一种肉桂多酚组合物的应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种肉桂多酚组合物的应用。
背景技术：
：病毒是人和动物体的重要病原体。据统计，目前80％以上的传染病是由病毒引起的。许多非传染性疾病也与病毒感染有关。目前针对病毒性传染病的防治主要以抗病毒药物及特异性疫苗的应用为主。然而多数病毒性疾病至今尚无特效药物，能够应用疫苗进行防治的病毒性疾病也非常有限。病毒的变异也使有些疫苗的临床效果受到一定影响。迄今为止，病毒性疾病仍然是医学界感到棘手的一类疾病。中医药对某些病毒性疾病的治疗(如艾滋病、病毒性感冒与麻疹、疱疹、乙型病毒性肝炎等等)显示出一定的优势。在2003年的SARS治疗过程中，中医药以其独特的疗效引起世界的关注，并得到世界卫生组织(WHO)专家的肯定(罗云坚、罗翌、李际强，广州中医药大学学报，2005，22(3)：246-249)。因此，开发一种能解决上述问题的产品是非常必要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种肉桂多酚组合物的应用。本发明的目的是这样实现的，所述的肉桂多酚组合物在制备预防和/或治疗病毒感染疾病药物或药械中的应用。肉桂是我国常用中药材，始载于《神农本草经》，列为上品，历代重要本草均有记载。传统中医认为，肉桂性辛、甘、热，归肾、脾心、肝经，具有补火助阳、散寒止痛、温通经脉之功效。桂皮为少常用中药，功用同肉桂，唯药力较小，作为香料和调味品广泛应用。此外，肉桂的嫩枝(桂枝)亦供药用。《中国药典》规定肉桂为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物肉桂(C.cassia)的干燥树皮。但由于各地用药习惯不同，许多地区将多种植物的枝皮代肉桂使用。桂皮的基源则更多。据调查，市场上肉桂及桂皮类商品药材还涉及同属的大叶清化桂(C.cassiavar.macrophyllum)、锡兰肉桂(C.zeylanicum)、华南桂(C.austrosinense)、钝叶桂(C.bejolghota)、阴香(C.burmanni)、天竺桂(C.japonicum)、银叶桂(C.mairei)、香桂(C.subavenium)、柴桂(C.tamala)、川桂(C.wilsonii)等多种植物(楼之岑、秦波，常用中药材品种整理和质量研究北方编第1册，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995，203-251)。由于药材性状相似，鉴别较为困难，实际常有混用的情况。研究表明肉桂中主要含有挥发油、单萜、倍半萜、二萜、皂苷、香豆素、多酚等多种类型的化合物。肉桂及其所含的成分具有多方面的药理作用。研究多集中于抗菌、抗氧化、降血糖、抗醛糖还原酶、抗炎、抗补体、抗肿瘤活性，以及对消化系统、心血管系统、免疫系统、中枢神经、内分泌系统的调节作用(赵凯，内蒙古医科大学硕士学位论文，肉桂的化学成分及其质量控制研究，2013)。本发明公开了肉桂多酚组合物的抗病毒活性。基于中红外光谱指纹图谱和总鞣质、总糖含量测定技术建立了肉桂多酚组合物的质量控制方法。经研究证实，符合本发明质量控制要求的肉桂多酚组合物具有显著的抗病毒活性。本发明中的肉桂多酚组合物，具有药效物质基本明确，质量可控，药效更强的特点，适应现代制造业的工艺技术和质量标准化要求。附图说明图1为本发明实施例4中12批肉桂多酚组合物样品红外指纹图谱叠加示意图；图2为肉桂多酚组合物对照指纹图谱；图3为小鼠28天存活水平示意图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明肉桂多酚组合物的应用为所述的肉桂多酚组合物在制备预防和/或治疗病毒感染疾病药物或药械中的应用。所述的病毒为副黏液病毒、疱疹病毒、逆转录病毒和流感病毒。所述的药械为空气滤器。所述的肉桂多酚组合物由以下方法测定红外光谱指纹图谱，其指纹图谱与肉桂多酚组合物对照图谱的相似度不低于0.90，测定方法如下：取2mg干燥的肉桂多酚组合物样品和100mg溴化钾(Kbr)，充分研磨均匀，压制成均匀透明的样品片，采用德国布鲁克(Bruker)TENSOR27红外光谱仪，以溴化钾为空白背景进行中红外光谱检测，测定范围4000～400cm-1，扫描次数10次，光谱分辨率4cm-1。采用Excel对导出的红外光谱数据(dpt格式)进行处理，以肉桂多酚组合物对照指纹图谱为参照，相关系数法计算2000～400cm-1范围的相似度，相似度计算公式：式中，xi，yi为2组光谱数据的对应点；分别代表2组光谱数据的平均值。所述的肉桂多酚组合物中的总鞣质量含量不低于15％；其测定方法如下：对照品溶液的配制：精密称取没食子酸50mg置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，取5mL溶液置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(C＝0.05mg/mL)。