椎间盘突出治疗剂的制作方法

本申请是申请日为2011年12月13日、申请号为201180059662.0、发明名称为“椎间盘突出治疗剂”的申请的分案申请。

本发明涉及一种以软骨素酶(chondroitinase)abc作为有效成分的椎间盘突出治疗剂。

背景技术：

椎间盘突出是存在于椎间盘内的“髓核”穿破存在于其周围的纤维环，椎间盘组织突出至椎管内并压迫脊髓等神经，而产生下肢痛、腰痛等症状的疾病。其治疗的原则为保守疗法，已报告有约90％的病例通过保守疗法而治愈。就保守疗法而言，已施行安静、卧床、药物治疗(非类固醇抗炎药(nsaids)、肾上腺皮质类固醇、肌肉松弛剂)、脊椎装具(整姿内衣)、牵引疗法、温热疗法、硬膜外阻断、神经根阻断、运动疗法等多种治疗法。在使用该等保守疗法但未见改善时则选择手术疗法，所有腰椎椎间盘突出患者中有10％至30％适用手术。近年来，为了减少手术疗法所致的侵入和负担，研发了化学髓核溶解术。

化学髓核溶解术是将酶注入至椎间盘内，溶解髓核而减少椎间盘的内压，减轻对脊髓神经根的压迫的方法。

至今已报告有方法使用木瓜凝乳酶(chymopapain)作为注入椎间盘内的酶，已在1964年报告其有效性(非专利文献1)。然而，已发现木瓜凝乳酶不仅作用于髓核，并且作用于包括脊髓等的椎间盘周围组织，而有严重的神经学并发症(截瘫、横贯性脊髓炎、脑出血、蜘蛛膜下出血、四肢麻痹等)，因而现在已中止作为药品进行销售(非专利文献2)。

因此，现在并没有市售的化学髓核溶解术用药，希望开发出可安全进行化学髓核溶解术的药品。

认为软骨素酶abc对存在于髓核中的蛋白多糖的糖胺多糖(glycosaminoglycan)链(硫酸软骨素链、透明质酸链等)进行分解，使蛋白多糖的高保水性减弱而减少椎间盘的内压，从而减轻对脊髓神经根的压迫。此外，与木瓜凝乳酶不同，软骨素酶abc几乎没有对椎间盘周围的神经组织等的伤害，而期待其成为安全的医药，已在1985年报告尝试使用软骨素酶abc作为注入椎间盘内的酶(专利文献1、非专利文献3、非专利文献4)。

然而，椎间盘原本具有作为缓冲垫支撑施加在脊椎上的体重的任务，因此若过度去除髓核，会损害该椎间盘原本应有的作为缓冲垫的功能。实际上显示，通过手术疗法使椎间盘高度减少30％以上的患者可能残留腰痛(非专利文献5)。因此，即使是通过给予软骨素酶abc进行的化学髓核溶解术，若使髓核过度溶解，会损害椎间盘原本应有的作为缓冲垫的功能而可能引发副作用。

此外，软骨素酶abc是不存在于人体中的异种蛋白，因而从防止过敏性休克等观点来看，不能多次给予、而必须仅1次给予使治疗成功。仅1次给予来完成治疗意味着，因为到痊愈为止无法进行多次给予，所以必须得出1次给予就显示出显著的治疗效果、且副作用小的最佳剂量。

此外，在动物模型中虽然进行了许多关于椎间盘病变的研究，但是动物物种之间的椎间盘并不相同，因此将动物模型的结果应用在人类椎间盘病变的研究，需要更加注意与努力研究(非专利文献6)。

上述1次给予的特殊性及从动物模型适用至人类的困难度，使得通过软骨素酶abc进行的化学髓核溶解术存在困难，确实从前述1985年起经过25年后到现在仍未达到实用化。

专利文献1虽然记载了“将软骨素酶abc给予至椎间盘内而溶解髓核，以治疗椎间盘突出”的主旨以及“将软骨素酶abc以每一椎间盘100单位给予至人类椎间盘内，得到椎间盘突出的治疗效果”的主旨，但是其效果不够充分且并未针对副作用进行研究，因此并未实现可以决定有用的给予量。此外，非专利文献3记载了将软骨素酶abc以每一椎间盘0.5单位给予至人类椎间盘内，得到椎间盘突出的治疗效果的主旨。非专利文献4虽然记载了将软骨素酶abc以每一椎间盘0.5-1单位、2.5-5单位及5-10单位给予至狗的椎间盘内，但是人类的髓核体积约为狗的70倍，将其给予量换算成人类则约为35单位。然而，并未对软骨素酶abc给予后的详细副作用进行研究。

