工程化机械功能性人类软骨和其制备方法与流程

关于联邦政府赞助研究的声明

本发明是在由国家卫生研究院授予的授权号为de016525和eb002520的政府支持下完成。政府具有本发明中的某些权利。

本公开涉及组织工程化领域，并且更具体地涉及组织工程化机械功能性人类软骨。

背景技术：

随着世界人口老龄化，多年来膝盖和髋关节置换术估计增加多倍。此外，肌肉骨骼损伤(例如运动损伤)正在增加，在过去十年中，儿科人群增加了一倍以上。

在体外由患者的细胞产生功能性组织将通过提供由于损伤、疾病或老化而损失或损坏的组织的生物替代物而彻底改革再生医学。对胚胎发育和干细胞生物学的日益增长的理解极大地影响了支架设计、细胞操作以及调节干细胞分化和组织形成的因子(生物化学和物理)的合并的组织工程改造方法。

组织工程改造是软骨再生特别感兴趣的，因为软骨因其无血管性仅展现出极小的内源性愈合能力。软骨疾病的标志特征包括机械特性的损失、胶原蛋白降解、蛋白多糖合成减少以及细胞性降低。修复局灶性软骨病变的方法包括激光焊料焊接、经由骨膜移植物进行的自体移植细胞/组织转移、镶嵌式成形术以及用于软骨再生的自体软骨细胞植入法。虽然这些选择可暂时缓解症状，但它们也会带来长期的问题。

在软骨组织工程改造中，已将支架材料与原代牛软骨细胞一起用于工程改造具有接近于天然组织的特性的软骨。然而，当与人类间充质干细胞(hmsc)一起使用时，这些方法产生了非正常软骨组织，人类间充质干细胞是临床应用的优选细胞来源。

工程改造组织(或甚至器官)的生物替代物变得越来越可信，但仍然面临重大障碍。软骨为组织工程师的主要关注点，因为它是仅含有一种细胞类型的无血管组织，并且最初被认为是一个容易的目标。举例来说，由从患者的膝盖收获并且在培养物中扩增的自体软骨细胞进行的软骨修复提供了细胞治疗产品。然而，从患者的膝盖收获自体软骨细胞与关节炎的发病和风险相关。不同的细胞来源(诸如骨髓或脂肪hmsc)将引起很高的临床兴趣，因为它将避免从膝盖收获组织。

此外，已使用自体和同种异体hmsc作为营养因子的来源，以在临床试验中诱导软骨再生。这些方法中没有一个能产生机械功能性人类软骨。迄今为止，由hmsc产生的软骨的组成和机械特性仍然低于由软骨细胞实现的组成和机械特性。因此，仍然需要机械功能性软骨组织的有效组织工程改造。

技术实现要素：

在第一方面，提供一种包括具机械功能性的工程化人类软骨的医疗装置。工程化软骨展现出天然人类软骨的特性。举例来说，但不限于，工程化软骨具有>800kpa的杨氏模量(young’smodule)和<0.3的平衡摩擦系数。在其他实施方案中，工程化人类软骨具有生理分层特性、刚度或摩擦学特性。

在一个实施方案中，将工程化人类软骨附着至骨基底。在此方面，医疗装置为植入物。在一些实施方案中，工程化人类软骨为解剖学形状的，并且可用于置换或修复骨骼。在此方面，医疗装置和/或工程化软骨可为临床尺寸的，例如厘米尺寸。骨基底可为髁突的关节表面。可例如通过使患者的髁突成像并采用例如3d打印技术将髁突配置成对应于患者的解剖学人类髁突。因此，医疗装置可为针对特定患者的个性化骨软骨组织构建体。在另一个实施方案中，可将工程化软骨用于诸如注射笔等递送装置中，用于局部递送至骨缺损处。

在另一方面，主题涉及解剖学支架。支架包括脱细胞骨基质；和凝集间充质体。在一个实施方案中，凝集间充质体形成设置于骨基底上的致密细胞层。凝集间充质体的致密细胞层和骨基底形成分层结构。

在一些实施方案中，脱细胞骨基质为多孔的，并且凝集间充质体分散在多孔基质中。换句话说，凝集间充质体渗入多孔骨以形成构建体。

在另一方面，提供一种产生骨软骨构建体的方法。该方法包括培养人类间充质干细胞以形成凝集间充质体，然后使凝集间充质体融合或附着于骨基底上。

附图说明

参考附图提供对本文所描述的主题的各个方面、特征以及实施方案的详细描述，以下简要描述附图。图式为说明性的，并且未定按比例绘制，为清楚起见，将一些组件和特征放大。图式说明本主题的各个方面和特征，并且可整体或部分地说明本主题的一个或多个实施方案或实施例。

图1展示所公开主题的一个实施方案，其中第3天示出了由1×10⁵至2×10⁶个hmsc形成的cmb(比例尺：1mm)。在此实施方案中，(1-5)×10⁵范围内的细胞数目使得形成凝集球形cmb，而更高的细胞数目产生扁平的cmb。

