本发明涉及生物制药领域，具体地说，涉及一种四价亚单位流感疫苗。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的，可造成大规模流行的急性呼吸道传播疾病。流感能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴发流行及散发。高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡。因此，流感的预防一直受到世界各国的高度重视。预防流感最有效的措施是接种流感疫苗。
目前全世界使用的流感疫苗都是三价的，包括两种甲型(H1N1，H3N2)和一种乙型(B型)流感病毒抗原成分，现在应用最广泛的疫苗包括用于6月以上人群的灭活疫苗和用于2-49岁的减毒活疫苗。
灭活疫苗包括裂解疫苗和亚单位疫苗。裂解疫苗是将病毒在鸡胚内培养来制备病毒液,收获尿囊液后，经澄清、浓缩、纯化、灭活、裂解后制备出裂解疫苗半成品，将三价病毒原液按一定比例配比成裂解疫苗成品。亚单位疫苗是在裂解疫苗的基础上，通过适宜的裂解剂、裂解条件，将膜蛋白HA和NA裂解下来，选择适当的纯化方法获得HA和NA蛋白，制备而成。
三价疫苗对流感的预防明显受限。市场上使用的三价疫苗只含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N3)和一个谱系的乙型(B型)流感病毒抗原。三价疫苗对另一谱系乙型病毒仅提供有限保护。
综上所述，为了增强产品的安全性，扩大人群对流感不同流行型别的保护范围，为全人群提供免疫保护屏障，特别是对6月以下婴幼儿及老年人的保护，流感疫苗市场亟需四价亚单位流感疫苗的开发和应用。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种四价亚单位流感疫苗，其由H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的病毒单价原液按一定稀释点配制而成；所述疫苗中H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的血凝素含量均为26.4μg-39.6μg/mL。
配制方法具体为：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/mL范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。根据所需单价原液稀释液的体积为V和单价原液血凝素含量C0，计算出所需单价原液的体积V0＝V/(C0/血凝素配制量)，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积VP＝V-V0。以一批单价原液为例：假如某批所需单价原液稀释液的体积为500mL，单价原液的血凝素含量为350μg/mL，血凝素配制量为35μg/mL，那么单价原液体积为500/(350/35)＝50mL，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积500mL-50mL＝450mL。
进一步地，所述病毒单价原液由毒种经鸡胚培养、通过尿囊液收获、澄清、浓缩、裂解、纯化后得到；
毒种为经世卫组织(WHO)评估后推荐，由英国生物制品检定研究所(NIBSC)提供的人用流感疫苗病毒株，分别是H1N1型(NYMCX-179A)，H3N2型(NIB-88)，BY型(B/Phuket)，BV型(NYMCBX-35)。
其中，浓缩步骤具体为：
1)将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后，用100万截留分子量超滤膜对其进行超滤浓缩，浓缩倍数20～60倍。
所述裂解步骤具体为：
1)将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101/蔗糖溶液中，于15～25℃条件下，裂解3.5～4.5h；裂解的同时进行蔗糖密度梯度离心，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；进行蔗糖密度梯度离心时，离心转速为25000转/分钟，离心时间3.5～4.5h；
或2)：
将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101中，于15～25℃条件下，裂解0.5～2h；裂解后的病毒液在疏水层析柱Hi Trap PhenylFF(high sub)进行分离纯化，上样缓冲液为50mmol/L PBS+1.5mol/L(NH4)2SO4(pH7.0)，含硫酸铵100％，另设50mmol/L PBS中含硫酸铵为0，适量上样后以保证柱压的流速从设定的硫酸铵含量100％至0速递减洗脱，以280nm波长进行监测，并收集蛋白峰。
进一步地，本发明以毒种出发，提供完整的所述病毒单价原液的制备方法，包括如下步骤：
S1、病毒接种和培养
将单型工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时；