因此，并未公开或暗示关于显示最大治疗效果且副作用最小的软骨素酶abc的最佳剂量。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：美国专利第4696816号说明书

[非专利文献]

非专利文献1：smithl.enzymedissolutionofthenucleuspulposusinhumans.jama1964(2)；187：137-40

非专利文献2：usfederalregister.mondayjan27，2003；68(17)：3886-7.

非专利文献3：臨床整形外科(临床整形外科)，第42卷，第3卷，223-228页，2007年3月

非专利文献4：spine，1991；16(7)：816-19

非专利文献5：spine，1996；21(13)：1556-64

非专利文献6：eurspinej，2008；17：2-19

技术实现要素：

发明要解决的问题

如上文所述，虽已报道软骨素酶abc作为化学髓核溶解术用的医药有效成分的有用性，但也担心过度的髓核溶解造成的严重副作用，并且尚不知晓仅1次的给予即表现确切的治疗效果、且无副作用的给予量是否存在，而未达到实用化。

本发明的课题为提供一种副作用极低、且仅1次的给予即得到长时间持续性的疼痛改善效果，在临床上发挥高治疗效果与安全性的椎间盘突出治疗剂。

用于解决问题的方案

本发明人在不断深入研究通过软骨素酶abc进行治疗的结果，意外地发现通过给予特定量的软骨素酶abc可降低副作用，且长时间持续性地改善疼痛效果/在临床上发挥高治疗效果，从而完成本发明。

也就是说，发现在人类椎间盘内每一椎间盘使用1-8单位的软骨素酶abc给予量，不仅可期待治疗效果且可降低副作用的表现，发现可提供使用软骨素酶abc的、实用且优异的椎间盘突出治疗剂。

本发明涉及含有以每一椎间盘1-8单位给予至人类椎间盘内的软骨素酶abc作为有效成分而得到的椎间盘突出治疗剂。

此外，本发明涉及为了将软骨素酶abc以每一椎间盘1-8单位来给予至人类椎间盘内、治疗椎间盘突出用的给予制剂。

再者，本发明涉及椎间盘突出的治疗方法，包括向椎间盘突出的患者给予含有1-8单位软骨素酶abc作为有效给予量得到的制剂。

更详细而言，本发明如下所示。

(1)一种椎间盘突出治疗剂，其特征在于，所述治疗剂以软骨素酶abc作为有效成分，将该成分以每一椎间盘1-8单位给予至人类椎间盘内而使用。

(2)前述(1)所述的治疗剂，其中，所述椎间盘突出为腰椎椎间盘突出。

(3)前述(1)或(2)所述的治疗剂，其中，所述软骨素酶abc源自普通变形杆菌(proteusvulgaris)。

(4)一种用于治疗椎间盘突出的制剂，所述制剂含有为了将软骨素酶abc以每一椎间盘1-8单位来给予至人类椎间盘内的软骨素酶abc。

(5)前述(4)所述的制剂，其中，所述制剂为单次给予制剂。

(6)前述(4)或(5)所述的制剂，其中，所述制剂为注射剂。

(7)前述(4)至(6)中任一项所述的制剂，其中，所述椎间盘突出为腰椎椎间盘突出。

(8)一种椎间盘突出的治疗方法，所述方法包括以每一椎间盘1-8单位给予至人类椎间盘内作为有效给予量，向椎间盘突出的患者给予软骨素酶abc。

(9)用于作为椎间盘突出治疗剂而使用的软骨素酶abc，其特征在于，将软骨素酶abc以每一椎间盘1-8单位给予至人类椎间盘内而使用。

发明的效果

根据本发明可提供一种副作用少，能以1次给予完成椎间盘突出的治疗，安全且治疗效果高，并且临床上有用性高而实用的椎间盘突出治疗剂。

在通过软骨素酶abc进行的化学髓核溶解术中，本发明首次得知存在安全且治疗效果高、临床上具有有用性的给予量，并且首次得知该给予量为1-8单位、优选1-5单位的限定范围，对于通过给予软骨素酶abc进行的化学髓核溶解术的实用化具有很大的贡献。

