变脑的生理代谢，代谢率的降低和能量摄取不足。目前可分为两种类型：局部性脑缺血(这仅限于脑的特定区域)和区域性脑缺血(其中涵盖脑组织的大部分区域)。

缺血性中风是由于脑部供血不足，导致脑组织功能障碍及坏死，有四个原因可导致缺血性中风：(1)血栓(血块自血管壁脱落形成栓子，阻塞血管)、(2)栓塞(身体其他部位形成之血块，阻塞血管)，(3)系统性供血不足(一般性系统性供血不足，如休克)和(4)静脉血栓。

目前急性缺血性中风的治疗主要采用静脉血栓溶解剂(rt-PA)来治疗。rt-PA于急性缺血性中风症状出现后3小时内使用可改善10％的重残程度，但无法改善死亡率；且愈早使用，治疗效果愈好。然于症状出现后3～4.5小时内使用rt-PA的疗效尚不清楚。文献指出使用rt-PA治疗缺血性中风于3-6个月后改善5％重残度，但增加2％死亡机率。且于症状出现4.5小时后使用此血栓溶解剂，预后不佳。目前尚无可靠的方式可以评估rt-PA治疗后是否造成颅内出血。

美国心脏协会(AHA)和美国神经医学会(AAN)建议应该在症状出现后3小时内使用，并且没有其他使用禁忌(如异常实验室检测值，高血压或最近手术等)才有最佳的效果。临床研究证实病人发病3个小时内使用rt-PA，可降低中风后残障等级，但不改变缺血性中风死亡率。同时结果显示，6.4％使用rt-PA的中风病人有引发大量脑出血并发症的可能，增加死亡率。此外，美国急诊医学学会(AAEM)认为，对于rt-PA应用于急性缺血性中风的疗效、安全性和适用性的客观证据不足以将其列入治疗标准。

中草药方面已有文献揭露含黄芪的中药复方具有治疗脑中风的功效，例如：补阳还五汤(含黄芪120克、当归尾6克、赤芍5克、地龙3克、川芎3克、桃仁3克、以及红花3克)。然而，未有文献揭露中药单方或其萃取物可有效治疗脑中风。事实上，依据中草药复方「君、臣、佐、使」的观念，其复方中所含的中药材并无法单独对一病症有所治疗效果，故含黄芪的中药复方并无法直接说明单独使用黄芪便能够对脑中风有治疗效果。

根据中国草药的原则，单一药材的治疗效果和混合物的治疗效果是大不相同。因此现有的含有黄芪混合物的中国草药相关文献不能直接解释黄芪提取物对于中风是有治疗效果。

因此，脑损伤和脑中风的病人，临床上仍极需一种安全、低副作用、无使用时间限制的治疗药物。

技术实现要素：

本发明所述黄芪萃取物总糖类含量为60％-120％.多糖的特性是由傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振光谱(NMR)中获得。其多糖苷键连接包含α-1,4糖苷键连接和α-1,6糖苷键连接，其中阿拉伯糖连结于碳端的C3和C5位置，葡聚糖链接于碳端的C4和C6位置，半乳糖链接于碳端的C3和C6位置，半乳糖醛酸连结于碳端的C4位置，以及鼠李糖链接于C2位置。该组合物还包含第一活性剂。

本发明透过新制程的制备方法，使含黄芪多糖萃取物有效的可用于脑损伤与脑中风预防、治疗及预后的用途。脑损伤包括外伤性脑损伤(TBI)和获得性脑损伤(ABI)。本发明之黄芪提取物使用于脑损伤患者的预防，治疗和预后。在一实施例中，该黄芪萃取物的有效剂量为每日125mg～2000mg/天。

本发明提供一种用于制备治疗脑损伤的黄芪萃取物的组合物的应用，所述组合物包含黄芪萃取物含量为60％-120％，其多糖苷键连接包含α-1,4糖苷键连接和α-1,6糖苷键连接，其中阿拉伯糖连结于碳端的C3和C5位置，葡聚糖链接于碳端的C4和C6位置，半乳糖链接于碳端的C3和C6位置，半乳糖醛酸连结于碳端的C4位置，以及鼠李糖链接于C2位置。