标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置25mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸溶液1mL，再分别加水11、10、9、8、7、6mL，用20％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。总酚：精密量取供试品溶液2mL，置25mL棕色量瓶中，按标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液25mL，加至已盛有干酪素400mg的100mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，同时用水做一份干酪素空白实验。精密量取续滤液2mL，置25mL棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量所述的肉桂多酚组合物中的总糖含量不低于25％；其测定方法如下：对照品溶液的配制：精密称取10mg葡萄糖对照品置100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，溶解，即得0.1mg/mL的对照品溶液。标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分别置20ml刻度试管中，各加水至2.0mL，摇匀，加5％的苯酚溶液1mL，室温下快速加入浓硫酸5mL，冷却10min，混匀后放置20min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。取肉桂多酚组合物供试品溶液1mL置20mL刻度试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算总糖含量，即得。所述的肉桂多酚组合物中总鞣质量含量不低于15％，总糖含量不低于25％。所述的肉桂多酚组合物是以樟属植物为原料经前处理、提取、后处理制备得到，具体包括以下步骤：A、前处理：将原料樟属植物进行干燥、粉碎过筛得到物料a备用；B、提取：将物料a置入提取罐，加入物料a重量2～30倍水，于4～80℃提取1～3次，每次1～24h，滤过，滤液浓缩得到浓缩液b；C、后处理：将浓缩液b加入到酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值为1～5，静置，取沉淀部分得到目标物肉桂多酚组合物。所述的樟属植物为肉桂(C.cassia)、大叶清化桂(C.cassiavar.macrophyllum)、锡兰肉桂(C.zeylanicum)、华南桂(C.austrosinense)、钝叶桂(C.bejolghota)、阴香(C.burmanni)、天竺桂(C.japonicum)、银叶桂(C.mairei)、香桂(C.subavenium)、柴桂(C.tamala)、川桂(C.wilsonii)中的一种或几种。所述的樟属植物为肉桂(C.cassia)、大叶清化桂(C.cassiaVar.macrophyllum)、锡兰肉桂(C.zeylanicum)。所述的樟属植物为肉桂、大叶清化桂和锡兰肉桂，其重量配比为0～3∶0～3∶0～3。所述的樟属植物为肉桂、大叶清化桂和锡兰肉桂，其重量配比为1～3∶1～3∶0～3。所述的樟属植物为肉桂、大叶清化桂和锡兰肉桂，其重量配比为1～3∶1～3∶1～3。所述的原料樟属植物为肉桂、大叶清化桂和锡兰肉桂，其重量配比为1∶1∶1。所述的原料樟属植物为肉桂和大叶清化桂，其重量配比为1∶1。所述的原料樟属植物为肉桂和锡兰肉桂，其重量配比为1∶1。所述的原料樟树植物为大叶清化桂和锡兰肉桂，其重量配比为1∶1。所述的原料为樟属植物的树皮和/或枝条。本发明所述的肉桂多酚组合物的应用中的肉桂多酚组合物的药物制剂为所述的肉桂多酚组合物中加入药学上可接受的辅料制备成片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸、分散片、口腔崩解片、微丸剂、喷剂、膜剂、软膏剂或凝胶剂。下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：实施例1肉桂多酚组合物的制备肉桂多酚组合物1的制备：将肉桂树皮粉碎，以10倍量水，常温浸泡提取3次，每次2小时。滤过，取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至3，静置。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物1。