附图说明

图1为表示给予治疗剂后最糟时下肢痛(vas)的推移的图。

图2为表示各给予单位组的副作用表现率的图。

图3为表示各给予单位组的椎间盘高度平均减少率的图。

具体实施方式

以下将对本发明的实施方式进行说明。

(1)本发明治疗剂的有效成分

作为本发明治疗剂的有效成分所使用的软骨素酶abc，只要是具有软骨素酶abc作用的酶即不作特别限定。虽然对其来源同样不作特别限定，但优选源自微生物，更优选源自普通变形杆菌(proteusvulgaris)。

该软骨素酶abc的制造方法等无特别限定，例如可通过培养普通变形杆菌等微生物而生产，可通过使用编码软骨素酶abc的dna等以基因工程的技术生产。

将该软骨素酶abc精制成可作为医药使用的程度，优选不含有作为医药不允许混入的物质。

作为这种软骨素酶abc，更具体而言，优选具有270单位/mg蛋白以上的酶活性且内毒素、核酸、蛋白酶含量均在检出限以下。这种软骨素酶abc例如可通过日本特开平6-153947号公报所记载的方法而得到。

此外，本发明中软骨素酶abc的“1单位”是指在将软骨素硫酸c作为基质使酶作用时，在ph8.0、37℃的条件下，1分钟内使不饱和二糖游离1微摩尔(μm)的酶量。

通过使用酶活性为270单位/mg蛋白以上的软骨素酶abc，作为注射用医药品给予至活体内时未对周围组织造成影响，可适当地分解目的部位的蛋白多醣，可作为安全性与有效性高的医药。

(2)疾病对象

本发明治疗剂的疾病对象只要是椎间盘突出即不作限定，优选腰椎椎间盘突出，其中，特别优选在第4腰椎与第5腰椎之间的椎间盘或者第5腰椎与第1骶骨之间的椎间盘产生的腰椎椎间盘突出。

(3)给予部位/方法/次数

本发明治疗剂通过注入至存在于产生椎间盘突出的椎间盘内的髓核中而使用。注入次数为1次。

由此，椎间盘髓核中的硫酸软骨素链和透明质酸链被分解，蛋白多糖所具有的高保水性减弱，椎间盘内压降低，结果椎间盘突出所造成的脊髓神经根的压迫减轻，改善椎间盘突出。

(4)给予量

将本发明的治疗剂每一椎间盘给予1-8单位作为本发明治疗剂的有效成分的软骨素酶abc的量。其中，优选给予1-6单位，更优选给予1-5单位，更优选给予1-3单位，进一步更优选给予1-2.5单位或1.25-3单位，特别优选给予1.25-2.5单位，最优选给予1.25单位或2.5单位。

尤其在1.25单位至5单位的给予量中，治疗效果几乎相等(参考图1)，从副作用表现率(％)在2.5单位的给予量时最小(参考图2)来看，为了确保1次给予所实现的有效的治疗效果与安全性，给予量为1-5单位、优选1-3单位。

(5)剂型等

本发明的治疗剂可以注射剂通常采用的剂型提供。例如溶液状、冻结状或冻干状任一者皆可。将其填充/密封于安瓿、小瓶(vial)、注射用注射器等适当的容器中作为注射剂。

此外，将本发明治疗剂填充或密封于安瓿、小瓶、注射用注射器等适当容器中时，为了防止本发明治疗剂的化学反应、尤其是氧化，可与氮气或稀有气体等非活性气体一起填充或密封。