图2展示一个实施方案，其中对凝集细胞体中的dna含量进行定量并且标准化为初始接种dna含量，表明聚集效率随细胞数目增加而降低。

图3为根据本公开的一个示例性实施方案的cmb的凝集和整合的示意性说明。

图4展示根据本公开的一些示例性实施方案cmb在三色染液(trichrome)和染色的腱生蛋白(边界确定的指示)中1、3、5、7以及9天时的切向细胞衬里(比例尺：100μm)。

图5展示根据本公开的实施方案通过tnc和sdc3基因的高表达以及增加的hoxa2和cdh2基因表达对cmb的边界的表征。软骨形成因子sox9随着cmb变得更加成熟而逐渐增加。纤连蛋白表达fn保持恒定。

图6展示根据本公开的实施方案cmb在不同发育阶段的融合(比例尺：200(μm)。在融合后7-9天时，与早期cmb(第1-5天)相比，所有cmb在周边显示腱生蛋白沉积(上排)。融合的早期cmb中的软骨形成产生均匀的糖胺聚糖结构(下排)，而在融合的后期cmb中清楚地看到相邻cmb之间的边界(箭头)。

图7展示根据本公开的实施方案在骨基底上形成关节软骨的方法，其中将cmb放入pdms环中，插入骨支架并且压至cmb上以使cmb融合并渗入支架孔隙内部，从而产生复合骨软骨构建体。在分化之后，细胞层形成软骨并且与多孔支架整合。

图8展示根据本公开的实施方案在融合后第1天和第5周的cmb和骨软骨构建体，其中生物工程化软骨和软骨下骨的组织学和免疫组织化学切片指示适当的基质组成和软骨形成。

图9展示关节软骨插入物的俯视图和侧视图，其中根据本公开的实施方案融合的cmb发育成覆盖整个构建体表面的厚软骨层。

图10说明了根据本公开的实施方案在5周的软骨形成诱导之后由第3天、第5天以及第7天的cmb形成的软骨层的dna、糖胺聚糖(gag)以及羟脯氨酸(hyp)的含量。软骨下区域具有类似的gag和hyp含量，而第7天的cmb的dna含量显著较低，表明迁移和整合能力降低。

图11说明了根据本公开的实施方案的cmb融合的方法，其中将cmb放置于呈确切髁突形状的模具的软骨侧，将解剖学形状的多孔支架放置于另一侧，并且将两片式模具压合。cmb融合在一起，并且沿着关节表面以厚细胞层的形式粘附于支架。

图12展示根据本公开的实施方案在5周的培养之后在下面骨骼上的关节软骨的解剖层。

图13展示对根据本公开的实施方案进行过h&e染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图14展示对根据本公开的实施方案针对gag进行过阿尔新蓝(alcianblue)染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图15展示对根据本公开的实施方案针对抗ii型胶原蛋白进行过染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图16展示对根据本公开的实施方案针对抗润滑素进行过染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图17展示对根据本公开的实施方案针对抗i型胶原蛋白进行过染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图18展示对根据本公开的实施方案针对抗x型胶原蛋白进行过染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。

图19展示根据本公开的实施方案的软骨修复方法，其中通过活检穿孔形成1.5mm直径的软骨缺损，并且用压过的cmb填充以进行融合并且填满缺损。

图20说明了根据本公开的实施方案通过所测量的破坏整合表面所需的峰值力和剪切应力在5周的软骨形成诱导之后天然软骨与cmb形成的软骨组织之间的整合。

图21说明了本公开的实施方案归因于如由阿尔新蓝所指示的糖胺聚糖与ii型胶原蛋白的结构整合而实现的高整合强度(比例尺：50μm)。

图22说明了本公开的实施方案归因于如由抗ii型胶原蛋白免疫组织化学染色所指示的糖胺聚糖与ii型胶原蛋白的结构整合而实现的高整合强度(比例尺：50μm)。

图23示出了指示形成与软骨下骨接合的良好发育的软骨层的组织学和免疫组织化学切片。

图24说明了在软骨形成诱导5周之后在使用第3天、第5天以及第7天的cmb形成的构建体中软骨层和软骨下骨区域的生物化学组成。在软骨层中，在不同组间dna、gag以及羟脯氨酸(hyp)含量为类似的。在骨骼区域中，在由第7天的cmb制成的构建体中dna含量显著较低，表明较成熟的cmb展现出较小的迁移和整合能力。

图25说明了生物工程化软骨的摩擦学特性。针对使用第3天、第5天以及第7天的cmb制得的关节软骨所测量的摩擦系数(μ)在成人关节软骨的值的范围内，并且随加载时间的增加而增加，此行为指示软骨的粘弹性。μ最小：测试开始时的初始μ；μ平衡：测试1800秒之后的平衡μ值。

图26说明了在三色染色中软骨基质在骨软骨构建体中的组织。左侧示出了软骨层的整个横截面；右侧示出了表面层、中间层以及深层的高倍率图。i型胶原蛋白和x型胶原蛋白在软骨下区域(d)中高度表达，而在浅表区域(b)和深部软骨区域(c)中仅极少地表达。比例尺：(a)500μm；(b-d)50μm。

