本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种不含明胶和人血白蛋白的腮腺炎疫苗保护剂的配方和使用方法。
背景技术：
：预防性疫苗的应用使常见流行性传染病得到了有效控制，有效的降低了这些传染病的发病率和死亡率。但是，在疫苗的使用过程中发现大多数疫苗均存在较高的不良反应发生率；随着疫苗的广泛应用和对不良反应诱因的深入研究发现，很多接种疫苗后出现的不良反应问题与疫苗产品的保护剂有直接关系，特别是冻干疫苗产品中的冻干保护剂，其中的明胶或明胶衍生物能直接引起被接种者过敏等变态反应，研究表明明胶所致人体的过敏反应有体液免疫机制(IgE抗体)，也有细胞免疫机制(张卓光，疫苗中牛源明胶的致敏作用，《国外医学》，2002年(第2期)，25)。现有疫苗产品多数是参考世界卫生组织所颁发的生物制品规程为标准生产的，标准中没有对保护剂的明胶成分使用量加以限制。日本FDA于1986年批准的疫苗上市许可及美国FDA批准的疫苗上市许可中，均没有把明胶作为生产疫苗的禁用成分。在早期的专利文献中，大多数疫苗保护剂都含有明胶成分。国家药典委员会在2007年7月17日至7月19日北京会议纪要中明确要求“作为稳定剂成分的明胶注射到人体后可发生过敏反应，生产企业应进行取代明胶成分的相关研究工作，以进一步提高制品的安全性”。目前，人血清白蛋白在疫苗领域被广泛应用病毒培养和冻干保护剂，人血清白蛋白是从人的血浆中提取，这样的生产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还可能含有危险的传染病病原体，例如肝炎病毒等，因此使用过程中存在较大的担忧；此外，人血清白蛋白的价格昂贵，使得疫苗的成本骤升。所以迫使研究者研究一系列人血清白蛋白的替代品来改进传统的配方。目前现有技术中不含明胶、人血清白蛋白的保护剂虽然降低了对人体的刺激性，但是对疫苗的保护效果并不理想，使得疫苗在冻干过程中和储存过程中的稳定性下降，易发生失效。因此，本领域中急需一种安全有效的无明胶、无人血清白蛋白疫苗冻干保护剂，在保障疫苗质量的同时，降低免疫风险和生产成本。技术实现要素：本发明的目的是提供一种不含明胶、不含人血白蛋白的新型疫苗冻干保护剂，使内毒素含量下降，不易发生过敏反应，并且仍然能保持较高的稳定性和较长的有效期。为了达到上述目的，本发明提供一种疫苗冻干保护剂，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖30-100g/L、谷氨酸钠0.5-15g/L、尿素0-10g/L、磷酸氢二钠1-20g/L、枸橼酸0.2-10g/L；所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗。优选地，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖30-80g/L、谷氨酸钠0.5-10g/L、尿素0-5g/L、磷酸氢二钠1-10g/L、枸橼酸0.2-5g/L。更优选地，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖50g/L、谷氨酸钠10g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钠10g/L、枸橼酸5g/L。本发明提供的腮腺炎疫苗冻干保护剂，其成分中不含明胶和人血白蛋白。用于配制本发明冻干保护剂的基质液为199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水。进一步地，所述的199培养液为无酚红199培养基。本发明提供了上述腮腺炎疫苗冻干保护剂在制备冻干腮腺炎疫苗中的应用。进一步地，本发明提供了一种制备冻干腮腺炎疫苗的方法，包括以下步骤：提供腮腺炎病毒液；按比例加入本发明所述的腮腺炎疫苗冻干保护剂至病毒液中，制成腮腺炎病毒活疫苗原液；将腮腺炎病毒活疫苗原液按疫苗半成品中目标病毒滴度加入适量稀释液配制成疫苗半成品，使疫苗冻干保护剂中各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖30-100g/L、谷氨酸钠0.5-15g/L、尿素0-10g/L、磷酸氢二钠1-20g/L、枸橼酸0.2-10g/L；所述稀释液含有与本发明的冻干保护剂相同的成分，且各成分的浓度与本发明冻干保护剂在疫苗半成品中的终浓度一致；所述疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；所述目标病毒滴度为5.8±0.3lgCCID50/ml；疫苗半成品在2-8℃条件下，分装，冻干。