S2、病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液；
S3、离心澄清合并
将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；
S4、浓缩、病毒裂解和纯化
S41、浓缩
用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍；
S42、病毒裂解
将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101/蔗糖溶液，置于15～25℃，病毒裂解时间3.5～4.5小时，蔗糖密度梯度离心时间3.5～4.5小时，离心转速为25000转/分钟，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；
S43、纯化
收集密度梯度离心后的病毒液，Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/mL，如果高于2500μg/mL应稀释至该浓度，加入终浓度为200μg/mL的甲醛置2～8℃灭活2天，得到病毒灭活液；
S44、再纯化
对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛，洗滤后病毒液应取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，微生物限度检查菌数应小于10cfu/mL，再经除菌过滤后即为病毒单价原液。
更为优选地，所述病毒单价原液的制备方法包括如下步骤：
S1、病毒接种和培养
将单型工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时；
S2、病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液；
S3、离心澄清合并
将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；
S4、浓缩、病毒裂解和纯化
S41、浓缩
用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍；
S42、病毒裂解
将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101中，置于15～25℃，病毒裂解时间0.5～2小时；之后，采用疏水层析对不同血清型样品进行分离纯化；
S43、纯化
收集密度梯度离心后的病毒液，Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/mL，如果高于2500μg/mL应稀释至该浓度，加入终浓度为200μg/mL的甲醛置2～8℃灭活2天，得到病毒灭活液；
S44、再纯化
以1万分子量超滤膜对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛，洗滤后病毒液应取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，微生物限度检查菌数应小于10cfu/mL，再经除菌过滤后即为病毒单价原液。
其中，上述S42中，采用疏水层析柱Butyl-S-Sepharose 6ff(C4)对不同血清型样品进行分离纯化；层析介质为butylff，Octyl ff或PhenylF，上样缓冲液为50mmol/L PBS+1.5mol/L(NH4)2SO4(pH7.0)，含硫酸铵100％，另设50mmol/L PBS中含硫酸铵为0，适量上样后以保证柱压的流速从设定的硫酸铵含量100％至0匀速递减洗脱，以280nm波长进行监测，并收集蛋白峰。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法，利用本发明所制备的四价亚单位疫苗样品的卵清蛋白含量均值为115.4ng/mL，远低于三价裂解疫苗(不高于500ng/mL)和三价亚单位疫苗(不高于400ng/mL)的标准。四价亚单位流感疫苗样品的甲醛含量为23.16μg/mL，远低于三价裂解流感疫苗质量标准(不高于50μg/mL)和三价亚单位流感疫苗质量标准(不高于40μg/mL)。四价亚单位疫苗的裂解剂残留量检定结果为120.5μg/mL，三价裂解疫苗质量标准为小于300μg/mL，三价亚单位疫苗质量标准为小于350μg/mL。四价亚单位疫苗样品中较低的卵清蛋白含量，较低的甲醛及裂解剂残留量，保证了四价亚单位疫苗的不良反应更低，疫苗的安全性得到提高。四价亚单位疫苗是在三价疫苗的基础之上增加了一个BV血清型，四价亚单位疫苗针对不同血清型流感的流行具有更宽泛的防御保护范围。
附图说明
图1为四价亚单位疫苗与三价亚单位疫苗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，1.蛋白分子量标准、2.三价亚单位疫苗对照、3.四价亚单位疫苗样品。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种四价亚单位流感疫苗，所述每剂四价流感亚单位疫苗含有甲1(H1N1)型、甲3((H1N3)型及乙(B)型的两个谱系)，每价抗原含量为30～36μg/mL。
