本发明涉及一种具有祛皱美白作用的中药有效部位组合物及其制备方法，具体地说是从猪皮、黄芩、甘草和葛根中提取的中药有效部位组合物及其制备方法，属于中药领域。
背景技术：
：随着社会的发展、生活水平的提高和人类在卫生医疗事业方面的进步，人们对美的追求越来越高。但是，由于电脑辐射、户外紫外线照射、饮食因素以及生活压力等诸多影响，使人们的容颜受到伤害，面部出现皱纹和色斑等，影响人们身心愉悦，严重者甚至影响日常工作及生活。现有的衰老学说，如遗传衰老、线粒体受被氧化损伤、自由基积累过多、染色体端粒的损伤衰老、细胞核dna及细胞外胶原蛋白的胶联、皮肤干细胞衰老退化、光老化作用等，归纳起来皮肤的衰老影响因素有两点：一是自然性老化，即人体受遗传、内分泌等不可抗拒的生理进化因素的老化，随年龄增长的必然结果，二是环境作用老化，即人体受光福射、季节变迁、环境污染、不良生活习惯、生活压力、疾病等影响，皮肤出现干燥、粗糙、皱纹、松弛等现象。黑色素的形成过程：存在于黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化为真黑色素。进而，黑色素细胞组织将黑色素转移到表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，最后随角质化细胞脱落。但当黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，形成色斑等斑块。近年来由于科学技术的发展，西医皮肤除皱美白取得了许多成果，发明了许多除皱美白方法和技术，虽然这些方法见效快，疗效可靠，但大多是有创性的，存在一定的风险及副作用。目前，市面上流行的用于祛皱美白的产品很多，但大多效果不明显，而且有相当一部分添加化学合成的祛皱美白剂甚至还含有激素，如添加含铅汞化合物、氢醌等，具有很强的毒副作用，严重者甚至可以致癌，给使用者带来不良的心理反应和生活方面的伤害与影响。现代美容医学表明，皮肤衰老和凹凸不同程度的皱纹是多种内外因综合作用的结果。简而言之，具有光老化和自然老化之分，其中内因起主导和绝对的作用，中医所述的“心主神明，其华在面”，指的就是健康的心理与愉快的精神情绪，必然反映在面部荣光与愉悦。中医药祛皱驻颜，抗老防衰是以中医基本理论为指导的，并遵循整体观念之中医理论的精髓，同时中草药为纯天然的药物，无明显毒副作用，具有安全性高等特点。现代研究证明，猪皮胶原肽具有多种生物活性，如抗氧化功能、抗菌功能、ace转化酶抑制功能、抑制血小板凝结活性、抗肿瘤活性、促进皮肤愈合等作用。由于活性位点大多暴露出来，使得其相应的活性更强。而许多中药含有各种氨基酸、多糖、果胶、维生素、微量元素等多种成分，能够清除体内自由基，增强机体抗氧化能力，改善皮肤微循环，提高皮肤胶原纤维及胶原蛋白含量而具有除皱养颜，延缓皮肤衰老的作用。传统的具有祛皱美白作用的复方因有效成分含量低，用量大，效果不明显等缺陷已渐渐失去市场竞争力，消费者也较少购买此类产品。而相较于传统复方，具有祛皱美白功效的中草药有效部位的组合物具有天然无毒副作用的好处，又因是纯化了的有效部位，所以用量少且治疗效果好。专利内容本发明的一个目的在于提供一种具有祛皱美白作用的中药有效部位组合物；本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法和用途。本发明的第一目的：以猪皮胶原小肽及从黄芩、甘草和葛根中提取的总黄酮为原料，加入适当药用辅料，制成相关的剂型。本发明药物的组合物的原料药的组成及配比为：猪皮胶原小肽3～9重量份，黄芩、甘草和葛根总黄酮4～10重量份。本发明中药药物组合物优选的组成及配比为：猪皮胶原小肽6重量份、黄芩、甘草和葛根总黄酮8重量份。上述猪皮胶原小肽有效部位中猪皮胶原小肽的含量不低于50％，总黄酮有效部位中总黄酮含量不低于提取物的50％(w/w)。该药物组合物可以加入相应辅料，制成外用乳膏剂、凝胶剂中的任一种。然后可以再加入其他具有祛皱美白的有效部位、有效成分、化学合成品或者半合成品，然后再加入相应辅料，制成外用乳膏剂、凝胶剂中的任一种。本发明中药组合物的制备方法包括以下步骤：①猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽；其中猪皮胶原小肽的含量不低于50％；②黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化；其中，总黄酮含量不得低于总提取物的50％；③按照比例取上述胶原小肽、总黄酮，不加辅料或加入辅料，制成药学上可以接受的剂型。增加：树脂型号可以是：hpd500、hpd600、hpd300、d101、d301、ab-8等。