一种用于制备治疗脑中风的黄芪萃取物的组合物的应用，其特征是，所述组合物包含一黄芪萃取物和药物可接受的载体、赋形剂或盐。脑中风包含缺血性脑中风或出血性脑中风的预防、治疗及预后。在一实施例中，该黄芪萃取物的有效剂量为每日125mg～2000mg/天。

本发明提供一种治疗脑损伤的药物组合物黄芪萃取物的制备方法，包含:(1)将黄芪清洗干净后，将黄芪处理为饮片或粉末；(2)将该黄芪饮片或粉末，置入80-100℃的含水萃取溶剂中2～3小时，取得第一萃取溶液，然后在相同温度中重复2次1.5～3小时；(3)将所有浓缩后的萃取液在低温环境中加入乙醇或低链烷醇类进行沉淀步骤取得粗萃取物；以及(4)进行纯化步骤，将该粗萃取物再经由离心、过滤和/或离子交换层析法，进一步再通过超微过滤膜，取得黄芪萃取物。

本发明的一个或多个实施例的细节描述在下面。本发明的其它特征或优点将从以下的实施例详细描述以及从所请的权利要求范围是显而易见的。

附图说明

图1为黄芪萃取物的NMR分析结果。

图2为显示颅内出血脑中风病人使用黄芪萃取物治疗与对照组的病人在中风后第84天有明显的差异,使用格拉斯哥预后量表(GOS)评估。

图3为显示颅内出血脑中风病人使用黄芪萃取物治疗与对照组的病人在中风后第84天有明显的差异，使用mRS量表评估。

图4为在OGD诱发神经毒性的条件下使用各种剂量黄芪萃取物治疗来测试初代皮质细胞的乳酸脱氢酶(LDH)活性。

图5A和图5B为黄芪萃取物治疗缺血性脑中风模式下的大鼠脑梗塞体积明显缩小。

图5C为核磁共振成像的影像，显示使用50mg/kg黄芪萃取物治疗的缺血性脑中风模式下大鼠脑梗塞体积相较于对照组明显变小。

图5D和图5E为核磁共振成像的影像，定量结果显示使用50mg/kg黄芪萃取物治疗的缺血性脑中风模式下大鼠脑梗塞体积和最大梗塞切片的面积相较于对照组显着减少。

图6A为黄芪萃取物治疗缺血性脑中风模式下大鼠身体摆动不平衡测试结果相较于对照组显着减少。

图6B～图6D为黄芪萃取物治疗缺血性脑中风模式下大鼠活动能力测试(如垂直活性,垂直移动,移动次数)结果相较于对照组显着增加。

图6E为黄芪萃取物治疗缺血性脑中风模式下大鼠前肢握力测试结果相较于对照组显着增加。

实施方式

实施例1:

制备黄芪萃取物

黄芪萃取、分离和纯化步骤分别如下，黄芪萃取最佳来源是来自于两年生的黄芪根部，黄芪的品种可取自蒙古黄芪(A.membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或荚膜黄芪(A.membranaceus(Fisch.)Bge)或黄芪生长于中华人民共和国的内蒙古或山西省。

该黄芪萃取物一般是来自于灭菌处理饮片或切片的干燥根，所述调配包括修剪干燥根，以超滤(UF)水洗涤它们，并以消毒溶液清洗它们，如70％至75％的酒精，该根被切成薄片并在灭菌条件下产生干燥“饮片”，在本文中也称为“清洁饮片”。

该萃取物包含多糖体是产自该黄芪洁净饮片或微粉末，使用至少80-100℃的含水萃取溶剂所分离出。

该萃取溶剂可为水，且可选择性地包括共萃取物，如碱土金属盐或碱金属盐类，即还可以是碱土金属盐或碱金属盐类水溶液。该碱金属盐类包括如氧化钙、二氢磷酸钾或二氢磷酸钠，该共萃取物可为如缓冲液0.5M KH₂PO₄，pH为4.5。

