本发明涉及光学成像与图像处理模式识别领域，涉及一种瞬时正交光学投影层析成像系统。
背景技术：
：揭示生命的本质、关注人类健康是当代科技发展的主线。通过对生物样本进行成像来研究样本的结构特点和生理功能，可达到为医学临床诊断提供客观依据的目的。光学投影层析成像(OpticalProjectionTomography，OPT)技术将CT技术和显微技术相结合，能对荧光和非荧光物质进行三维成像的新技术。OPT具有比核磁共振更高的分辨率，可达微米量级；具有比共焦显微成像更大的成像深度，能够对厚达十几毫米的样品进行成像，也可以利用彩色或荧光染料对样本进行组织特异性或基因特异性着色处理。OPT成像时，先采集样品不同断层在不同角度下的投影数据，再由计算机对这些数据运用Radon逆变换来重组图像。OPT在组织发育、基因表达、以及医疗诊断等方面的研究中具有重要价值。了解生物系统不仅需要研究细胞的空间分布，还需要研究它们随时间的动态变化。研究细胞的动态即细胞的移动情况，这对研究疾病变化、癌症转移是极为重要的。组织中被迫坏地方会有炎症反应，免疫细胞会发生变化，这时白细胞会增多。细胞移动情况可以依据组织内的三维模型展开。在染病的模型中，研究活体生物体内细胞移动，这对生物医药机理研究具有重要的现实意义。在生物样本方面，斑马鱼幼体已经被用来作为炎症研究重要模式生物，因为它有较短的生殖周期，胚胎具有透明度，容易进行药物试验，可以利用基因和分子的处理进行一系列操作。另外，斑马鱼的透明特征使完整的生物体的生理和病理过程变得可视化，有助于进一步了解生物对生病和受伤的全部反应。因此，出现了一些利用荧光显微法对斑马鱼体内子区域细胞移动进行二维和三维成像的研究，但是目前为止对整条斑马鱼进行时间延迟细胞追踪技术还没有相关报道。针对我国生物医药领域的发展和对高精度研究生物功能信息的需求，为了更好的研究疾病发展、生命活动及药物作用，本发明提出利用角度复用的OPT系统对斑马鱼体胚胎内的中性粒细胞进行三维跟踪和形态学特征提取，希望得到较高的时间延迟分辨率，降低对样本的光辐射。利用瞬时正交成像技术(在相互垂直的CCD同时采集两幅图像)来定位和跟踪细胞的运动。研究细胞检测与识别算法，提取细胞的多参量形态学特征。为生物组织研究和医药运行机理提供新的技术手段和思路。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种高精度瞬时正交光学投影层析成像系统。为了达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：将一个转基因突变的斑马鱼胚胎作为一个标准模型，标准模型是透明的，并且体内中性粒细胞中能表达出绿色荧光蛋白；对活体内中性粒细胞移动进行延时成像；转基因突变的斑马鱼胚胎放入在胚胎培养液中培养，在受精几天后嵌入到低熔点琼脂，低熔点琼脂用于增加水的黏度，阻止麻醉的转基因突变的斑马鱼胚胎的运动，低熔点琼脂内含麻醉剂；转基因突变的斑马鱼胚胎在麻醉后，被吸入透明的FEP氟化乙丙烯管子，在成像前，弄伤尾巴，提供了一个炎症刺激，形成一个样本；高精度瞬时正交光学投影层析成像系统包括有：散射片、光学快门、激光器、旋转台、EF滤光片A，L1镜筒透镜A、可调光阑A、L2镜筒透镜A、CCD相机A、EF滤光片B、L1镜筒透镜B、可调光阑B、L2镜筒透镜B、CCD相机B、采集装置、电动控制快门、控制模块、光学感应模块、数据存储模块、匹配模块，查询模块；控制模块用Labview编程语言编程控制的部件有光学快门、旋转台、CCD相机A和CCD相机B，样本悬浮在一个装满水的容器里，将装满水的容器固定在旋转台上，用一个473nm，25mw激光器用作宽场激发；宽场激发出的荧