图27为具有从使间充质体(cmb)凝集开始进行人类骨软骨构建体的成像引导工程改造的步骤的流程图，所述间充质体衍生自人类间充质干细胞，与解剖学形状的支架接合并且在匹配的生物反应器腔室中培养。

图28展示根据本公开的实施方案制造骨软骨移植物。a将硅胶模具制成两片，并且将cmb放置于关节侧。b然后将通过对天然骨基质的图像引导处理所加工的解剖学形状的支架放入模具的另一侧。c将两片式模具融合在一起，使得模具将cmb在支架上压制成所需的关节表面形状。d在骨表面形成人类软骨的双天然样组织形态。然后将阶段性骨软骨构建体在匹配的解剖学形状的生物反应器腔室中培养。

图29示出了在骨表面由msc形成的人类软骨的天然样组织形态。在软骨形成培养基中培养5周后，致密细胞层发育成分层的软骨。ah&e，b阿尔新蓝，cii型胶原蛋白，d润滑素，ei型胶原蛋白以及fx型胶原蛋白。[比例尺：500μm]。

具体实施方式

现将详细地提到所公开的主题的示例性实施方案。将结合对系统的详细描述来描述所公开的主题的方法和相应步骤。

根据本公开的一个方面，提供了具有生理分层和生物力学的工程化人类软骨。根据一个示例性实施方案，提供了一种包括工程化人类软骨的医疗装置。可将医疗装置配置为插入物或植入物。包括工程化人类软骨的插入物可插入受试者的缺损处。插入物能够与受试者的组织整合。在另一个实施方案中，医疗装置为植入物。植入物包括固定至骨基底的工程化人类软骨。

在另一方面，描述一种工程改造机械功能性人类软骨的方法。关于该方法，已惊奇地发现，当暴露于转化生长因子-β时，间充质干细胞被诱导凝集成细胞体，经历软骨形成分化，并且形成展现出类似于天然人类软骨的特性的软骨组织。用于制备工程化人类软骨的现有技术方法在形成展现出类似于天然人类软骨的特性的机械功能性人类软骨中一直为失败的。

在一个示例性实施方案中，如由间充质凝集基因的表达和腱生蛋白的沉积所指示，在体外形成的凝集间充质细胞体(cmb)在培养约5天之后确定外部边界。在边界确定之前，cmb融合成均匀的细胞聚集体，从而产生充分分化的和机械功能性的软骨。使用间充质凝集和cmb的融合经5周的培养来生长厘米尺寸的解剖学形状的人类关节软骨片。由此方法形成的软骨的生物力学特性类似于天然人类软骨。在一个实施方案中，工程化软骨具有>800kpa的杨氏模量和<0.3的平衡摩擦系数。现有的工程化软骨的方法尚未获得这些特性。已发现，在体外软骨缺损模型中cmb具有形成机械强度高的软骨-软骨界面的能力。cmb充当新生软骨的“乐高样(lego-like)”块，能够组装成具有生理样结构和机械特性的人类软骨。

根据本公开的各种实施方案，将细胞分化和早期软骨发育的信号提供至细胞环境中以工程改造机械功能性人类软骨。在一些实施方案中，提供了细胞自组装方法，所述细胞自组装方法模拟间充质凝集，其为骨骼和其他间充质组织的发育中的关键阶段，其由细胞粘附分子和细胞外基质(ecm)介导。在生理凝集期间，细胞可形成经历一系列间充质凝集阶段的致密细胞体。间充质凝集确定可界定细胞体随后生长和分化的边界。在体外，间充质干细胞显示在诸如tgf-β等调节因子存在下经历细胞凝集和软骨形成。

根据各种实施方案，提供间充质干细胞凝集作为用于工程改造功能性人类软骨的方法。可通过在凝集边界确定之前融合来诱导凝集间充质细胞体(cmb)形成大的均匀细胞聚集体。此方法可产生具有生理分层、刚度以及摩擦学特性的厘米尺寸的解剖学形状的关节软骨构建体。cmb在体外软骨-缺损模型中显示修复软骨的能力。此方法可用于再生医学；不仅用于软骨背景下，而且用于源于间充质凝集的其他组织。

如本文所描述，对间充质凝集一些方面的重述已使得从hmsc形成功能性软骨。参看图1至6，在体外研究hmsc凝集和边界确定。如图所示，在一个实施方案中，hmsc在1天内经历凝集成cmb，并且边界早在聚集后7天时即确定。

发育研究表明，腱生蛋白-c和多配体聚糖-3(间充质凝集期间的主要边界确定蛋白)在发育中的鸡肢体周围高度表达，从而形成肱骨、桡骨以及尺骨的轮廓。在边界确定之前，仅早期cmb(<7天)可均匀融合并且被诱导进入软骨形成分化并且形成大的并且具功能性的软骨组织。这些发现与所报导的腱生蛋白-c在调控细胞粘附至纤连蛋白中的作用是一致的。