萃取步骤是将萃取溶液加入饮片或微粉末分在一定的温度下进行一段时间，大多数需要进行多次的循环才能有效完成萃取程序。典型的流程包括三个萃取循环，每一循环持续大约1.5小时至3小时，并施加温度约80-100℃的萃取溶液，在某些实施例中该饮片一开始是以热盐水溶液清洗，如0.5M KH2PO4，pH为4.5，温度为约90-100℃，清洗约30分钟，在某些实施例中，所有制备饮片或微粉末的步骤皆于灭菌状态下进行，包括使用灭菌装备与试剂。

然后将该萃取溶剂浓缩，且此流程能在真空下约60-70℃温度下进行，使每1公斤的饮片或微粉末达到约0.8-1.1升的浓度，该浓缩也可以用超微过滤法制备，如使用具100千道耳顿排除过滤器的超微过滤。

之后该浓缩溶液是使用低链烷醇类自该浓缩萃取溶剂中沉淀处理，取得沉淀产物。该低链烷醇类可为如乙醇。在某些实施例中，该乙醇可加至该溶液中而成浓度约70％的乙醇，于室温下产生沉淀。在某些实施例中，该沉淀物首先是使用较低浓度约35％-40％的乙醇于第一沉淀步骤中，之后使用较高浓度约65％-80％的乙醇于第二沉淀步骤中，用于沉淀步骤中的低链烷醇类浓度范围可为20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％，或其中的任一浓度。

该醇类清洗步骤可重复以更进一步纯化。例如该沉淀物可用更多低链烷醇类清洗，其中典型的清洗包括如采用95％乙醇或99％乙醇清洗三次或四次，之后将该沉淀物悬浮于水中，其浓度适用于下一步处理，如约18％至20％重量/体积，可再次加入溶于水中的低链烷醇类沉淀，以移除非水溶性的其他材料，上清液可经较高浓度的低链烷醇沉淀析出，该较高浓度的低链烷醇可为如40％-80％的乙醇，且在某些实施例中，60％-70％的乙醇，以产生包含阿拉伯糖、半乳聚糖、蛋白质和相关的多糖粗萃取沉淀物。

该粗萃取物再次溶于水中并干燥。适当的干燥过程可包括此技术领域者所熟知的步骤，其可预防过度加热，可包括如喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥、临界点干燥、溶剂交换，以及类似方法。该粗萃取物亦可再溶于水或水性溶液中，所述粗萃取物进行适当超微过滤来浓缩。在某些实施例中，该适当的超微过滤液浓度为约2％至5％，之后将该粗萃取物经超微过滤，以进一步移除低分子量之的物质和减少溶液体积，所述超微过滤系统可具有5千至6千道耳顿分子量排除值(即超微过滤系统的截留分子量为5千至6千道耳顿)。

在某些实施例中，该粗萃取物可为白色至灰白色粉末，或淡黄色粉末，并可溶于水中成至少约100毫克/毫升。在某些实施例中，该粉末为可溶于水中，至少约200毫克/毫升。该粉末显示出干燥时重量损失小于约15％，具有内毒素含量小于约0.5EU/mg，以及在某些实施例中，具有内毒素含量小于约0.3EU/mg。

该粗萃取物可经大孔吸附层析法或离子交换层析法更进一步纯化，该组成物再溶于水溶液中，并进行适当的超微过滤浓缩，一般浓度为约0.5％至2％。再溶解的组合物之后进行超微过滤，以进一步移除低分子量的物质和降低溶液体积，可使用上述的5千道耳顿分子量移除超微过滤系统，超微过滤的滞留物是经阳离子交换管柱洗脱，如SP Sepharose阳离子交换管柱，平衡于20mM醋酸钠缓冲液，pH 5.20中，该阳离子交换管柱的洗脱物再经阴离子交换管柱洗脱，如Q Sepharose阴离子交换管柱，平衡于相同的醋酸钠缓冲液中。