1.病毒接种和培养
将工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后(各型流感毒株应分别按同一病毒滴度进行接种)，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时，一次未使用完的工作种子批毒种，不得再回冻继续使用。
2.病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液并取样进行检定：微生物限度，血凝滴度。
3.离心澄清合并
单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液。
4.浓缩、病毒裂解和纯化
1)浓缩
用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍。浓缩液应取样进行细菌内毒素含量测定。
2)病毒裂解
配制浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101/蔗糖溶液，置于15～25℃，病毒裂解时间3.5～4.5小时，蔗糖密度梯度离心时间3.5～4.5小时，离心转速为25000转/分钟，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰。
3)纯化
以Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/mL，如果高于2500μg/mL应稀释至该浓度，加入终浓度为200μg/mL的甲醛置2～8℃灭活2天。
4)再纯化
对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛，洗滤后病毒液应取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，微生物限度检查菌数应小于10cfu/mL，再经除菌过滤后即为单价原液。
5.配制
根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/mL范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。
实验例1四价流感病毒亚单位疫苗半成品工艺研究
一、材料
四个型别流感病毒单价原液
二、方法
根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/mL范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。根据所需单价原液稀释液的体积为V和单价原液血凝素含量C0，计算出所需单价原液的体积V0＝V/(C0/血凝素配制量)，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积VP＝V-V0。以一批单价原液为例：假如某批所需单价原液稀释液的体积为500mL，单价原液的血凝素含量为350μg/mL，血凝素配制量为35μg/mL，那么单价原液体积为500/(350/35)＝50mL，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积500mL-50mL＝450mL。本次试验稀配点为33.0μg/mL。
三、配制情况
配制材料：四个型别流感病毒单价原液
配制方法：
根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/mL范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。根据所需单价原液稀释液的体积为V和单价原液血凝素含量C0，计算出所需单价原液的体积V0＝V/(C0/血凝素配制量)，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积VP＝V-V0。以一批单价原液为例：假如某批所需单价原液稀释液的体积为500mL，单价原液的血凝素含量为350μg/mL，血凝素配制量为35μg/mL，那么单价原液体积为500/(350/35)＝50mL，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积500mL-50mL＝450mL。
本次试验稀配点为33.0μg/mL(四个型别均一致)，试制的九批四价流感病毒亚单位疫苗抗原组分及特异性无误，血凝素含量完全符合配制量的80％-120％。
四、半成品及成品主要项目检定及分析
1、血凝素含量
1.1材料
试制的四价亚单位流感疫苗样品九批：20160301；20160302；20160303；20160504；20160505；20160506；20160507；20160508；20160509。
1.2方法