根据本公开的各种实施方案，如图7-10中所示，在体外通过使cmb融合并且诱导其发生软骨形成分化同时还与软骨下骨形成界面成功地工程改造了具有生理压缩模量和润滑特性的大软骨组织。

在一个实施方案中，将hmsc悬浮于补充有tgf-β3的培养基中，并且使其在孔的底部聚集，在孵育12小时之后凝集成单一细胞体。到第3天，如图1所示，与形成指示不充分凝集双凹面盘结构的较大聚集体(含有5×10⁵至2×10⁶个细胞)相比之下，小聚集体(含有<5×10⁵个细胞)形成致密的球形细胞体。图2显示对于小聚集体来说，细胞性的相对增加也比大聚集体更高。选择2.5×10⁵个细胞来形成cmb。

在聚集之后，cmb发育并且在长时间段内维持其球形结构。为研究组织边界的形成，检验了腱生蛋白的产生和定位，腱生蛋白为间充质凝集中的边界确定蛋白。腱生蛋白的产生随时间推移而增加，使得到凝集第7天，富含腱生蛋白的ecm存在于cmb的整个外表面，从而确定晚期凝集阶段的边界(图4)。纤连蛋白(fn1)的表达保持稳定，而软骨形成分化因子性别决定区y(sry)-box9(sox9)、细胞粘附同源盒转录因子a2(hoxa2)、细胞粘附钙粘蛋白2(cdh2)基因以及边界确定蛋白腱生蛋白c(tnc)和多配体聚糖3(sdc3)的表达全部随时间推移而增加(图5)，从而为凝集过程的成熟和间充质凝集边界的确定提供证据。

cmb在培养7-9天内形成边界，并且研究了它们在各个发育阶段彼此均匀融合的能力(图3)。在融合后7天时，腱生蛋白存在于cmb的外表面和相邻cmb之间，表明整合不充分(图6)。围绕不断成熟的cmb(7-9天)确定的边界围绕组织体产生良好建立的边界，所述良好建立的边界在5周的软骨形成分化内被维持(图6)。相比之下，当早期cmb(凝集1-5天)融合在一起时，实现均匀整合(图6)。

参看图7和8，制备包括由融合的cmb产生的功能性软骨的医疗装置。在此示例性实施方案中，将cmb层附着于多孔脱细胞骨基质。产生致密细胞区域(关节软骨的前体)，并且促使cmb渗入骨基质(软骨下区域的前体)。致密细胞层发育成软骨并且在培养超过5周时与骨基质整合(图8和9)。观测到，如通过软骨下区域的细胞含量所测量，早期cmb(1-5天)内的细胞比后期cmb(7天)中的细胞更具渗透性和迁移性(图4)。如由糖胺聚糖和羟脯氨酸的量所指示，融合的cmb在不同成熟阶段的软骨形成分化能力相似(图4)。参看表1，关节软骨组织的所得机械特性显著不同。相对于晚期cmb，对于早期cmb来说软骨的杨氏模量显著更高。相应摩擦系数不存在显著差异。值得注意的是，在体外历时5周从早期cmb工程改造的软骨的杨氏模量(平均大于800kpa，表1)和平衡摩擦系数(约0.28，表1和图1-2)在成人关节软骨的生理范围内。

*统计学上不同于其他组(p<0.05)。

在另一个实施方案中，使解剖学形状的软骨在体外生长。在此实施方案中，通过将cmb按压模制至解剖学形状的多孔骨支架上来工程改造髁突软骨(图1)。形成致密细胞层的cmb渗入支架，并且在5周的培养之后发育成覆盖支架的髁突表面的厚软骨层(>1mm)(图12)。组织学分析揭示生理样关节软骨组织表面(图13-18)。软骨ecm含有大量的糖胺聚糖和ii型胶原蛋白(图14-15)。在深部区(1303、1403、1503、1603、1703、1803)，在富含糖胺聚糖(1403)和ii型胶原蛋白(1503)的ecm所包围的空腔中发现细胞。浅表区(1302、1402、1502、1602、1702、1802)由扁平细胞组成，并且富含润滑素的ecm与关节表面相切排列(1602)。在软骨下区域中，ecm由糖胺聚糖、i型胶原蛋白以及x型胶原蛋白组成(1304、1404、1504、1604、1704、1804)。

在一个方面中，提供cmb在体外模型中进行的软骨修复。使用类似于以前所用的那些的体外软骨缺损模型，我们评估了cmb进行软骨再生的能力。融合的cmb完全填充软骨缺损并且在软骨形成条件下在培养5周之后与周围的软骨整合。整合强度由破坏融合的cmb和周围软骨之间的整合界面所需的力和应力决定。在cmb组中，所述力与应力均比在未处理的对照缺损中高两个数量级(分别为2.5±0.48n相较于0.03±0.02n；399±56kpa相较于4.4±1.9kpa)(图20)。高整合强度与通过融合的cmb形成软骨ecm相关(图21-22)。