①猪皮胶原小肽含量测定方法为：照紫外－可见分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录va)测定。对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.22mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取上述猪皮胶原小肽粉末约0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加水80ml，超声处理30min，放冷，加水至刻度，摇匀，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，再以微孔滤膜(0.22μm)滤过，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液[取福林试液储备液(1→16)]4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中反应5min，取出，置冷水浴中冷却10min，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录ⅴa)，以0号管为空白，在650nm波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵坐标，牛血清白蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。测定法精密量取供试品溶液0.6ml，照标准曲线的制备项下自“加入碱性铜试液1.0ml”起，依法测定吸光度，从回归方程中计算总肽的含量。本品含总肽量以牛血清白蛋白计不得低于50％。②黄芩总黄酮含量测定方法为：照高效液相色谱法(附录ⅵd)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。对照品溶液的制备取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取上述总黄酮有效部位中粉约0.3g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含黄芩苷(c21h18o11)不得少于9.0％。③甘草总黄酮含量测定方法：照高效液相色谱法(附录ⅵd)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。对照品溶液的制备取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％乙醇分别制成每1ml含甘草苷20μg。供试品溶液的制备取上述总黄酮有效部位粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含甘草苷(c21h22o9)不得少于0.50％。④葛根总黄酮含量测定方法：照高效液相色谱法(附录ⅵd)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(25：75)为流动相；检测波长为250nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于4000。对照品溶液的制备取葛根素对照品适量，精密称定，加30％乙醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含葛根素(c21h20o9)不得少于2.4％。经过发明人的对比优选后，确定了上述有效部位的最佳重量配比为：猪皮胶原小肽6重量份、黄芩、甘草和葛根总黄酮8重量份。按照比例取上述猪皮胶原小肽，黄芩、甘草和葛根总黄酮，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。本发明药物组合物可制成的剂型为外用乳膏剂、凝胶剂。以上所说的药剂学常规辅料包括硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液状石蜡、凡士林、三乙醇胺、丙二醇、尼泊金乙酯，表面活性剂，如十六烷醉、十二烷基硫酸钠，聚乙二醇类、卡波姆、西黄蓍胶、明胶、甘油、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，蒸馏水等。本发明有效部位组合物用于治疗祛皱美白。有益效果本发明中药组合物，是按传统中医药理论同时结合现代医学研究成果组方而成，具备中医学特色，同时符合现代医学的治疗原则。