采用单向扩散方法。将标准抗原和原液分别加入到含有标准抗体的1％琼脂糖凝胶板上，孔径为4mm，每孔6μL，静置不少于18小时。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量标准抗原和原液形成的沉淀环直径，以标准抗原形成的沉淀环的直径对其相应抗原尝试进行直线回归，求出直线回归方程，代入原液的沉淀直径，即可得到原液的血凝素含量。
1.3试制样品成品血凝素含量检定结果
表1 H1N1型血凝素含量(μg/mL)数据统计表
表2 H3N2型血凝素含量(μg/mL)数据统计表
表3 BY型血凝素含量(μg/mL)数据统计表
表4 BV型血凝素含量(μg/mL)数据统计表
2、游离甲醛含量
游离甲醛含量的测定采用比色法，依据品红亚硫酸在酸性溶液中能与甲醛生成紫色复合物。将9批成品进行试验，总结如下：
2.1.材料：四价流感病毒亚单位疫苗样品成品批号：20160301、20160302、20160303、20160504、20160505、20160506、20160507、20160508、20160509。
试剂：0.005％甲醛对照品溶液、品红亚硫酸溶液、混合酸溶液。
2.2.方法：采用比色法测定四价流感病毒亚单位疫苗成品游离甲醛的含量，首先制作标准曲线，得出线性回归方程，然后根据线性回归方程得出供试品游离甲醛的含量。向甲醛对照品溶液管(浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL)和供试品管中分别加入10mL的品红亚硫酸溶液和10mL的混合酸溶液，于25℃放置3小时，测定590nm处的吸光度，根据甲醛对照品溶液的吸光度值得出线性回归方程和相关系数，依此得出供试品游离甲醛的含量。
2.3.九批成品甲醛检定含量结果
表5游离甲醛含量(μg/mL)数据统计表
3、卵清蛋白含量
3.1材料：四价流感病毒亚单位疫苗成品批号20160301、20160302、20160303、20160504、20160505、20160506、20160507、20160508、20160509。
试剂：卵清蛋白ELISA检测试剂盒(Seramun)、纯化水。
3.2方法：采用双抗夹心ELISA方法，用抗卵清蛋白的多抗做捕获抗体，HRP标记的卵清蛋白抗体做检测抗体。将卵白标准品和供试品加入用抗卵清蛋白多抗包被好的微孔酶标板中，再加入HRP结合物，37℃孵育60min。洗板后加入TMB底物避光显色10min，加入终止液，30min内检测。检测波长450nm，参比波长620nm。以标准品的卵清蛋白浓度和OD值(或平均OD值)做标准曲线，求得回归方程，将供试品的OD值带入回归方程中，求得其卵清蛋白浓度。
3.3九批成品卵清蛋白检定结果
表6卵清蛋白含量(ng/mL)数据统计表
4、裂解剂Triton N-101残留量(半成品检定)
裂解剂Triton N-101残留量的测定采用比色法，其原理为：Triton N-101中含有聚乙氧基，聚乙氧基和硫氰酸钴铵反应形成蓝色复合物，该复合物可溶于二氯甲烷，用比色法可测定Triton N-101残留量。我们将9批半成品进行试验，总结如下：
4.1材料：四价流感病毒亚单位疫苗半成品批号：20160301、20160302、20160303、20160504、20160505、20160506、20160507、20160508、20160509。
试剂：乙醇-氯化钠饱和溶液、硫氰钴胺溶液、Triton N-101对照品溶液、二氯甲烷溶液。
4.2方法：采用比色法测定四价流感病毒亚单位疫苗半成品中裂解剂的残留量。首先，制作标准曲线，然后根据得到的线性回归方程计算出供试品中的裂解剂残量。向Triton N-101对照品溶液管(浓度分别为40μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL)和供试品(经浓缩处理)管中各加二氯甲烷溶液2mL，硫氰钴胺溶液3mL，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟震荡一次。测定前静置30分钟，弃上层液。在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度，根据Triton N-101对照品溶液管的吸光度值得出线性回归方程，依此得出供试品的裂解剂残留量。
4.3九批半成品裂解剂残留量检定结果
表7四价流感病毒亚单位疫苗半成品裂解剂残留量结果
5.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
5.1方法
5.1.1制胶
5.1.1.1分离胶：
Resolver A液3mL，Resolver B液3mL，10％APS 30μL，TEMED 3μL，立即混匀以后灌注于电泳槽两侧的两块玻璃之间，并留出灌注浓缩胶所需空间，加水封顶，室温下聚合，分离胶聚合完全(约50分钟)后，倾去覆盖层液体，用滤纸条吸干水分。
5.1.1.2浓缩胶：
Stacker A液1mL，Stacker B液1mL，10％APS 10μL，TEMED 2μL，立即混匀，在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶(高约1cm)后，立即在浓缩胶溶液中插入干净的Teflon梳子，将凝胶垂直放置于室温下。待浓缩胶聚合完全后，将凝胶置于电泳槽内，加入电泳缓冲液，然后小心拔出梳子。