不同于先前提出的用于软骨组织工程改造的基于支架的或自聚集的技术，本公开的方法模拟紧密堆积的细胞聚集体中的间充质凝集，所述紧密堆积的细胞聚集体最终发育成与下面的骨接合的良好分层的软骨。在5周的培养之后针对工程化软骨所测量的压缩模量和摩擦系数在针对天然关节软骨所测量的值的范围内。虽然总胶原蛋白含量低于天然软骨，但是类似于来自软骨细胞的工程化软骨的结果，所得压缩模量与高gag密度相关(图7-10)。cmb在凝集边界确定之前融合为形成功能性软骨构建体以及其与下面的骨无缝整合所必需的。迄今为止，尚未通过任何从hmsc形成软骨的方法实现如此的生物保真度。

通过使用早期cmb的自由成形特性，工程改造了连续的1-mm厚软骨层，所述软骨层覆盖解剖学脱细胞骨骼支架的髁突表面，具有类似于天然关节软骨的组成、结构以及机械和表面特性(图11-18)。浅表表面与其富含润滑素的层的分层形成(图16)与软骨表面的生理上低的摩擦系数(表1)相关。此外，在软骨层与软骨下区域之间的界面处存在x型胶原蛋白(图18)表明产生钙化软骨。大构建体内的骨界面附近的gag密度比富含x型胶原蛋白与gag的天然软骨-骨界面中低，表明需要分化至更肥厚的软骨细胞谱系或更长的培养时间。进一步的研究还将需要确认基于cmb的软骨如果通过体外肥厚方案激发并且在植入关节后仍然为可利用的。

使用体外软骨-缺损模型进一步检验融合cmb的效用(图19-22)。在软骨形成诱导之后，融合的cmb填充缺损并且在机械和结构上与周围的天然软骨整合。这种整合能力有望使得可类似于软骨球系统通过简单的注射递送来临床施加cmb以修复缺损。

根据本公开的各种实施方案，可通过模拟间充质凝集关键发育过程的一些方面使与软骨下骨基底接合的机械功能性人类软骨在体外生长。此技术产生具有生理分层、杨氏模量(>800kpa)以及摩擦系数(<0.3)的临床尺寸和解剖形状的人类软骨。如由形成整合强度为400kpa的软骨-软骨界面所证实，可使用相同技术来修复天然关节软骨中的缺损。可将相同技术扩展到对其他组织进行生物改造，诸如肌腱或半月板，并且扩展到使用其他细胞来源，诸如胚胎和诱导性多能干细胞。

实施例

骨髓衍生的人类间充质干细胞从cambrex获得新鲜的人类骨髓抽吸物。通过将骨髓衍生的人类间充质干细胞(hmsc)附着至塑料表面来将其分离。使细胞在补充有10％fbs、1％青霉素-链霉素(pen-strep)以及0.1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的dmem中扩增。hmsc被培养至第三代并且显示展现出多谱系分化能力。

凝集间充质体(cmb)的产生将hmsc悬浮于培养基(补充有100nm地塞米松(dexamethasone)；50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐；100μg/ml丙酮酸钠；40μg/ml脯氨酸；1％胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠[its+]混合物；1％抗生素以及10ng/ml转化生长因子-β3[tgf-β3]的高葡萄糖dmem)中。为确定cmb的最佳尺寸，将hmsc以10⁵、2.5×10⁵、5×10⁵、106、1.5×10⁶以及2×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮。将1ml的细胞悬浮液添加至深圆底96孔板(sigma-aldrich,mo)中并且以250g离心5min。在受控的加湿腔室(37℃，5％co2)中孵育细胞并且每天更换培养基持续3天。使样品(n＝4)成像并且收集以分析dna含量。所有实验中均利用使用2.5×10⁵个细胞制得的cmb，这是归因于其最高凝集能力(图1-2)。

为检验cmb成熟度，将cmb在培养基中孵育并且从离心后第1天开始每隔一天收集长达9天。将cmb固定在10％福尔马林(formalin)中或储存在trizol中(n＝4)。为测试cmb融合能力，在离心后第1天、3天、5天、7天以及9天时将三个cmb按压至聚二甲基硅氧烷(pdms)孔(直径3mm并且2mm深)内。将融合的cmb再培养7天。在石蜡切片中对cmb的融合进行组织学研究。

关节软骨的制造为制造圆柱形关节软骨，将八个cmb(第3天、第5天或第7天)放置于内径4mm×4.5mm厚的pdms环中。将脱细胞小梁骨基质支架(直径4mm×4mm厚)2在cmb顶部按压至环内部。cmb融合在一起并且渗入多孔支架内部，从而产生构建体，其中细胞层在支架上为500μm厚(软骨区域)并且渗入软骨下区域(图22-23)。将构建体培养5周并且进行机械(n＝4)、生物化学(n＝4)以及组织学分析。