光在CCD相机A、CCD相机B上成像；用L1套筒透镜A和L2套筒透镜A作为消色差双合透镜在正交投影角度通过激发滤光片A产生的合适的视场和放大率；用L1套筒透镜B和L2套筒透镜B作为消色差双合透镜在正交投影角度通过激发滤光片B产生的合适的视场和放大率；用分别位于L1套筒透镜A和L1套筒透镜B焦平面上的调节光阑A和调节光阑B，从而产生一个有效采集数值孔径，与透明的FEP氟化乙丙烯管子的内直径近似匹配；一个电动控制快门直接放置在激光器后避免投影采集期间的曝光；采集装置的参数设置和硬件控制通过编程进行实现，并包括有数据采集板、信号发生器；数据采集板的电平信号可以通过信号发生器进行同步触发；控制模块，用于根据查询模块的数据进行控制信号发生器；光学感应模块，用于曝光后收集CCD相机A和CCD相机B的瞬间曝光信息，并且反馈给数据存储模块；光学感应模块用于获取根据CCD相机A和CCD相机B在样本区域下拍摄的曝光数据；数据存储模块，通过光学感应模块收集的信息，用于存储不同的帧数模式产生的全部或部分曝光数据，其中，根据实际需要的帧数形成不同的帧数标识进行分类，并且存储为列表，在列表中，每个不同的帧数标识的曝光数据作为列表的行，存储在数据链表中；匹配模块，用于根据请求中从数据链表开始查找匹配，将请求与数据链表的不同的帧数标识进行匹配，直到匹配到与不同的帧数标识的曝光数据为止，并把匹配到的曝光数据进行排序；查询模块，根据匹配模块得到的排序的数据，建立根据实际需要的帧数而形成不同的帧数标识的一系列子列表以供参考，从而能减少CCD相机A和CCD相机B的瞬间曝光的反应时间，增加智能性；CCD相机A和CCD相机B实现同步采集，设置均为外触发模式，允许来自数据采集板的电平信号的同步触发；为了延时采集，电动控制快门打开，CCD相机A和CCD相机B由信号发生器给出信号给控制模块，由控制模块进行控制工作；一旦CCD相机A和CCD相机B的曝光时间得到满足，电动控制快门关闭，CCD相机A和CCD相机B里的数据循序地被读出形成图像，图像被保存，旋转台切换到下一个角度；最后在用户定义的延迟时间里，再按预期设定的循环步骤重复进行。附图说明图1为高精度瞬时正交光学投影层析成像系统结构图。具体实施方式为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：实施例1：旋转式瞬时正交成像三维跟踪系统，对活体模式动物的免疫细胞(如：中性粒细胞)进行三维跟踪，努力提高时域精度。相对传统三维跟踪对样本做每个时间点的三维成像，本发明利用瞬时正交成像系统实现了对样本进行三维跟踪的最小光辐射(最小光漂白和光毒性)，对生物活体的伤害小，为生物、医学、医药研究提供了新的技术手段，具有重要的应用价值。并在正交投影角度来实现基于时间延迟的转基因斑马鱼胚胎中性粒细胞的三维跟踪。利用光与生物组织的相互作用进行成像，一直备受青睐，因为光学成像具有对组织干扰小，灵敏度高，信息丰富(可多参数联合测量，这些参数包括结构、频谱、偏振、量子效应和寿命等)，可达亚细胞层次分辨率水平，适于离体或活体实时成像，便于与其他技术如超声结合使用，以及具备直接治疗的潜能等优点。光与组织的相互作用机制非常丰富，有反射、散射、吸收、荧光等，这些光学现象均可用于提取组织中的相关信息，从而产生基于它们的各种成像方法，使得光学方法成为生物组织成像里研究最为活跃、发展最为迅速的领域。但是，由于生物组织的不均匀性，对光波有吸收和强散射，因此光波很难深入组织内部，更难以从生物组织中提取出清晰的图像。为了解决这个难题，近年来人们发展了一系列光学成像方法。