肉桂多酚组合物2～12的制备：分别取大叶清化桂、锡兰肉桂、华南桂、钝叶桂、阴香、天竺桂、银叶桂、香桂、柴桂、川桂的树皮以及肉桂的枝条，粉碎，以10倍量水常温浸泡提取3次，每次2小时。滤过，取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至3，静置。取沉淀部分，分别得肉桂多酚组合物2～12。肉桂多酚组合物13的制备：将肉桂树皮粉碎，以2倍量水，4℃冷浸提取1小时。取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至5，滤过。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物13。肉桂多酚组合物14的制备：将肉桂树皮粉碎，以30倍量水，80℃搅拌提取3次，每次24小时。取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为3的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至1，离心。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物13。肉桂多酚组合物15的制备：将肉桂树皮粉碎，以石油醚回流脱脂，脱脂后的肉桂粉以30倍量60％乙醇70℃提取2.5小时，提取液回收乙醇，以配成浓度为1.2mg/mL的水溶液，调pH值4.0，过AB-8大孔树脂柱，先用水洗除杂质，再用80％乙醇洗涤，收集80％乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥，得肉桂多酚组合物15。肉桂多酚组合物16的制备：将肉桂树皮、大叶青化桂树皮按质量1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常温浸泡提取3次，每次2小时。滤过，取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至3，静置。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物16。肉桂多酚组合物17的制备：将肉桂树皮、锡兰肉桂树皮按质量1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常温浸泡提取3次，每次2小时。滤过，取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至3，静置。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物17。肉桂多酚组合物18的制备：将肉桂树皮、大叶青化桂树皮、锡兰肉桂树皮按质量1∶1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常温浸泡提取3次，每次2小时。滤过，取滤液，浓缩，浓缩液加入pH为6的酸性磷酸盐缓冲液中，以盐酸调pH值至3，静置。取沉淀部分，即得肉桂多酚组合物18。以上肉桂多酚组合物1～18经测定，红外指指纹图谱与肉桂多酚组合物对照指纹图谱的相似度均大于0.90，且总鞣质含量大于15％，总糖含量大于25％。肉桂多酚组合物为肉桂的主要活性成分，针对其多方面的物理化学性质(如酚羟基的弱酸性，大孔树脂柱的保留行为等)，可以由不同的方法提取纯化。实施例2肉桂多酚组合物总鞣质含量的测定1、实验材料仪器：UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；5510E-DTH超声仪(美国必能信公司)；Milli-Q超纯水机(Millipore公司)；SW22恒温震荡仪(美国优莱博公司)；CP225D电子分析天平(赛多利斯公司)。试药：钨酸钠(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)、钼酸钠(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)、硫酸锂(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、碳酸钠(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、盐酸(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、磷酸(分析纯，广东光华化学厂有限公司)；干酪素(BR，上海麦克林生化科技有限公司)；没食子酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；肉桂多酚组合物(昆药集团股份有限公司自制)。