皱纹主要是皮肤自然老化与光老化的结果，与多种因素有关，如重力、肌肉/关节运动与吸烟等。随着年龄的增长，表皮角质层中的自然保湿因子(nmf)不断减少，皮肤的水合能力不断下降，导致皮肤组织细胞的水分减少，细胞皱缩、老化，出现细小皱纹。在各种因素的作用下真皮成纤维细胞数量减少，胶原类型比例倒置，真皮乳头层和网状层弹性纤维减少及退化，胶原纤维和弹性纤维的排列紊乱，导致皱纹产生。随着年龄的增长，皮下脂肪细胞容量减少，脂肪组织逐渐萎缩，导致真皮网状层下部及筋膜的纤维性小梁失去支撑，造成皮肤松弛，再加上地心引力的作用，使松弛的皮肤下垂，形成皱襞。此外，面部皱纹也与面部表情肌有关，表情肌附着于皮肤，当它收缩时皮肤可在与它收缩成直角处出现皱纹，并随岁月的增加而增多和加深。造成皮肤黑色素生成的原因有多种,如紫外线、废气、活性氧等环境因素。某些食物也是皮肤变黑的祸根,如富含铜、铁、锌等金属的食物易使人的皮肤变黑,这是因为这些金属可直接或间接地增加与黑色素生成有关的酪氨酸酶及多巴醌等物质的数量与活性。不少药物也会改变正常肤色,如氯喹对黑色素的亲和力特别强,会加重肤色变黑。不少疾病也会改变正常肤色,使其变黑,如营养不良性疾病,体内氧化与抗氧化平衡失调；内分泌失调；微生态失衡；代谢紊乱；机体微量元素含量异常等。本发明以传统中医理论为指导思想，同时结合国内外的相关研究成果，在祛皱美白方面效果显著。方中以猪皮为君药，猪皮味甘、性凉；有滋阴补虚,养血益气之功效；猪皮小肽的网状空间结构，能结合许多水，增强细胞生理代谢，有效地改善机体生理功能和皮肤组织细胞的储水功能，使细胞得到滋润，保持湿润状态，防止皮肤过早褶皱，延缓皮肤的衰老过程，故为君药。甘草味甘，平。归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。现代研究表明甘草具有较强的抑制酪氨酸酶的活性，并具有消炎、护肤、抗衰老、抗紫外线等作用，且甘草具有美白作用的成分，能显著地减少黑色素的生成，并具有较高的安全性，对人体皮肤无毒无刺激。黄芩味苦，寒。研究表明黄芩能提高sod活性，清除自由基，且与甘草同有抗紫外线辐射作用，以阻止皮肤老化，有利于皮肤再生与修复。葛根味甘、辛，凉，有解肌退热，生津止渴，透疹，通经活络的功效，研究表明葛根中的葛根素有清除皮肤中自由基、促进皮肤新陈代谢、减少色素沉着、润泽肌肤等作用，能祛斑美白。本发明产品成分明确，疗效稳定，用量小，安全性高，不仅符合传统中医药祛皱美白的组方原则，而且符合中药现代化的发展要求，对推动医药产业从仿制向自主创新转变以及对推动我国中药国际化具有重要意义。经查阅相关文献和专利，未检索到以猪皮胶原小肽及黄芩、甘草和葛根有效部位做为原料，生产加工并制成适宜药物制剂用于祛皱美白的报道。为进一步验证本发明的药理作用，用本发明片剂进行动物药效学实验。试验内容：祛皱功效的临床试验和美白功效的细胞生物学试验一、祛皱功效的临床试验1试剂、样品和受试对象1.1试剂分析纯试剂。1.2供试样品样品1：(本发明外用乳膏)取新鲜猪皮5kg，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；取黄芩、甘草、葛根药材共8kg，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。取猪皮胶原小肽60g，黄芩、甘草、葛根总黄酮80g，取硬脂酸60g、单硬脂酸甘油酯18g、液状石蜡30g、凡士林5g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺2g、丙二醇50g、尼泊金乙酯5g、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。样品2：(本发明凝胶剂)采用样品1制备的有效部位原料。取猪皮胶原小肽120g，黄芩、甘草、葛根总黄酮160g，取卡波姆94010g与聚山梨酯-802g及蒸馏水300ml混合均匀,氢氧化钠4g用适量蒸馏水溶解后加入上液，搅拌均匀，再将尼泊金乙酯1g溶于50g乙醇后逐渐加入搅匀，再加入猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位并搅拌均匀，即得凝胶剂。样品3：采用样品1制备的有效部位原料。取猪皮胶原小肽15g，黄芩、甘草、葛根总黄酮30g，取硬脂酸6g、单硬脂酸甘油酯2g、液状石蜡3g、凡士林1g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺0.4g、丙二醇5g、尼泊金乙酯0.5g、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。