例如：共聚焦/多光子光学成像技术、光学相干层析成像(OpicalCoherenceTomography，OCT)、光片显微仪(LightSheetMicroscopy，LSM)、扫描激光光学断层扫描(ScanningLaserOpticalTomography，SLOT)、光学投影层析成像(OPT)等。这些医用成像技术手段有各自的适用范围和各自的局限性，表1列出几种常用成像技术的优缺点。成像方式空间分辨率探测深度成像技术成本适用对象XCT0.7-2.0mm无限非光学成像较高＞cm宏观样本PET4-6mm无限非光学成像较高＞cm宏观样本UI＞100μm20-30mm非光学成像较高＞cm宏观样本MRT＞1mm100μm以下非光学成像最高＞cm宏观样本OCTμm量级1-5mm范围光学成像较低mm-cm介观样本OPTμm量级～10mm范围光学成像较低mm-cm介观样本表1常用生物医学成像技术参数比较当前进行能够对mm-cm量级生物对象进行三维光学成像的方法有：OPT、SLOT、LSM。LSM相对成像速度快，但成像的精度方向各异性，提取的图像信息容易模糊。OPT和SLOT，结构简单容易操作，成像精度各方向同性。但OPT是宽场成像方式，通过全场照明激发用CCD采集投影成像，采集速度更快。SLOT是通过单点激发和探测而成像。生物医学三维成像为生物和医学研究提供了新的技术手段。研究活体内细胞的动态分布(三维跟踪)是生物医学成像领域一个非常有意义的课题，为探测疾病的变化和研究药物的作用机理提供了新的技术手段。目前为止，细胞三维跟踪已经利用显微镜实现，需要在每个时间点获取三维体积信息。共聚焦/多光子激光扫描显微提供了光学切片，这些光学切片有利于荧光标记细胞三维图像堆栈的获取。这个方法被用于基于高分辨率研究斑马鱼的有炎症小区域的中性粒细胞，比如：尾巴受伤的模型，大约100μm视场。然而，事实上大多数激光扫描显微镜在穿透深度和视场上受到限制，他们本质上展示出各项异性的分辨率，可以扩展到整个样本的介观成像，但需要高的激发功率和长的图像采集时间。我们可选择一些针对mm-cm量级生物组织的三维成像技术，这些技术得益于全场图像采集，包括光学投影层析成像(opticalprojectiontomography)和光片显微技术(lightsheetmicroscopy)。这些技术能够直接扩展到三维体积成像，例如：在每个时间点获取整个样本的体积。利用激光扫描显微成像中已经改进和实现的算法直接来实现三维时间延迟特征的跟踪。遗憾的是，体积成像需要获取每个时间点上针对LSM的满堆栈图像或者针对OPT的满序列投影。毫米量级体积实现细胞级分辨率需要超过100帧每体积。这限制了时间延迟分辨率，这些特征在这段体积获取时间移动了有效的距离。而且，在每个时间点获取几百个图像，结果是在整个时间过程中对样本的大量的光辐射，这也将导致光漂白或光毒性使得活体研究大打折扣。本发明用改进的OPT采集方案，跟踪一个疾病模型(如：斑马鱼胚胎)的细胞移动是特别方便的。实施例二：提出一种瞬时正交成像技术进行体内稀疏分布的细胞三维跟踪，拟利用光学投影层析成像得到较高的时间延迟分辨率。与传统的三维跟踪技术需要对每个时间点作三维立体空间采集不同，本发明拟降低对样本的光辐射。并利用角度复用OPT系统在不同投影角度同时采集两幅正交图像，拟采用高达相机帧率的时间去定位和跟踪特征目标。将样本放置在旋转台，调焦两个正交成像臂到旋转轴，选择合适的系统部件参数，激光器、CCD、电动控制快门、滤光片，光阑，透镜等，搭建双轴瞬时正交OPT成像系统。样本准备，将一个转基因突变的斑马鱼胚胎作为一个标准模型。该模型是透明的，并且其体内中性粒细胞中能表达出绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)。对其体内细胞移动进行时间延时成像。