2、溶液配制磷钼钨酸溶液的制备：取钨酸钠100g、钼酸钠25g，置1000mL的圆底烧瓶中，加水700mL使溶解，加盐酸100mL、磷酸50mL，加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂150g、水50mL和溴0.2mL，煮沸除去残留的溴(约15分钟)，冷却，加水稀释至1000mL，滤过，即得。避光保存，且本液不得显绿色。对照品溶液的配制：精密称取没食子酸50mg置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，取5mL溶液置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(C＝0.05mg/mL)。供试品溶液的配制：精密称取60mg肉桂多酚组合物置250ml容量瓶，加150mL水溶解，超声10min，放冷，用水稀释至250mL，摇匀，静置，过滤，弃去初滤液50mL。取20mL续滤液置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。3、测定法标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置25mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸溶液1mL，再分别加水11、10、9、8、7、6mL，用20％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。总酚：精密量取供试品溶液2mL，置25mL棕色量瓶中，按标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液25mL，加至已盛有干酪素400mg的100mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，同时用水做一份干酪素空白实验。精密量取续滤液2mL，置25mL棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量4、方法学考察线性范围考察：按标准曲线的制备项下的方法绘制标准曲线，回归方程为：y＝101.17x-0.1296，R2＝0.9997。结果表明，没食子酸对照品在0.0020～0.0120mg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系。精密度试验：精密量取对照品溶液2.0mL，置25mL棕色量瓶中，依次加入磷钼钨酸溶液1mL，水10mL，用20％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的空白试剂为空白，在760nm处测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.12％，表明方法精密度良好。重复性试验：分别取同一批次肉桂多酚组合物样品6份，平行制备供试品溶液并依法测定鞣质含量，6次测定结果的RSD为0.53％，表明本方法重现性良好。稳定性试验：样品显色后35分钟内稳定，须于显色后35分钟内完成测定。5、结果与讨论本方法以《中国药典》2015版中规定的鞣质含量测定方法为基础，根据肉桂多酚组合物的特点进行了如下优化：碳酸钠浓度的选择：精密移取对照品溶液和样品溶液各2mL置25mL容量瓶中，加1mL磷钼钨酸溶液，加10mL水，分别以1％、5％、10％、15％、20％、25％、29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，反应30min，以相应的试剂为空白，在760nm处测吸光度。结果随着碳酸钠溶液的浓度增大，吸光值也随着增大，在浓度为20％时，吸光值最大，之后吸光值就缓慢下降，且浓度越大，越容易结晶。故选择碳酸钠的浓度为20％。碳酸钠体积的选择：分别精密量取2mL对照品溶液置25mL容量瓶，各加1mL磷钼钨酸，分别加水18mL、14mL、10mL、6mL、4mL、2mL，用20％碳酸钠溶液稀释至刻度(分别加入4mL、8mL、12mL、16mL、18mL、20mL碳酸钠溶液)，反应30min，以相应的试剂为空白，分别测吸光度。在加10mL水时(相当于所加碳酸钠体积为12mL)，测得的吸光度值最大。故选择加入碳酸钠溶液体积为12mL。干酪素用量的选择：为了评价鞣质沉淀的效率，对干酪素的用量(200、300、400、500、600、700、800mg)进行选择。结果表明，加入400mg干酪素即可完全沉淀鞣质类成分，故选择干酪素的用量为400mg。以本方法对5批肉桂多酚组合物的总鞣质含量进行了测定，结果分别为25.6％、28.4％、29.1％、32.1％和31.1％。实施例3肉桂多酚组合物总糖含量的测定1、实验材料仪器：UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；5510E-DTH超声仪(美国必能信公司)；Milli-Q超纯水机(Millipore公司)；CP225D电子分析天平(赛多利斯公司)。