冻干的条件为：预冻阶段最低温度-45℃～-48℃，达到最低温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-35℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在4-6Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时。利用本发明提供的上述制备方法制备得到的一种冻干腮腺炎疫苗也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种无明胶无人血白蛋白的冻干保护剂，其能够合理替代明胶和人血白蛋白，且能达到同类产品相同的有效性，并具有更高的安全性。本发明中冻干保护剂的安全性与上市产品比较不易发生过敏反应，安全性更高，而疫苗的质量远高于《中国药典》三部要求的标准，其效果包括：(1)保护剂成分中不含有明胶、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻糖，不易引发过敏反应，如荨麻疹、皮肤瘙痒、发热、恶心等，疫苗的安全性更高，减少了接种疫苗的不良反应；(2)采用本发明制备的腮腺炎减毒活疫苗成品病毒滴度均大于4.8lgCCID50/ml，质量标准高于《中国药典》三部要求不低于4.0lgCCID50/ml标准；热稳定性试验结果均大于4.4lgCCID50/ml，质量标准高于《中国药典》三部要求不低于4.0lgCCID50/ml标准；病毒滴度下降值不高于0.6lg，质量标准高于《中国药典》三部要求下降不高于1.0lg标准；(3)水分均低于2.0％，质量标准高于《中国药典》三部要求不高于3.0％标准；(4)采用本发明制备的腮腺炎减毒活疫苗成品加速稳定性及长期稳定性结果不低于含明胶和人血白蛋白的对照样品；(5)采用本发明制备的腮腺炎减毒活疫苗成品的内毒素含量远远低于2015版《中国药典》三部要求(应不高于50EU/剂)；(6)腮腺炎减毒活疫苗成品进行豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。腮腺炎病毒S79株来源于卫生部上海生物制品研究所。实施例1本发明实施例中腮腺炎病毒S79株病毒液的制备方法1.将孵化9～11天的SPF种蛋进行解剖，弃去鸡胚头及内脏，将组织块消化制备细胞悬液，用细胞营养液将细胞悬液稀释到适宜的细胞浓度，分装于10L转瓶置于36.5±1℃恒温室培养，培养至长成致密单层细胞。2.待细胞长成致密单层后，弃细胞营养液换pH值7.2～7.4病毒生长液，按MOI0.001～0.01接种腮腺炎病毒(S79株)，置于33±1℃恒温室继续培养。3.病毒培养44～52小时后弃去病毒生长液，并用0.85％的生理盐水洗涤细胞表面除去牛血清白蛋白，洗换后加入不含牛血清白蛋白、pH值7.4～7.6的病毒维持液，置于33±1℃中继续培养。4.镜下观察当病变达到75％以上时，收获病毒液，合并后即为单次收获液。实施例2本发明冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)组分1：蔗糖，药用级，30～100g/L；组分2：谷氨酸钠，药用级，0.5～15g/L；组分3：尿素，药用级，0.0～5.0g/L；组分4：磷酸氢二钠，分析纯，1.0～20g/L；组分5：枸橼酸，药用级，0.2～10g/L；溶剂：注射用水或PBS缓冲溶液或199培养液；本发明冻干保护剂的配制方法：(1)将上述组分1称量后，加入溶剂溶解，定溶后进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃、30分钟；(2)称取上述组分2、组分3，加入溶剂溶解，定溶后液体通过0.2微米滤器除菌过滤，置于2～8℃冷库，备用；(3)称取上述组分4、组分5，分别加入溶剂溶解，然后混合定溶，定溶后液体通过0.2微米滤器除菌过滤，置于2～8℃冷库，备用；(4)保护剂在使用前将(1)(2)(3)进行混合。实施例3以腮腺炎病毒S79株制备的工作种子接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液后，将冻干保护剂与病毒收获液按1:4(V/V)的比例混合制备疫苗原液，其中，冻干保护剂在疫苗原液中的终浓度为蔗糖50g/L、谷氨酸钠10g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钠10g/L、枸橼酸5g/L。向疫苗原液中加入适量pH6.8～7.0的稀释液，使得目标病毒滴度为5.8lgCCID50/ml，即获得半成品溶液；其中，稀释液为含有蔗糖50g/L、谷氨酸钠10g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钠10g/L、枸橼酸5g/L的溶液。