5.1.2样品处理：
5.1.2.1糖基化：
取18μL蛋白样品，加入2μL糖蛋白变性缓冲液，100℃煮沸10分钟，使样品充分变性；然后加入2.5μL 10×G2缓冲液，2.5μL 10％NP-40，1μL糖苷酶F，37℃温育18小时。加入26μL 2×非还原型上样缓冲液，混匀，置水浴中100℃加热3～5分钟。
5.1.2.2非还原型：
取30μL蛋白样品，加入30μL 2×非还原型上样缓冲液，混匀，置水浴中100℃加热3～5分钟。
5.1.3电泳：
将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入1×电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将处理好的样品(每孔20μL)和Marker(每孔10μL)加入到孔中；凝胶所加电压为80伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶(大约30分钟)后，酌情将电压提高到150～200伏，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记。
5.2凝胶，固定、染色及结果分析
将凝胶放入适量蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，染色1～2小时；加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色。期间至少更换脱色液1～2次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。
由图1可知，三价亚单位疫苗及本实验所制备的四价亚单位疫苗样品血凝素分子量均在70KDa左右，符合流感病毒血凝素的理论分子量。电泳图片中三价亚单位疫苗及所制备的四价亚单位疫苗样品都很难见到明显的杂带，表明二者血凝素纯度都很高。所制备的四价亚单位疫苗样品较三价亚单位疫苗信号强，说明前者血凝素含量明显高于后者(见图1)。
五、四价亚单位疫苗样品检定结果与三价亚单位疫苗质量标准及三价裂解疫苗质量标准比较。
表8检定结果比较
六、免疫原性和动物的抗体效价
本次研究方法是将疫苗免疫小鼠后检测体内产生的抗流感病毒的抗体水平。将一批试制四价流感病毒亚单位疫苗成品批号为20160504、三价流感亚单位疫苗(用灭活后的H1N1单价原液、H3N2单价原液和BY单价原液配制成疫苗小样)分别免疫小鼠，在免疫前、初免28天、初免42天后分组采血，分离血清，以血凝抑制试验方法测定抗体效价。
表9小鼠免疫原性试验结果
试验结果表明：四价流感病毒亚单位疫苗免疫动物后，中和抗体效价显著高于免前，产生的抗体水平较高，说明该疫苗样品具有良好的免疫原性和较强的刺激小鼠机体产生中和抗体的能力，四价流感病毒亚单位疫苗样品与三价亚单位疫苗样品中和抗体效价、产生的抗体水平相近，样品中并没有因为在三价亚单位疫苗基础上增加了一价而使不同血清型抗原之间出现相互拮抗作用或相互增强效果的情况。四价亚单位疫苗样品较三价疫苗样品多了一个BV血清型抗原，从而为将来人体免疫时扩大疫苗对不同血清型流感流行的防护范围奠定基础。
四价亚单位疫苗样品的卵清蛋白含量均值为115.4ng/mL，远低于三价裂解疫苗(不高于500ng/mL)和三价亚单位疫苗的(不高于400ng/mL)的标准，这保证了在将来四价亚单位流感疫苗人体免疫时，四价亚单位疫苗有更低的不良反应。四价亚单位流感疫苗样品的甲醛含量为23.16μg/mL，远低于三价裂解流感疫苗(不高于50μg/mL)和三价亚单位流感疫苗(不高于40μg/mL)的质量标准。四价亚单位疫苗的裂解剂残留量检定结果为120.5μg/mL，三价裂解疫苗质量标准为小于300μg/mL，三价亚单位疫苗质量标准为小于350μg/mL。较低的甲醛和裂解剂残留量，使得四价亚单位流感疫苗样品中的非有效成份含量更低，从而大大提高了四价亚单位流感疫苗的安全性。
实施例2
在实施例1的基础上，以疏水层析技术取代密度梯度离心技术。
具体为：配制浓度不高于1.5％的裂解剂Triton N101中，置于15～25℃，病毒裂解时间0.5～2小时。之后，采用疏水层析柱Butyl-S-Sepharose 6ff(C4)对不同血清型样品进行分离纯化。层析介质为butylff，Octyl ff或PhenylF，上样缓冲液为50mmol/L PBS+1.5mol/L(NH4)2SO4(pH7.0)，含硫酸铵100％，另设50mmol/L PBS中含硫酸铵为0，适量上样后以保证柱压的流速从设定的硫酸铵含量100％至0匀速递减洗脱，以280nm波长进行监测，并收集蛋白峰。
对疏水层析后样品进行分析，发现疏水层析后样品与密度梯度离心处理的样品，样品的血凝素收率及纯度没有明显差异。疏水层析更为快捷和方便，仅在30分钟左右就可以完成，而密度梯度离心技术则需要几个或十几个小时以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。