试药：苯酚；浓硫酸；葡萄糖对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)；肉桂多酚组合物(昆药集团股份有限公司自制)。2、溶液配制对照品溶液的配制：精密称取10mg葡萄糖对照品置100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，溶解，即得0.1mg/mL的对照品溶液。供试品溶液的配制：精密称取15mg肉桂多酚组合物样品置50mL容量瓶中，加水30mL，超声10min，冷却，加水稀释至刻度，过滤，取续滤液，即得0.3mg/mL的供试品溶液。3、测定法标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分别置20mL刻度试管中，各加水至2.0mL，摇匀，加5％的苯酚溶液1mL，室温下快速加入浓硫酸5mL，冷却10min，混匀后放置20min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。取肉桂多酚组合物供试品溶液1mL置20mL刻度试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算总糖含量，即得。4、方法学考察线性范围考察：按标准曲线的制备项下的方法绘制标准曲线，回归方程为：y＝53.059x-0.0212，R2＝0.9997。葡萄糖对照品在0.0050～0.0175mg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系。精密度试验：取肉桂多酚组合物样品，按对照品溶液配制方法制备对照品溶液，依测定法操作，于490nm波长处测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.15％，表明方法精密度良好。重复性试验：分别取同一批次肉桂多酚组合物样品6份，平行制备供试品溶液并依法测定总糖含量，6次测定结果的RSD为0.98％，表明本方法重现性良好。稳定性试验：样品显色后50分钟内稳定，须于显色后50分钟内完成测定。5、结果与讨论本方法以苯酚-浓硫酸比色法为基础，在建立过程中根据肉桂多酚组合物的特点进行了如下优化：苯酚浓度和加入量选择：本研究对苯酚的浓度(2％～7％)进行了考察，结果以5％苯酚为优。进而对5％苯酚的加入量(0.4mL～1.4mL)进行了研究，结果以1mL为优。浓硫酸加入量选择：本研究对浓硫酸的加入量(4mL～6mL)进行了考察，以5mL的实验结果最为稳定。检测波长选择：本研究用紫外-可见分光光度计在波长400～600nm下进行波谱扫描，样品和对照品经测定法处理后于490nm处有最大吸收，因此选择490nm为测定波长。以本方法对5批肉桂多酚组合物的总糖含量进行了测定，结果分别为36.1％、39.2％、41.7％、36.7％和36.5％。实施例4肉桂多酚组合物红外指纹图谱的测定1、实验材料仪器：中红外光谱测定采用德国布鲁克(Bruker)TENSOR27红外光谱仪。实验数据相似度分析用Excel2013软件，红外图谱处理及绘制用OriginPro8软件。试药：压片用溴化钾(KBr)为光谱纯，其他试剂均为分析纯。肉桂提取物为实施例1中制备的肉桂多酚组合物1～12。2、测定法取实施例1中制备的肉桂多酚组合物1～12各2mg，分别加入100mg溴化钾(Kbr)，充分研磨均匀，压制成均匀透明的样品片，采用德国布鲁克(Bruker)TENSOR27红外光谱仪，以溴化钾为空白背景进行中红外光谱检测，测定范围4000～400cm-1，扫描次数10次，光谱分辨率4cm-1。采用Excel对导出的红外光谱数据(dpt格式)进行处理，以平均数法生成肉桂多酚组合物对照指纹图谱。以肉桂多酚组合物对照光谱为参照，相关系数法计算2000～400cm-1范围的相似度，相似度计算公式：式中，xi，yi为2组光谱数据的对应点；分别代表2组光谱数据的平均值。3、方法学考察精密度试验：取同一批号样品依法压片连续测定6次红外指纹图谱，以平均数法生成参照指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。各色谱图的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，表明该方法的精密度良好。重复性试验：取同一批号样品6份，分别依法测定红外指纹图谱，以平均数法生成参照指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。各色谱图的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，表明该方法的精密度良好。