将半成品分装于西林瓶中冻干，即为腮腺炎减毒活疫苗成品。冻干方法为：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-35℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时。实施例4以腮腺炎病毒S79株制备的工作种子接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液后，将冻干保护剂与病毒收获液按1:4(V/V)的比例混合制备疫苗原液，其中，冻干保护剂在疫苗原液中的终浓度为蔗糖30g/L、谷氨酸钠3g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钠5g/L、枸橼酸2g/L。向疫苗原液中加入适量pH6.8～7.0的稀释液，使得目标病毒滴度为5.8lgCCID50/ml，即获得半成品溶液；其中，稀释液为含有蔗糖30g/L、谷氨酸钠3g/L、尿素2g/L、磷酸氢二钠5g/L、枸橼酸2g/L的溶液。将半成品分装于西林瓶中冻干，即为腮腺炎减毒活疫苗成品。冻干方法为：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-35℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时。实施例5以腮腺炎病毒S79株制备的工作种子接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液后，将冻干保护剂与病毒收获液按1:4(V/V)的比例混合制备疫苗原液，其中，冻干保护剂在疫苗原液中的终浓度为蔗糖80g/L、谷氨酸钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、枸橼酸0.2g/L。向疫苗原液中加入适量pH6.8～7.0的稀释液，使得目标病毒滴度为5.8lgCCID50/ml，即获得半成品溶液；其中，稀释液为含有蔗糖80g/L、谷氨酸钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、枸橼酸0.2g/L的溶液。将半成品分装于西林瓶中，冻干，即为腮腺炎减毒活疫苗成品。冻干方法为：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-35℃，达到最终温度的时间为17小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时。对以上3～5实施例制得的腮腺炎减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定，并与科兴(大连)疫苗技术有限公司的已上市产品(含明胶和人血清白蛋白)的腮腺炎减毒活疫苗产品进行对比。质量标准如下：(1)外观：淡黄色疏松体，复溶后为淡黄色液体，无异物。(2)水分：依《中华人民共和国药典》三部(附录ⅫD)检查，应不高于3.0％。(3)病毒滴定：采用微量细胞病变法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接Vero细胞，置36.5±1℃、5％CO2培养，培养8天判定结果，病毒滴度应不低于4.0lgCCID50/ml。结果见表1、表2。表1腮腺炎减毒活疫苗37℃加速稳定性结果※为科兴(大连)疫苗技术有限公司已上市的腮腺炎减毒活疫苗产品批号。表2腮腺炎减毒活疫苗2～8℃长期稳定性结果※为科兴(大连)疫苗技术有限公司已上市的腮腺炎减毒活疫苗产品批号。对以上3～5实施例的保护剂生产的成品分别于进行安全性评价，并与科兴(大连)疫苗技术有限公司的已上市产品(含明胶和人血清白蛋白)的腮腺炎减毒活疫苗产品进行对比。评价标准如下：(1)细菌内毒素检查：依《中华人民共和国药典》三部(附录ⅫE凝胶限度试验)检查，应不高于50EU/剂。(2)豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。试验结果如下表3：表3腮腺炎减毒活疫苗安全性评价实施例细菌内毒素检查豚鼠全身主动过敏试验3<1.25阴性4<1.25阴性5<1.25阴性201210003※<12.5阴性※为科兴(大连)疫苗技术有限公司已上市的腮腺炎减毒活疫苗产品批号由以上数据可以看出，本发明的不含明胶和人血白蛋白保护剂与目前常规使用的含明胶和人血白蛋白保护剂相比，稳定性结果无显著性差异，但是本发明的疫苗冻干保护剂提高了疫苗的安全性，可降低疫苗的不良反应。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3