样品4：采用样品1制备的有效部位原料。取猪皮胶原小肽120g，黄芩、葛根总黄酮160g，芦荟苷100g，取硬脂酸120g、单硬脂酸甘油酯36g、液状石蜡60g、凡士林10g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺4g、丙二醇100g、尼泊金乙酯10g、猪皮胶原小肽，黄芩、葛根总黄酮，芦荟苷有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。给药前，取上述相应制剂，加相应基质配制成所需要的药物浓度。1.3受试对象受试对象主要来自志愿者，共180例。其中男88例，女92例，年龄41一70岁。将90例符合纳入标准的受试对象随机分为试验组(本发明组①②③④)、对照组和空白对照组，各30例。六组性别、年龄、皱纹程度经统计学检验差异无统计学意义(p>0.05)，具有可比性，见表1。表1六组性别、年龄、皱纹程度比较受试对象选择：皮肤皱纹分级标准：根据glogau分型法对皮肤皱纹进行分级，见表2。表2皮肤皱纹分级标准表纳入标准：①符合皮肤皱纹分级标准；②年龄40～70岁。排除标准：①过敏体质及对药物和硅胶成分过敏者；②3个月内应用过激光等其他除皱方法者；③原有严重心血管疾病，肝&肾功能及精神异常者；④面部有急性炎症或其他皮肤病。剔除及脱落标准：①未按规定用药，无法判定疗效者；②自行退出或未完成规定观察期而影响疗效判定者；③纳入病例因发生不良反应事件而不能继续接受试验者。2实验方法试验组使用本发明组(①②③④)，对照组使用已知有一定除皱作用的普通祛皱霜-全效新生霜(肇庆澳美日用化工有限公司产品，50g/盒)，空白对照组使用纯净水，分别于皮肤皱纹测试部位外涂，每日早晚各涂1次，使用周期为40天，试验前后均拍照进行皮肤皱纹等级及积分评价，同时用硅橡胶复制皮肤皱纹模型，应用图像分析软件对其进行分析处理。统计学处理：试验数据以表示，采用spss12.0软件包分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。观察指标:皮肤皱纹测定：采用硅橡胶光学测定法皱纹等级及积分评价:试验前后均在统一的标准条件下拍摄目外毗至发际之间的区域(crow'sfeet区)和前额照片，按预先制订的标准对照片上的皱纹进行评价。然后观察试验前后两张照片的crow'sfeet区和前额，并记录两个区域中的皱纹数量、深度、长度。crow'sfeet区的皱纹程度根据修正的daniell皮肤皱纹量表和glogau分型法对皮肤皱纹进行分级。皱纹积分(wrinklescore,ws)是将crow'sfeet区和前额部位每条皱纹深度分值(d)与长度分值(1)和每个区域的皱纹数分值(n)的乘积累加而来，每个区域最多选用5条皱纹，超过5条时选用分值最大的5条皱纹，取两个区域积分的平均值，见表3。表3皱纹积分标准3实验结果皮肤皱纹积分评价:试验组和对照组受试对象试验前的皱纹积分无统计学显著差异，具有可比性，与空白对照组比较具有极显著性差异。经使用本发明组(①②③④)和全效新生霜后，两组的皱纹积分均降低(p<0.05)，但以试验组的降低程度明显，优于对照组(p<0.05)。本发明组(③④)与本发明组(①②)有显著性差异，说明本发明药物所优选的处方组成和配比是具有突出特点的，本发明药物的处方组成不是简单的药味加减，而是起到协同增强的作用，有显著的祛皱效果。见表4表4六组试验前后皱纹积分结果二、美白功效的细胞生物学试验1试剂、仪器和样品1.1试剂(1)b16黑色素细胞株,中国科学院上海细胞研究所提供。(2)试剂:1640培养基,dl-多巴,酪氨酸酶,胰蛋白酶,均为美国sigma公司产品；二甲基亚砜(dmso),脱氧胆酸钠,上海化学试剂公司；小牛血清,杭州四季青生物工程有限公司；四甲基偶氮唑蓝(mtt),上海生物工程公司。1.2仪器主要仪器:uv-753分光光度计,酶联免疫检测仪。1.3供试样品上述本发明样品1、2、3、4。2实验方法2.1小鼠b16黑色素细胞培养用含质量分数为10％小牛血清的1640培养液在37℃,5％co2的条件下培养b16黑色素细胞,细胞接种量为3×106个/l,每3d传一次代。2.2细胞增殖率的测定选择对数生长期的b16黑色素细胞团块6个，用0.25％胰酶消化,调整细胞浓度为2×104个/ml,接种于96孔培养板,每孔180μl,置于37℃,5％co2的培养箱内培养24h。镜下观察生长状态良好的,分别加入试验组(本发明组①②③④)、对照组(维生素c精华液)和空白对照组(娃哈哈纯净水)溶液20μl/孔,继续培养48h。