为制造解剖学关节软骨、由从患者获取的ct扫描(在完全去识别化的图像的情况下，根据主动irb)获得人类髁突的3d图像。在髁突的关节表面上形成1-mm厚软骨区域。从3d打印的具有软骨层的髁突制造pdms模具，并且切割成两片：一片固持支架，而另一片固持用于按压模制cmb的关节软骨侧。将第3天的cmb(n＝120)在关节软骨侧放入模具内部。将如先前所描述从脱细胞小梁骨形成的解剖学人类髁突支架装配在pdms模具内部，并且降低至pdms模具的关节软骨侧以使cmb融合并且引导细胞渗入支架。将构建体在10ml培养基中培养5周，培养基每周换两次。

使用trizol法根据制造商的说明来纯化rt-pcrrna。使用具有引物的实时pcr机器(lifetechnologies^tm，ca)来定量间充质凝集转录因子(sox9和hoxa2)、细胞粘附基因(cdh2)以及凝集细胞外基质基因(fn1、tnc以及sdc3)：

表2

免疫荧光和免疫组织化学染色在固定之后，用immunocal溶液(如果含有脱细胞骨支架)对样品进行脱钙，进行石蜡包埋并且切割成5μm厚的切片。将切片用苏木精和曙红(h&e)、针对gag的阿尔新蓝以及三色染液染色。还针对胶原蛋白i、ii、x以及润滑素(abcam,ma)对样品进行免疫组织化学染色。利用n-钙粘蛋白和腱生蛋白抗体(millipore,ma)来进行免疫荧光染色。

生物化学分析如先前所描述测量dna、gag以及羟脯氨酸含量。简言之，沿多孔脱细胞骨支架的扁平表面分离软骨和软骨下区域，并且测定湿重。在50℃下在0.5ml蛋白酶k溶液中消化样品(n＝4个/组)。使用picogreen分析(molecularprobes,or)来测定dna含量。使用1,9-二甲基亚甲基蓝(dmmb)染料量热分析以软骨素-6-硫酸盐作为标准物来测定提取物的硫酸化gag(s-gag)含量。通过酸水解测量羟脯氨酸含量。关节软骨的机械测试如先前所描述在pbs中使用无侧限压缩来测量软骨的压缩杨氏模量。将圆柱形构建体以0.01％应变/s压缩长达3,000秒，并且测量压缩负荷。由应力-应变曲线的线性斜率计算杨氏模量。

如先前所描述在pbs浴中在无侧限压缩中测量软骨与玻璃之间的摩擦系数。利用速度为1mm/s并且平移范围为±10mm的连续往复滑动。在整个测试中监测软骨的法向力、摩擦力以及轴向变形。所有测试在1,800秒之后终止。由摩擦力与法向力的比率计算时间依赖性摩擦系数μ有效。最小摩擦系数μ最小和平衡摩擦系数μ平衡分别表示μ有效的最小值和运行结束时所实现的值。

统计分析使用多因素方差分析(anova)继之以特基氏多重比较测试(turkey’smultiplecomparisontest)使用a为0.05的prism软件来进行结果的成对比较。

cmb的产生和融合.为产生cmb，将hmsc悬浮于软骨形成培养基(补充有10ng/mltgf-β3；100nm地塞米松；50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐；100μg/ml丙酮酸钠；40μg/ml脯氨酸；1％胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠(its)+混合物；以及1％青霉素-链霉素的高葡萄糖dmem)中。为确定cmb的最佳尺寸，将hmsc以10⁵、2.5×10⁵、5×10⁵、10⁶、1.5×10⁶以及2×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮。将一毫升的细胞悬浮液等分至深圆底96孔板(nunc；sigma-aldrich)中并且以250×g离心5min(图3)。在受控的加湿腔室[37℃，5％(体积/体积)co2]中孵育细胞并且每天更换培养基至第3天。使样品成像并且收集以分析dna含量(n＝4)。所有实验中均使用使用2.5×10⁵个细胞形成的cmb，这是归因于其可凝集性以及紧凑球形cmb的形成。为研究cmb的发育和成熟度，将其在培养基中孵育并且从离心后第1天开始每隔一天收集长达9天。将cmb固定在10％(体积/体积)福尔马林中用于组织学和免疫组织化学分析，或储存在trizol中(n＝4)用于基因表达分析。为测试cmb的融合能力，在离心后1、3、5、7以及9天时用不锈钢块将三个cmb按压至聚二甲基硅氧烷(pdms)孔(直径3mm并且2mm深)内(图3)，培养长达5周，并且进行组织学评估。

圆柱形软骨插入物的产生.将八个cmb(第3天、第5天或第7天)放入pdms环(内径4mm×4.5mm高)内部。如先前所描述处理脱细胞圆柱形小梁骨基质支架(直径4mm×4mm高)并且在cmb顶部按压至环内部。通过将骨部分按压至cmb层中来形成骨软骨构建体。模具的内部几何形状具有0.5mm的自由空间用于形成软骨层，保持了从一个样品到另一个样品所施加压力的一致性。可通过将cmb层按压至不锈钢块上而不是在不施加压力的情况下通过cmb的自发融合来可重复地形成软骨层。将构建体培养5周并且进行机械(n＝4)、生物化学(n＝4)以及组织学(n＝4)分析。