稳定性试验：取同一批号样品依法压片，分别于制备后的0，3，6，9，12，24小时依法测定红外指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。各色谱图的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，样品于24小时内稳定。4、结果与讨论近年来，红外光谱指纹图谱在中药质控领域取得了较大进展。该方法具有自身鲜明的技术特点：样品前处理简单，基本不使用有毒、有害试剂，分析速度快，操作简单，分析成本低。红外光谱指纹图谱基于分子中官能团振动、转动的能级跃迁，直接反映化学结构，无需化学对照品，能够同时对样品多种成分进行分析表征，反映样品宏观(整体)化学信息，体现中药作用的整体性和模糊性。本发明建立了肉桂多酚组合物的红外指纹图谱分析方法，该方法可用于肉桂多酚组合物的整体质量控制。12批样品的红外指纹图谱及肉桂多酚组合物对照指纹图谱分别见图1和图2。12批样品指纹图谱的相似度均大于0.90，表明不同来源肉桂药材制备的肉桂多酚组合物具有较好的化学等同性，提示其具有类似的药理活性，同时也在一个侧面反映了肉桂类药材临床混用的合理性。12批总多酚样品红外指纹图的相似度分析样品相似度样品相似度肉桂多酚组合物10.98肉桂多酚组合物70.95肉桂多酚组合物20.97肉桂多酚组合物80.96肉桂多酚组合物30.97肉桂多酚组合物90.95肉桂多酚组合物40.95肉桂多酚组合物100.96肉桂多酚组合物50.96肉桂多酚组合物110.97肉桂多酚组合物60.95肉桂多酚组合物120.98实施例5肉桂多酚组合物的体外抗病毒活性测试1、实验材料测试样品：肉桂多酚组合物(昆药集团股份有限公司自制)样品配制：肉桂多酚组合物用无菌水溶至8mg/mL并于80℃水浴中加热15分钟溶解。溶液于2000RPM离心2分钟后取上清储存于4℃作为肉桂多酚组合物母液。参照化合物由药明康德提供。在EC50测定实验中，肉桂多酚组合物和参照化合物被3倍倍比稀释测试8个浓度点，每个浓度测试双复孔。最高测试浓度为1000μg/mL。细胞培养基中的DMSO最终浓度为0.5％。表1抗病毒实验测试化合物列表病毒：本研究选用了4个不同类型的病毒测定KPC的抗病毒活性(表2)。表2测试病毒列表细胞：Hep-2细胞、VeroE6细胞、MRC5细胞和MT-4细胞。试剂：细胞活力检测试剂CellTiter-Glo(Promega)、细胞活力检测试剂CCK-8(天津百萤)。2、实验方法所测试的4个病毒中，其中3个是以病毒的细胞病变效应(CPE)实验测定肉桂多酚组合物的抗病毒活性。HCMV实验则采用荧光衰减实验测定。病毒实验方法总结于下表。表3抗病毒实验方法列表RSVAlong、HSV-1病毒致细胞病变实验：细胞以一定密度(表3)接种到微孔板并于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，第二天，不同浓度的化合物和病毒(表3)的预混液加入细胞板中于37℃，5％CO2培养3-5天至病毒对照孔中的细胞病变完全。细胞活性随后使用CCK8细胞活力检测试剂盒按照检测试剂的说明进行检测。化合物不同浓度下的抗病毒活性由对病毒引起的细胞病变效应的抑制作用来决定。所有数据经空白感染对照校准。EC50由GraphPadPrism软件进行分析计算。HIV-1病毒致细胞病变实验：测试化合物和参照化合物倍比稀释后与病毒(表3)混合，随后化合物和病毒的混合液与MT-4细胞加入微孔板并于33℃或37℃，5％CO2培养箱中培养2-6天至病毒对照孔中的细胞病变完全。细胞活性随后使用CCK8或CellTiterGlo细胞活力检测试剂盒按照检测试剂的说明进行检测。化合物在不同浓度下的抗病毒活性由对病毒引起的细胞病变效应的抑制作用来决定。EC50由GraphPadPrism软件进行分析计算。HCMV荧光衰减实验：本实验中使用的人巨细胞病毒(HCMV)通过基因重组插入报告基因EGFP，病毒的复制由GFP的表达水平来反映。化合物的抗病毒活性可以通过化合物对感染细胞中的GFP的表达水平的影响来测定。MRC5细胞以20,000细胞/孔的密度种入96孔板，随后置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，不同浓度的化合物和病毒的预混液加入细胞板中并于37℃，5％CO2培养4天。GFP的荧光强度由AcumeneX3(TTPLabTech)检测。化合物的抗病毒活性可以通过化合物对感染细胞中的GFP的表达水平的影响来测定。EC50由GraphPadPrism软件进行分析计算。数据分析：因为肉桂多酚组合物的颜色在450nm有吸光度。为了消除化合物颜色对CCK8检测的影响，实验测试板在加入CCK8之前检测了本底的吸光度值。原始数据＝加入CCK8后的吸光度值-加入CCK8前的吸光度值。