胚胎在胚胎培养液中培养，在受精几天后嵌入到低熔点琼脂，内含麻醉剂。斑马鱼胚胎在麻醉后，吸入透明的FEP管子。该容器与水的折射率相似，能够用于成像应用的折射率匹配容器。加入琼脂是为了增加水的黏度，阻止麻醉的斑马鱼胚胎的运动。可以在成像前，弄伤尾巴，提供了一个炎症刺激。通过发明，通过调焦两个正交成像臂到旋转轴(见图1)，搭建角度复用光学投影层析成像(OPT)系统。双图像采集系统的实验设置如图1描述。将样本放在一个旋转台，悬浮在一个装满水的小容器来提供折射率匹配。可以用一个473nm，25mw激光器用作宽场激发。发出的荧光在两个CCD相机(根据实际需要选择合适参数)上成像。用两个同样的成像系统(L1：消色差双合透镜，L2：消色差双合透镜和可调节孔径)在正交投影角度通过合适的滤光片产生的合适的视场和放大率。采集数值孔径用透镜L1焦平面上的光阑调节，产生一个有效采集数值孔径，与FEP(氟化乙丙烯)管子的内直径近似匹配。一个电动控制快门直接放置在激励源激光器后避免投影采集期间的曝光。采集装置参数设置和硬件控制通过LabVIEW2010软件编程实现。通过2个CCD实现同步采集，两个相机设置为外触发模式，允许来自数据采集板的TTL信号的同步触发。为了延时采集，激发快门打开，CCD相机由信号发生器触发。一旦CCD曝光时间满足，快门关闭，CCD相机数据循序地被读出，图像被保存，旋转台切换到下一个角度。在用户定义的延迟时间，这个步骤按预期设定的循环步骤重复进行。本发明采用非常完备的实验条件：488nm激光器(200mw)、561nm激光器(200mw)、多个光谱仪、CCD、光电倍增管、探测器、电动位移台、控制器、功率计、示波器、荧光显微镜系统、工作站等；控制模块，用于根据查询模块的数据进行控制信号发生器；光学感应模块，用于曝光后收集CCD相机A和CCD相机B的瞬间曝光信息，反馈给数据存储模块；光学感应模块用于获取根据CCD相机A和CCD相机B在样本区域下拍摄的曝光数据；数据存储模块通过光学感应模块收集的信息，用于存储不同的帧数模式产生的曝光数据，其中，根据实际需要的帧数形成不同的帧数标识进行分类，并且存储为列表，在列表中，每个不同的帧数标识的曝光数据作为列表的行，存储在数据链表中；匹配模块，用于根据请求中从数据链表开始查找匹配，直到匹配到与不同的帧数标识的曝光数据为止，并把匹配到的曝光数据进行排序；查询模块，根据匹配模块得到的排序的数据，建立根据实际需要的帧数而形成不同的帧数标识的一系列子列表以供参考，减少CCD相机A和CCD相机B的瞬间曝光反应时间；CCD相机A和CCD相机B实现同步采集，设置均为外触发模式，允许来自数据采集板的电平信号的同步触发；为了延时采集，电动控制快门打开，CCD相机A和CCD相机B由信号发生器给出信号给控制模块，由控制模块进行控制工作；一旦CCD相机A和CCD相机B曝光时间得到满足，电动控制快门关闭，CCD相机A和CCD相机B里的数据循序地被读出形成图像，图像被保存，旋转台切换到下一个角度；在用户定义的延迟时间里，再按预期设定的循环步骤重复进行。有益效果：通过本发明实现对斑马鱼胚胎内中性粒细胞的三维跟踪。采集速度达到相机帧速率、对生物样本光辐射小，得到细胞的位置变化和形态学特征。为下一步数据分析奠定基础。分析中性粒细胞结构、形态学特征、运动轨迹与炎症和药物作用的相互关系，为研究疾病变化和药物机理奠定实验与理论基础。以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关
技术领域：
的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。当前第1页1 2 3