该阴离子交换管柱的洗脱物可以是(1)直接使用于其他形式萃取物的制备中；(2)经浓缩并干燥，以形成粗萃取物，可做为制备纯化萃取物的中间物；(3)直接用于纯化萃取物的制备。

其纯化步骤，是将该粗萃取物经超微过滤，使用适当的除菌过滤器，如0.1微米过滤器，以去除溶液中的盐类和再次减少其体积，在某些实施例中可使用8千道耳顿分子量移除超微过滤。超微过滤中的滞留液为浓缩液，百分比浓度可使用折射计测量，在某些实施例中，该滞留液是浓缩至浓度约20％至26％在50-60℃。该经浓缩的滞留液之后再经低链烷醇类沉淀。在某些实施例中，该低链烷醇类可为乙醇，其加入至浓度为约80％至90％，沉淀物可经更进一步清洗，所述典型的清洗包括以无水乙醇清洗沉淀物三次，之后将该沉淀物干燥，得到经纯化的萃取物。在某些实施例中，该沉淀物的干燥可使用如真空烘箱或喷雾干燥法，温度为约60-70℃。.

实施例2:

使用核磁共振光谱测定被纯化的萃取物

使用核磁共振光谱仪(NMR)来测定被纯化萃取物的组成。萃取物的检测是使用¹H NMR光谱仪记录，样品使用99.9atom％D₂O以中间冻干交换两次，最后溶解于D₂O之中。¹H的化学位移以内部参照组丙酮为基准且以ppm表示，并使用1D300-MHz的¹H NMR光谱记录。甲基化分析也用于糖苷键。于此过程之中，分子可以被完全O-甲基化。该产品可以通过连续水解被转化为得到的部分O-甲基化的单位，这是使用NaBH₄来还原，接着经乙酰化以提供部分O-甲基化的单位，这是在GC-MS(气相色谱-质谱)，具有典型的保留时间及电子冲击光谱，此多糖萃取物从连续的纯化步骤包括L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖和D-半乳糖与主链为1,6-和1,2,6-吡喃半乳糖基和1,5-和1,3,5-阿拉伯呋喃糖基，以及次要链为1,4-和1,4,6-吡喃葡萄糖基和1,2-和1,2,4-鼠李吡喃糖基显示出与下述的体内/体外神经保护相关的生物学功能。(图1)

显然该黄芪萃取物由具有复杂的多糖异构结构所组成，使用系统地来分析黄芪萃取物，可以得出结论，在样品中有两种类型的多糖：一种α-1,4-键结和一种α-1,6-键结的形式，由¹H NMR光谱测定(α-1,4:α-1,6)的碳水化合物部分的相对组成为4：1至8：1。

实施例3:

中风量表的临床说明和使用

1.格拉斯哥预后量表(GOS，Glasgow outcome scale)：格拉斯哥预后量表被开发来广泛定义因头部外伤或非外伤性脑损伤造成的严重脑损伤结果分类，此量表反映了残疾和障碍，而不是损伤，也就是说，它的重点是在损伤如何影响到正常生活的主要领域，而不是伤害造成特定缺陷和症状，它不适合在提供关于个别病人的困难的详细状况，主要是提供整体结果的一般指标，该格拉斯哥预后量表分为5等评级(死亡，植物人，重度残疾，中度残疾，和恢复良好)

2.雷氏修正量表(mRS，Modified Rankin scale)：雷氏修正量表是一种常用的量表来评估脑中风或神经残疾患者等原因造成的日常生活活动依赖状况，它已成为最广泛使用在中风临床试验的临床测量结果。

3.巴氏量表(BI，Barthel Index)：巴氏量表是一种日常生活功能评估量表，每个日常生活功能项目具有一個分數區間，依據病人狀況给定一個分数，再依被评分數評估該病人等级，采用10个评估变项说明日常生活功能和移动力。评估分数越高，表示出院后于家里的生活独立性程度高。各项目的给分是依据该项目活动障碍需要多少时间、物理协助而定。