化合物的抗病毒活性表示为抑制率(％)，计算公式如下：抑制率(％)＝(Rawdatacpd-AverageVC)/(AverageCC-AverageVC)*100Rawdatacpd表示化合物样品孔的信号值，AverageVC、AverageCC分别表示病毒对照、细胞对照的平均信号值。化合物的EC50值由GraphPadPrism软件进行数据处理得出。3、实验结果本实验所有抗病毒活性实验的参照化合物的抗病毒活性与预期符合，证明本实验结果可靠。肉桂多酚组合物的抗病毒活性结果见表4。表4.肉桂多酚组合物抗病毒活性列表实施例6不同来源肉桂多酚组合物的体外抗HSV-1病毒活性测试1、实验材料测试样品：实施例1中的肉桂多酚组合物1～18；肉桂多酚组合物19～20为市售肉桂多酚组合物(购自陕西荣康生物科技有限公司，经测定与肉桂多酚组合物对照指纹图谱相似度大于0.90，总鞣质含量大于15％，总糖含量大于25％)；肉桂提取物21～22为市售肉桂提取物(经测定与肉桂多酚组合物对照指纹图谱相似度小于0.90，总鞣质含量小于15％，总糖含量小于25％)；CEppt1～2参照中国专利CN1897958B中CEppt的制备方法制备。样品配制：同实施例5样品配制。病毒：HSV-1(GHSV-UL46)。细胞：VeroE6细胞。试剂：细胞活力检测试剂CCK-8(天津百萤)。2、实验方法同实施例5HSV-1病毒致细胞病变实验。3、实验结果本实验抗病毒活性实验的参照化合物的抗病毒活性与预期符合，证明本实验结果可靠。不同来源肉桂多酚组合物的抗HSV-1病毒活性结果见表5。不同来源的肉桂多酚组合物(包括不同药材基源、不同工艺以及商品肉桂多酚组合物)均表现了较强的抗病毒活性。肉桂提取物21～22为市售肉桂提取物，不符合本发明肉桂多酚组合物规定的质量要求(红外指纹图谱相似度、总鞣质含量、总糖含量)，抗病毒活性很弱。CEppt较肉桂多酚组合物的抗病毒活性弱，且批间差异较大。以上结果表明，本发明的质量控制要求可以对肉桂多酚组合物的质量进行有效控制，符合本发明质量要求的肉桂多酚组合物具有较强的抗病毒活性，反之抗病毒活性微弱。本发明的肉桂多酚组合物较CEppt活性强，且质量稳定。表5.不同来源肉桂多酚组合物抗HSV-1病毒活性列表实施例7肉桂多酚组合物抗H1N1病毒活性测试1、实验材料与动物分组测试样品：肉桂多酚组合物(本发明制备)实验病毒株：H1N1(A/PuertoRico/8/1934)。病毒通过狗肾细胞进行繁殖。病毒株在-70℃储存前测得其HA滴定度(HAU)为256；实验用病毒为250HAU。实验动物与分组：28-30天年龄的小鼠。A)PBS对照组：6只小鼠。B)病毒组(PR8攻毒组)：8只小鼠(250HAU/只)。C)肉桂多酚组合物给药组(本发明组)，共8只小鼠。2、实验方法指定剂量的肉桂多酚组合物(100ug/只)与病毒(250HAU/只)室温下用适量的PBS预先混合培养5-10min。28-30天年龄的小鼠接种预先混合好的肉桂多酚组合物/病毒溶液或者病毒溶液。肉桂多酚组合物/病毒在PBS中的总体积为50uL/只小鼠。接种前麻醉。PBS做为空白对照。观察小鼠28天存活水平。3、实验结果各组小鼠28天存活水平见图3。攻毒组小鼠在攻毒后第三天出现死亡，攻毒后一周内死亡过半，存活率为37.5％(8只小鼠共计死亡5只)。肉桂多酚组合物给药组(昆药组)仅在攻毒后第三天死亡一只，存活率87.5％，结果揭示肉桂多酚组合物对小鼠有显著保护性效果。实施例8肉桂多酚组合物口服制剂的制备肉桂多酚组合物片剂的制备：取肉桂多酚组合物10份，加淀粉6份和滑石粉2份，混匀，用80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，加入硬脂酸镁(0.2份)，混匀，压制成片，即得。肉桂多酚组合物颗粒剂的制备：取肉桂多酚组合物50份，加蔗糖粉(63份)和糊精(31.5份)，混匀，以80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，分装，即得。肉桂多酚组合物胶囊剂的制备：取肉桂多酚组合物30份，加淀粉12份和滑石粉8份，混匀，用80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，装胶囊，即得。实施例9肉桂多酚组合物外用制剂的制备肉桂多酚组合物喷剂的制备：取肉桂多酚组合物适量，以超纯水溶解，配制成1mg/mL的溶液，灌装于喷瓶中，即得。肉桂多酚组合物喷剂的制备：取肉桂多酚组合物适量，以超纯水溶解，配制成4mg/mL的溶液，灌装于喷瓶中，即得。肉桂多酚组合物搽剂的制备：取肉桂多酚组合物适量，以超纯水溶解，配制成1mg/mL的溶液，即得。肉桂多酚组合物搽剂的制备：取肉桂多酚组合物适量，以超纯水溶解，配制成4mg/mL的溶液，即得。实施例10肉桂多酚组合物防病毒口罩的制备取肉桂多酚组合物适量，以超纯水溶解，配制成4mg/mL的溶液，于口罩的夹层膜均匀喷涂(100mg肉桂多酚组合物/片)，即得肉桂多酚组合物防病毒口罩。当前第1页1 2 3