可填充/密封本发明治疗剂的安瓿、小瓶、注射用注射器等容器的材质只要是不对本发明治疗剂造成影响且制剂学上允许的材质，即不作特别限定。

本发明治疗剂的制剂化可使用公知的方法。此外，制剂化只要对软骨素酶abc本身的活性不会造成不良影响、且对软骨素酶abc的作用不会造成不良影响，可使用其它医药活性成分或惯用的赋形剂、稳定剂、结合剂、乳化剂、渗透压调整剂、缓冲剂、ph调整剂、等渗剂(isotonizingagent)、保存剂、无痛化剂、着色剂等通常的医药用成分。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，所述实施例为本发明的示例，本发明的范围并不受限于所述实施例。

实施例1

本发明治疗剂的制造

(1)软骨素酶abc的制造

软骨素酶abc通过用日本特开平6-153947号公报所记载的方法培养普通变形杆菌，从其培养上清液进行精制而制造。

制造出的软骨素酶abc的酶活性均在270-480单位/mg蛋白的范围内。此外，内毒素、核酸、蛋白酶含量均在检出限以下。

(2)制剂化

依照一般方法制造以下(a)至(c)的3种冻干注射剂，其含有以下各单位的前述软骨素酶abc与以下制剂成分。

(a)5单位的前述软骨素酶abc

(b)10单位的前述软骨素酶abc

(c)20单位的前述软骨素酶abc

制剂成分：

(注：聚乙二醇3350适合日本药局的macrogol4000)

此外，作为安慰剂，使用将仅前述制剂成分(不含软骨素酶abc)用同样方式制成冻干注射剂。

(3)给予前的溶解

在使用前，于前述(a)至(c)各试剂(含安慰剂)中添加以下组成的临用时溶解液4ml，溶解后分别调制1.25单位/ml给予用制剂、2.5单位/ml给予用制剂及5单位/ml给予用制剂。安慰剂亦以同样方式调制。

临用时溶解液：

实施例2

对椎间盘突出患者的试验

1.受试者

以20岁以上70岁以下的日本人、患有以下椎间盘突出的患者(共计194例)作为受试者；

用mri确认第4腰椎与第5腰椎之间的椎间盘或者第5腰椎与第1骶骨之间的椎间盘之一具有腰椎椎间盘突出，受到损害的神经根的位置与临床症状一致，膨隆型或后纵韧带下脱出型(未穿破后纵韧带)的腰椎椎间盘突出患者。

对于能看到第6腰椎的情况，第5腰椎神经根或第1骶骨神经根受到损害，临床症状一致的患者。

将受试者分成给予安慰剂(47名)、给予1.25单位(49名)、给予2.5单位(49名)及给予5单位(49名)的各组，各自给予对应的前述给予用制剂。

2.本发明治疗剂的给予方法

实施例1所记载的各给予用制剂(4ml)中的1ml用于给予。因此，给予的酶量如下：1.25单位给予用制剂为1.25单位/ml，2.5单位给予用制剂为2.5单位/ml，5单位给予用制剂为5单位/ml。使用给予用制剂，如下文所述单次注射各1ml于椎间盘髓核内。

3.评价

(1)药效评价

一、受试者的疼痛评价(visualanalogscale：vas)

在给予前述给予用制剂后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第13周、第26周、第39周及第52周各时间点，实施对于受试者自己所评价的“过去24小时最糟时的下肢痛(vas评价)”的测定(vas值测定)。

受试者的vas评价在就寝前进行。在附有100mm的直线的“疼痛评价表”上的直线上(在该直线的左端记载“无痛”、右端记载“目前为止感觉最大的疼痛”)，受试者自己将其疼痛程度用点标示。

测定从同一直线的左端到受试者所标示的点为止的距离(mm)，评价疼痛程度。对于此评价结果，以安慰剂组作为对照进行dunnett型多重比较。

再者，评价疼痛变化率(vas变化率)。vas变化率通过由将前述给予制剂进行给予前的vas值减去将前述给予制剂进行给予后第13周的vas值作为vas变化量，接着将该vas变化量除以将前述给予制剂进行给予前的vas值而求得。对于该vas变化率，以安慰剂组作为对照进行协方差分析(p＜0.05)。