于结束前4h加入mtt30μl/孔,4h后弃上清液,然后加入dmso150μl/孔,振荡10min左右,用酶联免疫检测仪测定475nm波长处的吸光度。2.3细胞内酪氨酸酶活力测定取b16黑色素细胞接种于35cm2的培养瓶,接种量为6×105个/瓶,培养48h后更换成含试验组(本发明组①②③④)、对照组(氢醌)和空白对照组(娃哈哈纯净水)的培养基,继续培养48h,以不加活性物作为对照。0.25％胰酶消化后,用ph6.8的pbs(磷酸缓冲液)吹打成细胞悬液,低温离心后弃上清液,收获细胞团块。加入1ml0.5％的脱氧胆酸钠,冰浴15min,裂解细胞制备含酪氨酸酶提取液。取该提取液0.5ml,于37℃预温后加入0.3％多巴溶液0.5ml,37℃水浴反应5min,用紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。3实验结果3.1细胞增殖率的测定实验结果表明,六组对b16黑色素细胞增殖率均有不同程度的抑制作用。本发明组①②对细胞增殖的抑制作用较本发明组③④显著,其抑制率分别为，而③④组的抑制率只有，阳性对照氢醌的抑制率为，表明本发明组①②对细胞增殖的抑制效果比阳性对照氢醌还要好，说明本发明组①②所优选的处方组成和配比是具有突出特点的，本发明药物的处方组成不是简单的药味加减，而是起到协同增强的作用，有显著的美白效果。结果见表5表5六组受试物对b16黑色素细胞增殖的抑制率(％)活性物抑制率本发明组①54.3本发明组②51.7本发明组③34.5本发明组④29.7对照组49.1空白对照组13.43.2细胞内酪氨酸酶活力测定实验结果表明,测定b16黑色素细胞在六组样品作用后各瓶细胞内酪氨酸酶的活性,由表2可看出,本发明组①②对b16黑色素细胞酪氨酸酶活性的抑制作用明显低于本发明组③④,其抑制率分别为，而③④组的抑制率分别为，阳性对照氢醌的抑制率为，表明本发明组①②对b16黑色素细胞酪氨酸酶活性的抑制作用比阳性对照氢醌还要小，说明本发明组①②所优选的处方组成和配比是具有突出特点的，本发明药物的处方组成不是简单的药味加减，而是起到协同增强的作用，有显著的美白效果。结果见表6表6不同天然活性物对b16黑色素细胞酪氨酸酶活性的抑制率(x±sd,n＝3)具体实施方式以下通过具体实施例来进一步阐明本发明的技术方案，但是本发明申请所要保护的内容不仅仅如此。实际生产中的用量不仅限于实例中的药物用量，可以用吨、千克、克等计量单位，但是各原料药物的用量配比仍依据本方明的技术方案。实施例1：处方：猪皮胶原小肽30g，黄芩、甘草、葛根总黄酮40g制法：猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。其中，黄芩素的含量为0.1％～3.0％，黄芩苷的含量为18％～32％，甘草苷的含量为1.0％～5.0％，葛根素的含量为5.0％～10.0％；取上述各有效部位，另取硬脂酸60g、单硬脂酸甘油酯18g、液状石蜡30g、凡士林5g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺2g、丙二醇50g、尼泊金乙酯5g、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。实施例2：处方：猪皮胶原小肽900g，黄芩、甘草、葛根总黄酮1000g制法：猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。其中，黄芩素的含量为0.03％～0.10％，黄芩苷的含量为6.0％～10％，甘草苷的含量为0.35％～1.20％，葛根素的含量为1.2％～4.0％。取上述各有效部位，另取卡波姆940100g与聚山梨酯-8020g及蒸馏水3000ml混合均匀,氢氧化钠40g用适量蒸馏水溶解后加入上液，搅拌均匀，再将尼泊金乙酯10g溶于500g乙醇后逐渐加入搅匀，再加入猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位并搅拌均匀，即得凝胶剂。实施例3：处方：猪皮胶原小肽600g，黄芩、甘草、葛根总黄酮700g制法：猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。其中，黄芩素的含量为0.03％～0.10％，黄芩苷的含量为6.0％～10％，甘草苷的含量为0.35％～1.20％，葛根素的含量为1.2％～4.0％。取上述各有效部位，另取硬脂酸1200g、单硬脂酸甘油酯360g、液状石蜡600g、凡士林100g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺40g、丙二醇1000g、尼泊金乙酯100g、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。