解剖学形状软骨的产生.如我们的先前研究中，从患者的ct扫描获得解剖学人类髁突的3d图像。从重建的3d图像设计了1-mm厚软骨区域以覆盖髁突的关节表面。对于上文所描述的骨软骨插入物，通过使用提供1mm自由空间用于形成软骨层的模具将骨部分按压至cmb层中来形成解剖学形状的构建体。形成pdms模具并且切割成两片：一片固持支架，而另一片容纳用于按压模制cmb的关节软骨侧(图11)。将总计120个cmb(第3天)在关节软骨侧放入模具内部。将如先前所描述从脱细胞小梁骨形成的解剖学人类髁突支架装配在pdms模具内部，并且降低至pdms模具的关节软骨侧以使cmb融合并且将其模制成细胞渗入支架的解剖学形状。将构建体培养5周，培养基每周换两次。

软骨缺损模型.从2月至4月龄奶牛的腕掌关节挖出骨软骨外植体，并且切割成圆柱体(直径4mm×4-6mm厚)。通过用1.5-mm活检穿孔器去除外植体中心的一块软骨形成软骨环而使软骨下骨保持完整来形成软骨-缺损模型。将四个cmb放入空的软骨空隙内部并且通过用扁平不锈钢块按压来压实(图19)。将构建体在软骨形成培养基或扩增培养基(阴性对照)中培养5周，并且进行机械(n＝4)和组织学(n＝4)分析。

解剖学支架和生物反应器腔室的制造.基于正在修复的缺损的磁共振或计算机断层摄影图像来设计移植物。使用诸如创新套件(materialise,belgium)等计算机辅助软件将单个的切片转换为三维(3d)文件。在确定正在重建的移植物确切解剖学配合之后，将移植物的3d计算机模型导出为.stl文件，并且用于制造支架和匹配的生物反应器内部腔室。

为制造解剖学支架，将3d模型stl文件导入solidworks(dassaultsystemessolidworks,ma,usa)并且使用solidworks中的mastercam(cncsoftwareinc.,ct,usa)插件生成用于从一块材料研磨解剖学支架的g代码。本研究中所用的支架材料为在去除肌肉、髌骨、纤维结缔组织、韧带以及半月板并且仅留下暴露的股骨头之后从小牛膝盖收获的牛小梁骨。使用桌上型带锯，将关节软骨和皮质骨去除以分离松质小梁骨。使用车床(littlemachineshop,ca,usa)，将骨头成形成圆柱形块，直径刚好大于3d移植物模型的宽度而长度比3d模型长约3cm，使得在加工期间存在足够的结构来固持所述块体。我们在4轴cnc研磨机器(littlemachineshop,ca,usa)上使用四刃1/4”球头铣刀(mcmaster-carr,nj,usa)从圆柱形骨块制成解剖学骨支架的形状。使用我们先前良好建立的方法使用低渗溶液、洗涤剂、多次洗涤以及dna酶/rna酶溶液使解剖学形状的骨块完全脱细胞。

然后使用每个解剖移植物的相同3d图像来设计用于制造用于培养骨软骨构建体的内部生物反应器腔室的模具。通过在solidworks中使用表面选择工具来设定关节表面的形状和期望的厚度(大多数情况下为1mm或更多)而在关节表面上形成期望的软骨厚度。然后创建g代码以研磨用于固持构建体的特氟龙棒(teflonrod)(mcmaster-carr,nj,usa)。然后使用研磨件通过将184硅胶弹性体(dowcorning,mi,usa)浇注在研磨结构上来制成阴模。在固化后，将硅胶切成两片，一片固持脱细胞骨支架，而另一片固持凝集间充质体(cmb)，所述凝集间充质体将被抵靠关节连接表面按压至模具内部。通过高压灭菌对两片式模具进行灭菌。图27中示意性地示出了该过程的关键步骤。

骨髓衍生的间充质干细胞的制备.从骨科手术(对于完全去识别化的手术材料，通过非人类irb)或从诸如cambrex(nj,usa)等商业供应商获得新鲜的人类骨髓抽吸物。通过附着于细胞培养塑料来分离间充质干细胞(bmsc)，并且在补充有10％fbs、1％青霉素-链霉素以及0.1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)的dmem中扩增。将细胞培养至第三代并且测试多谱系分化能力。

凝集间充质体的产生.在胰蛋白酶消化之后，将bmsc以5×10⁵个细胞/ml的浓度悬浮于软骨形成培养基中，所述软骨形成培养基由补充有100nm地塞米松；50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐；100μg/ml丙酮酸钠；40μg/ml脯氨酸；1％胰岛素、转铁蛋白以及亚硒酸钠(its+)的混合物；1％青霉素/链霉素以及10ng/ml转化生长因子-β3(tgf-β3)的高葡萄糖dmem组成。将1ml细胞悬浮液添加至深圆底96孔板(sigma-aldrich,mo)的孔中，并且以25g离心5min。将细胞在37℃/5％co2)下孵育过夜以形成球形cmb，所述球形cmb用于产生骨软骨组织构建体的软骨层。