4.功能独立量表(FIM，Functional independencemeasure)：功能独立量表(FIM)是一个评估工具，目的是在中风，脑外伤，脊髓损伤或癌症整个康复过程评估患者的功能状态。它的使用范围包括严重，亚急性和康复护理的技术护理机构和医院。它作为一个用于比较连续健康照护康复成果一致性的数据收集工具。

实施例4:

使用黄芪萃取物治疗出血性中风患者的有利临床结果

1.实验设计

该试验纳入经临床诊断为急性出血性脑出血病人，包含男性和女性患者，平均年龄42-70岁，总共有47名患者(实验组22例，对照组25例)。

每一组除了常规治疗之外，治疗方式如下：1)对照组接受安慰剂(生理盐水溶液)；2)实验组接受黄芪萃取物，从住院第二天起每周三次，连续2周。

实验组使用本发明的黄芪萃取物的组合物(包含22例)，对照组使用生理盐水溶液(包含25例)。

比较实验组和对照组中风后格拉斯哥预后量表(GOS)分数(4-5)(4-5:中度残疾至恢复良好(后遗症程度低者)；分数(0-3)(0-3:死亡至严重残疾)的人数比例。结果显示使用本发明组合物(黄芪萃取物)的治疗组于中风后3个月期间，不论是治疗期间(中风后第7天)或治疗后(中风后第28及84天)的GOS分数(4-5)的人数比例皆高于安慰剂对照组(如图2所示)，于中风后84天观察，差异达30％，且随时间增加人数比例的幅度较安慰剂对照组更趋明显，显示本发明组合物具可治疗脑中风后遗症，加速病患复原的疗效(如图2所示)，在第84天的功能结果测量，安慰剂对照组的GOS分数(4-5)人数比例为56％，而实验组的GOS分数(4-5)人数比例为86.4％。

2.改良雷氏修正量表(mRS)测试

比较实验组和对照组的中风后发生mRS分数(0-2)(0-2:无残疾至轻度残疾(后遗症程度低者)；分数(3-5)(3-5:中度至严重残疾)的人数比例。结果显示使用本发明组合物的治疗组的mRS分数(0-2)的人数比例皆高于安慰剂对照组(如图3所示)，中风后第84天观察的mRS分数(0-2)的人数比例高于安慰剂治疗组，差异达26％，显示本发明组成物具可治疗脑中风后遗症，加速病患复原的疗效如图3所示，在中风后第84天，安慰剂组的mRS分数(0-2)人数比例为56％，而治疗组的mRS分数(0-2)人数比例为81.8％。

3.肿瘤坏死因子(TNF)量测

实验组使用本发明的黄芪萃取物的组合物(包含22例)，对照组使用生理盐水溶液(包含25患者)。相对于ICH(颅内出血)发生的第一天，治疗组的肿瘤坏死因子(TNF)在第7天和第14天数值显着比安慰剂组降低，TNF在中风进展扮演关键角色，起关键性作用，在本研究中，结果表明本发明的黄芪萃取物可治脑中风的后遗症，提高患者的恢复(表1)。

表1.肿瘤坏死因子(TNF)量测

资料为平均值±标准偏差.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001为配对测试(paired test)；&:独立测试(independent test for continuous data)；$:Wilcoxon rank sum test

肿瘤坏死因子(TNF)和中风预后指数(GOS and mRS)的相关性

根据该实验结果，肿瘤坏死因子(TNF)数值和GOS评分值的分析呈负相关，但TNF数值和mRS分数为直接相关(表2)。人们已经知道了在急性中风患者血浆中肿瘤坏死因子(TNF)提升，这些结果表明，本发明的黄芪萃取物可以治疗脑中风的后遗症，并增加患者的恢复。