二、神经学检查

为了研究椎间盘突出所造成的神经刺激症状，在将前述给予用制剂进行给予后第13周实施直抬腿试验(slr试验(straightlegraisingtest))。

slr试验是腰椎椎间盘突出的神经学检查之一，将伸展的下肢抬高，坐骨神经痛所造成的抬起角度为70°以下时判断为阳性，超过70°时为阴性。在本试验的给予之前，所有人均为阳性。

对于slr试验的阳性/阴性，按群组进行频率总计，通过用安慰剂组作为对照进行steel型多重比较来考察slr试验的阴性比例。

此外，药效评价将受试者193例作为对象来进行。

(2)安全性评价

安全性评价将194例受试者作为对象来进行。

求出副作用的表现数及表现率。评价进行直到将前述给予用制剂进行给予后第13周。但在副作用方面，以下关于(一)及(二)之项目，评价进行直到给予后第52周；

与将前述给予用制剂进行给予前的值相比较，相同给予后的(一)椎间盘高度的减少率为30％以上者以及(二)椎体后方打开角度(椎体の後方開大角度)成5°以上者。

此外，(二)椎体后方打开角度为5°以上的安全性评价是美国食品医药品局(fda)所规定的、关于椎间盘不稳定性的指标。

求出将前述给予用制剂进行给予后第13周时，各单位给予组的椎间盘高度的平均减少率。

4.结果

(1)药效评价

一、vas

将前述给予用制剂进行给予后的最糟时下肢痛(vas)的推移如图1所示。图1的横轴表示给予后的时间(周)，纵轴表示vas的值(mm)。图中的菱形标记(◆)表示安慰剂组的结果，圆形标记(●)表示1.25单位给予组的结果，正方形标记(■)表示2.5单位给予组的结果，三角形标记(▲)表示5单位给予组的结果。

前述给予用制剂的任一个给予组中，从第1周开始观察到疼痛抑制效果。尤其在前述给予用制剂的1.25单位给予组及5单位给予组中，从第1周开始与安慰剂相比显示出显著的疼痛抑制效果(p＜0.05)。此外，在给予后第39周、第52周，全部的给予组比起安慰剂显示出显著的疼痛抑制效果(p＜0.01或p＜0.001)。其疼痛抑制效果在1.25单位给予组、2.5单位给予组、5单位给予组中几乎相等，经过1年(52周)显示有效。由此显示出，前述给予用制剂以1次的给予显示出显著的疼痛抑制效果。

此外，对于给予后第13周的vas变化率，1.25单位给予组为66％，2.5单位给予组为61％，5单位给予组为69％，可确认任一单位给予组均比安慰剂组的vas变化率(45％)显著减少。

二、神经学检查(slr试验)

安慰剂组的阴性化率为50％左右，但是给予组均为60％以上。尤其1.25单位给予组达到80％以上。

任一给予组中阴性的比例均增加。尤其1.25单位给予组与安慰剂相比，阴性的比例显著(p＜0.01)增加。

(2)安全性评价

副作用表现率如图2所示。图2的横轴表示各给予组，纵轴表示副作用表现率(％)。5单位给予组的表现率为61.2％，2.5单位给予组的表现率为44.9％，1.25单位给予组的表现率为46.9％。由此显示出副作用表现率的最小值在每一椎间盘2.5单位给予组附近，得知存在可使副作用最小的给予量。

接着，考察关于有关椎间盘不稳定性的副作用(一)椎体后方打开角度成5°以上者以及(二)椎间盘高度的减少率成30％以上者。结果示于下表1中。

[表1]

－：无数据

由其结果可见，5单位给予组的椎体后方打开角度成5°以上者有1例(表现率2％)。另一方面，在1.25单位给予组及2.5单位给予组中，均没有椎体后方打开角度成5°以上者。此外，作为比较例所例举的10单位给予组有2例(表现率33.3％)，有关椎间盘不稳定性的副作用以高比率发生，显示出不具有实用性。

椎间盘高度的减少率成30％以上者在5单位给予组有7例(表现率14.3％)，但是1.25单位给予组及2.5单位给予组中分别为4例(表现率8.2％)，可见副作用的表现急剧减少。