实施例4：处方：猪皮胶原小肽6kg，黄芩、甘草、葛根总黄酮8kg制法：猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。其中，黄芩素的含量为0.03％～0.10％，黄芩苷的含量为6.0％～10％，甘草苷的含量为0.35％～1.20％，葛根素的含量为1.2％～4.0％。取上述各有效部位，另取硬脂酸12kg、单硬脂酸甘油酯3.6kg、液状石蜡6kg、凡士林1kg置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺0.4kg、丙二醇10kg、尼泊金乙酯1kg、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。实施例5:处方：猪皮胶原小肽450g，黄芩、甘草、葛根总黄酮850g制法：猪皮胶原小肽的制备：取新鲜猪皮，刮去脂肪层，洗净，-10℃冷冻24h，切片机切碎，加入10倍量2％碳酸钠溶液脱脂5h，滤去溶液，水洗至中性，加10倍量水加热煮沸15min，匀浆5min，待冷至约40℃，以10％盐酸调节ph1.5～2.0，加入底物量5％左右胃蛋白酶，在40℃条件下保温酶解4h，然后以10％氢氧化钠溶液调节ph7.5～8.0，加入底物量5％左右的胰蛋白酶，在50℃条件下保温酶解4h，时时搅拌并调节ph在7.5～8.0范围内，酶解完毕后继续升温煮沸10min，离心，取上清液加硅藻土至浓度为5g/l，搅匀，以1μm微孔滤膜滤过，滤液用相对分子质量为3kda的中空纤维膜进行超滤，收集相对分子质量小于3kda的酶解液，超滤液减压浓缩至肽浓度为20g/l时，以10％盐酸调ph4.5～5.5，控制操作电压为30v，上样流速为50l/h进行电渗析脱盐处理，肽脱盐液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15，干燥，得猪皮胶原小肽(含量不低于50％)；黄芩、甘草、葛根总黄酮的制备：取黄芩、甘草、葛根药材，粉碎成粗粉，加入药材重量8倍的70％乙醇，60℃水浴回流2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量与药液比例为1:1通过大孔树脂柱，药液吸附流速0.5bv/h,上样液ph6；先以8倍量去离子水洗脱，洗脱流速为1bv/h，再用4bv70％乙醇进行洗脱，洗脱流速为1bv/h，收集4bv的洗脱液；减压条件下浓缩，蒸干，得总黄酮；再采用55℃碱液和95％乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化(总黄酮含量不得低于总提取物的50％)。其中，黄芩素的含量为0.03％～0.10％，黄芩苷的含量为6.0％～10％，甘草苷的含量为0.35％～1.20％，葛根素的含量为1.2％～4.0％。取上述各有效部位，另取硬脂酸1200g、单硬脂酸甘油酯360g、液状石蜡600g、凡士林100g置容器内，加热至熔化，继续加热至70℃～80℃，作为油相；另取三乙醇胺40g、丙二醇1000g、尼泊金乙酯100g、猪皮胶原小肽，黄芩、甘草、葛根总黄酮有效部位及蒸馏水，加热至70℃～80℃，保持恒温，作为水相；将油相缓缓倒入水相中，边加边搅拌，至乳化完全，放冷，即得乳膏剂。实施例6：取实施例1所制乳膏剂治疗25位面部有皱纹患者。治疗方案：将乳膏于皮肤皱纹测试部位外涂，每日早晚各涂1次，使用周期40天为1个疗程，2个疗程后进行治疗前后皮肤皱纹等级及积分评价，结果见表7表7实施例1乳膏治疗前后皱纹积分结果结果表明：实施例1乳膏能明显改善皱纹患者面部的皱纹，达到了祛皱的显著效果。实施例7：取实施例2所制乳膏剂治疗12位面部有斑块的患者。治疗方案：将乳膏于皮肤斑块处测试部位外涂，每日早晚各涂1次，使用周期40天为1个疗程，2个疗程后观察治疗前、治疗后色斑颜色变化情况。疗效评定方法如下：(1)基本治愈:肉眼察色的消退斑面积>90％,皮损的颜色能够基本消失；(2)显效:肉眼察色的消退斑面积>60％,皮损的颜色明显能够变淡；(3)有效:肉眼察色的消退斑面积>30％,皮损的颜色能够变淡；(4)无效:肉眼察色的消退斑面积<30％,皮损的颜色变化不怎么明显；结果如下：表8实施例2乳膏治疗结果(位)药物无效有效显效基本治愈实施例1乳膏21064表9实施例1乳膏的治愈率(％)药物无效率有效率显效率基本治愈率实施例2乳膏17834934结果表明：实施例2乳膏对民不有斑块的患者有显著的治疗效果，基本治愈率为34％，总有效率为83％。当前第1页12