表2.肿瘤坏死因子(TNF)和中风预后指数(GOS and mRS)的关系

实施例5

黄芪萃取物治疗脑部缺血性中风的体外模型

在体外的初代皮质细胞(Primary cortical cells,PCC)治疗模型中，初代皮质细胞是从怀孕第17天的Sprague-Dawley大鼠胚胎的大脑皮层所制备，如先前描述修正。分离后四天，使用MEM培养基(MEM，GIBCO-BRL)再加入0.5g/L的牛血清白蛋白、2％B27补充剂、0.5mM的丙酮酸和抗生素于MEM培养基中。最后，该培养基在第七天被改为无牛血清的Neurobasal培养基，此培养基包含有1mM丙酮酸、1mM的谷氨酸、0.5g/L的牛血清白蛋白和2％B27添加剂和抗生素。针对缺氧缺糖模型(OGD)治疗，细胞培养在无葡萄糖的Earle’s balanced盐溶液(Earle’s平衡盐溶液)，并培养于37℃低氧室中6-8小时(Bug Box,Ruskinn Technology)，培养环境持续提供95％N₂和5％CO₂并保持气相中的氧分压小于1毫米汞柱(使用OM-14的氧监测系统，SensorMedics公司)。在同一期间对照组细胞培养在无葡萄糖的Earle’s balanced盐溶液，并在含氧量正常的培养箱做培养。

乳酸脱氢酶(LDH)的测试方法

为了证明本发明黄芪萃取物具有神经保护能力，先将初代皮质细胞先培养在24孔盘，并且预先加入各种浓度的黄芪萃取物(浓度分别为0.1μM、1μM和10μM)，黄芪萃取物预处理的20分钟后，初代皮质细胞经受OGD在低氧室中培养6-8小时，然后如所述的培养基中收集乳酸脱氢酶(LDH)活性测定(J Neurosci Methods 1987；20:83-90)。

评估黄芪萃取物在体外的神经保护作用结果，在OGD诱发神经毒性的条件下使用各种剂量黄芪萃取物进行治疗(0.1μM,1μM和10μM)，测试初代皮质细胞的乳酸脱氢酶(LDH)活性(如图4所示)。结果显示10μM的黄芪萃取物治疗组相较于对照组显着降低乳酸脱氢酶(LDH)活性。(如图4所示)。

黄芪萃取物治疗脑缺血中风的脑缺血动物模型

体内脑缺血动物模型测试步骤如下，使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(体重250-300克)，将大鼠先用水合氯醛(0.4克/公斤，IP)麻醉，并进行结扎右大脑中动脉(MCA)和夹紧双侧颈总动脉(CCA)如期刊所述(Stroke 1986；17:738-743)，以及使用非创伤性动脉修剪来夹紧双侧颈总动脉(CCA)。使用显微镜手术，在颧骨融合鳞骨处钻探2cm×2cm的开颅手术，然后将右大脑中动脉(MCA)用10-0尼龙缝线结扎，使用激光多普勒流量计(PF-5010,Periflux system,Perimed AB,Stockholm,Sweden)连续测量被麻醉动物的大脑皮层血流量。光电检测器的探针(直径0.45毫米)立体定位放置在通过颅骨钻的孔洞(直径1毫米)在额顶叶皮质(l.3毫米后部，2.8毫米外侧到前囟门，和硬脑膜以下1.0毫米)。然后，再使用26号注射器插入实验大鼠右股静脉注射，右大脑中动脉(MCA)结扎30分钟后，将实验大鼠静脉注射不同浓度黄芪萃取物(在生理食盐水中1、10、25和50毫克/公斤的浓度)或仅模拟操作无治疗连续三天。在局部缺血中风90分钟后，移除右大脑中动脉(MCA)的10-0缝合线和在双侧颈总动脉(CCA)的动脉夹以允许再灌注。在麻醉恢复期间进一步使用热灯来维持37℃的体温。

1.神经行为的测量.