接下来，各单位给予组的椎间盘高度平均减少率如图3所示。图3的横轴表示各给予组，纵轴表示椎间盘高度减少率(％)。

由其结果可知，椎间盘高度平均减少率在5单位给予组、2.5单位给予组及1.25单位给予组均未达到30％。这些给予组与安慰剂组相比均有大幅的减少率，显示出有治疗效果。此外，比较例的10单位给予组中减少率为30％以上。

此外，2.5单位给予组有1例，5单位给予组有1例，发现有副作用(对于软骨素酶abc，igg抗体价的上升)。在1.25单位给予组并未发现此抗体价的上升。

(比较例)10单位给予的安全性评价

对腰椎椎间盘突出患者(6名)以与前述相同的方法给予每一椎间盘10单位的软骨素酶abc。作为安全性评价，求出(一)给予后第12周之椎间盘高度的减少率以及(二)椎体后方打开角度成5°以上者之表现数及表现率。

给予后第12周的椎间盘高度减少率如图3所示。由其结果可知，椎间盘高度的平均减少率为45.4％，大大超过安全性上发生问题的可能性的数值(30％)。

此外，椎体后方打开角度成5°以上的结果并列示于表1中。如表1所示，可知在10单位给予组中，后方打开角度成5°以上者有33.3％。由此结果来看，认为10单位给予在脊髓不稳定性方面的风险高。

为了从非专利文献4所记载的、对狗的软骨素酶abc的给予量来推定对人有效的软骨素酶abc的给予量，用mri测定人及狗的髓核体积。

(参考例)用mri得到的髓核体积的比较

对于9名健康志愿者(男性6名，女性3名)及狗的分离标本(6例)，对第4腰椎与第5腰椎之间的椎间盘以mri进行t2权重影像成像(t2強調画像にて撮像)，测定髓核冠状截面影像的短径、长径、面积以及矢状截面影像的短径。髓核体积由mri影像的测量值算出(冠状截面面积×矢状截面面积)。结果表示于下表2中。

[表2]

值为平均值±标准偏差

5.结论

发现对于椎体后方打开角度成5°以上者，与10单位给予为33.3％相比，通过使给予量减半为5单位，可使表现率显著减轻至2％。

此外，与10单位给予的椎间盘高度平均减少率达到45.4％相比，通过使给予量由10单位减半为5单位，显示出可显著地抑制椎间盘高度的减少。

非专利文献3中虽然记载了给予量少的主旨(从将软骨素酶abc以每一椎间盘0.5单位给予至人类椎间盘内时没有发生迅速改善下肢痛来看)，但是并未进行关于副作用的详细考察，临床上有效的给予量不明。

依据本发明发现，以每一椎间盘1-8单位、优选1-5单位的范围给予，在以仅1次的给予发挥显著的疼痛改善效果的同时，可降低副作用；选择1-3单位的范围进行给予，可在发挥与更高用量(5u)同等的疼痛改善效果的同时，降低副作用。

另一方面，非专利文献4中记载了以下主旨：从即使以每一椎间盘0.5-1单位给予至狗的椎间盘内时没有发生迅速的髓核缩小来看，给予量过少。此外，非专利文献6中记载了以下主旨：因为椎间盘的运转状况依存于椎间盘的大小，动物模型的实验结果的分析需要设定缩放尺度(尺度化：scaling)。然后，由上述参考例可确认人类髓核体积比狗大70倍。有鉴于非专利文献4及非专利文献6的记载、以及人类髓核体积远大于狗的髓核体积这一事实，即使对人类给予35-70单位(0.5-1单位的70倍)时，推定给予量不足。

如此，从非专利文献4中记载的狗的实验结果所推定的对人类的给予量与本发明发现的给予量完全相异，非常难以预测对人类有效的给予量。

依据上述，发现通过将软骨素酶abc以每一椎间盘1-8单位给予至人类椎间盘内，副作用少、且能以1次的给予治疗椎间盘突出。

工业实用性

本发明可提供一种副作用少且仅一次的给予即得到长时间持续性的疼痛改善效果，在临床上发挥高治疗效果与安全性的椎间盘突出治疗剂。