组织构建体的制造.在培养3天之后，球形cmb生长至直径刚好超过1mm。可使用等式1由需要工程改造的软骨层的体积计算每个构建体所用的cmb数日。

等式1

举例来说，对于具有1cm²和1mm厚的表面的关节软骨层来说，将需要190个cmb，这190个cmb被转移到模具的关节侧。然后将解剖学支架插入模具的另一侧并且缓慢按压至关节侧上(图28)。通过施加压缩力，使得cmb融合在一起并且在关节表面上以均匀的深度成形。重要的是，足够量的融合的cmb渗入骨相以驱动正在形成的软骨与骨骼之间的整合。将骨软骨组织构建体在软骨形成培养基中培养5周，每一cmb使用100μl的培养基体积，培养基每周换两次。

在按压模制之后，融合的cmb在模具内部在骨基底的表面上形成致密细胞层。初始构建体由两个清楚区分的层组成：(i)致密细胞层，所述致密细胞层将在培养之后形成软骨表面，以及(ii)骨基底。融合的cmb渗入骨基底形成一个界面，所述界面通过形成分层结构逐渐将两个层互锁。

在软骨形成培养基中培养5周之后，形成骨软骨组织构建体，其具有致密的软骨组织层、下面的骨组织以及其间的界面(图29)。这些构建体展现出非常发达的分层结构，其从软骨到骨区域具有天然样梯度的结构和组成特性。软骨区域富含天然关节软骨的主要组分糖胺聚糖和ii型胶原蛋白，而i型胶原蛋白大部分存在于骨区域中(图29)。值得注意的是，关节连接软骨表面的润滑所必需的蛋白质润滑素存在于软骨层的浅表表面。

界面由驻留在支架孔隙中的细胞组成，其仅沉积了少量的糖胺聚糖和ii型胶原蛋白，并且实际上由i型胶原蛋白和x型胶原蛋白包围，指示形成钙化软骨。

此方法首次产生从人类msc工程改造的软骨，其实现了在生理范围内的机械特性。在压缩中测量的杨氏模量与在组织工程化软骨的摩擦学研究中测量的摩擦系数均类似于在年轻的天然软骨中所测量的那些(表3)。

本文所描述的方法利用bmsc的自组装机制，特别是关于在肢体发育期间在软骨形成之前的天然间充质凝集过程的潜在机制。此技术要求理解通过使bmsc凝集来确定外部边界。在形成球形细胞体之后，bmsc开始分化并且沉积细胞外基质。此基质的关键组分之一为腱生蛋白，其为在确定组织边界的间充质凝集期间所沉积的边界确定蛋白。

在bmsc在体外凝集期间，到凝集后第5天，腱生蛋白开始在周边的椭球体的外表面积聚，此为边界确定的指示。间充质体上这些外部边界的确定即使在它们被彼此按压时也阻止其融合。这进而表明，如果在椭球体形成5天内诱导融合，那么仅可产生单独或在骨软骨构建体内的较大体积的软骨。

实际上，对通过bmsc的凝集形成的间充质体的按压模制(图28)产生致密的并且空间上均匀的细胞层。此致密细胞层类似于在体内在天然间充质凝集期间形成的层，并且其充当软骨形成的平台。在体外，这些具有非常高的细胞密度的紧凑层诱导细胞外基质的快速沉积。因此，工程化组织的机械强度高，并且杨氏模量与摩擦系数均达到生理水平(表3)。同时，压实的细胞层发育成在表面含有润滑素、在主体相中含有蛋白聚糖和ii型胶原蛋白、在与骨基底的界面处含有x型胶原蛋白并且在骨相内含有i型胶原蛋白的生理分层的软骨(图29)。

因此，在与骨基底的界面处由bmsc形成的间充质体的融合可为产生具有生理组成、组织形态以及机械特性的人类骨软骨组织构建体的有效方法。此方法使得从bmsc生长的人类软骨能够达到生理刚度和摩擦系数。此外，所述方法允许使用通过成像引导制造制成的支架产生的解剖学形状的骨软骨构建体的工程改造。

软骨层厚度为2mm的1cm²软骨表面的重建需要差不多10000万个bmsc。为重建整个髁突，将需要亿万个细胞。为减少此数目，可将间充质凝集与使用支架以及利用容易获得并且丰富的间充质细胞来源(诸如脂肪组织)相组合。

虽然本文中根据某些示例性实施方案描述了所公开的主题，但是本领域技术人员将认识到，可对所公开的主题作出各种修改和改进而不会脱离其范围。此外，尽管可能在本文中讨论了或在一个实施方案的图式中而未在其他实施方案中示出所公开主题的一个实施方案的单个特征，但是应当显而易见的是，可将一个实施方案的单个特征与另一个实施方案的一个或多个特征或多个实施方案的特征组合。

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