在脑缺血之前3天和之后72小时进行评估，该测试测量身体不对称性和活动能力如前所述(Stroke 2003；34:558-564)，进一步用握力计(TSE-Systems)来分析抓握力量，如先前描述修正(NeurosciLett 1998；246:1-4)。改善抓握力量比例的量测，是先单独的对于每个前肢做测试，再计算每个同侧的和对侧的拉力相对于脑缺血的一边，平均大于20拉力的比例。此外，治疗后及基底值的抓握力量的比例及相对于基底值变化的百分比也会被计算。

2.氯化三苯基(TTC)染色

脑缺血手术后三天，将动物进行心内灌注生理食盐水，

再移除脑部组织，将其浸入冷生理盐水5分钟，并切成2毫米厚的切片(每只大鼠7片)，将脑部切片培养在20克/升的TTC(Research Organics Inc)，溶解在食盐水中设定温度为37度进行30分钟，然后再放至5％的甲醛溶液来固定脑部切片，使用电子显微镜测定每个切片的梗塞面积，如先前期刊所描述方法(JNeurosci 1997；17:4341-4348)。切片体积的大小数据测量方法，先将脑部组织进行切片，平均的切片厚度为2毫米再测量各切片的梗塞面积。为了减少人为因素的误判，梗塞的面积的计算方式也使用先前所述的方法(Stroke 1993；24:117-121)。为了测量右大脑皮层的梗塞面积，我们从左半球的总大脑皮质面积减去在右大脑皮质的非梗塞区域。

3.使用磁共振成像(MRI)来测量脑梗塞体积

磁共振成像(MRI)使用3.0T的美国通用电气的影像系统(GE，R4).大鼠扫描的脑组织约6至8张冠状图像切片，每个切片为连续式的2毫米切片，取得T2-weighted imaging(T2WI)脉冲序列与使用自旋回波技术(spin-echo technique)(重复时间:4000毫秒；回波时间:105毫秒)，取得每只动物在脑缺血后14天被拍摄记录。为了测量在右大脑皮质的脑梗塞面积，我们在从大脑左半球的总皮质区域中减去右大脑皮质非梗塞面积，脑梗塞的面积被人工绘制从切片到切片，然后体积透过内部体积分析软件(Voxtool,General Electric)来计算。

参考所有在说明书中的实施例，所有结果显示改良制程后生产出的黄芪萃取物效果大于一般生产制备的黄芪萃取物。

根据此机制，我们提出了外源性的黄芪萃取物可当作治疗方法促进中风后的功能恢复。为选择黄芪萃取物的最有效的治疗剂量，使用氯化三苯基(TTC)染色检测分别经1、10、25和50毫克/公斤的黄芪萃取物处理的大鼠来测定脑缺血梗塞。在脑缺血后3天，给予50毫克/公斤黄芪萃取物的大鼠脑梗塞体积远远小于在其他剂量组(如图5A、5B)。在脑缺血后7天，使用核磁共振成像来评估脑梗塞体积和最大梗塞切片的面积，50毫克/公斤的黄芪萃取物治疗大鼠与对照组的大鼠相比是显着减少，(见图5C～5E)。接着评估黄芪萃取物治疗组或生理食盐水处理的对照组的神经功能缺损的恢复，包含身体不对称、活动能力测试及握力测量，黄芪萃取物治疗的大鼠表现在身体摆动测试比生理食盐水处理的对照组更好的恢复能力(图6A)，在大鼠脑缺血后接受黄芪萃取物与对照组相比，前者运动活动能力是大大改善(图6B～6D)，此外，比较脑缺血前及缺血后28天前肢握力结果显示黄芪萃取物的治疗组比对照组有一个更好的握力(图6E)。

虽然本发明已经在具体的示例性实施方案和例子进行了说明，但是应该理解的是，本文所揭露的实施例仅用于说明的目的，可由本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围如在下面权利进行各种变形和变更。

最重要的是发现黄芪萃取物在动物和人体的研究能有效地减少脑损伤和提高功能效果，综上所述，本发明所制造的黄

芪萃取物是一种极好的候选药物来预防和治疗脑损伤。