氨基酸补充的制作方法
本披露总体上涉及包含氨基酸的组合物和此类组合物的如下用途：作为补充在汗水中损失的氨基酸的补充剂，帮助从运动、疾病或损伤中恢复，运动期间的表现以及在极端气候条件下的存活。
背景技术：
氨基酸是用于体内结构蛋白和功能蛋白的生物合成的必需代谢物。取决于具体的作用，各种功能蛋白经历连续的周转，以提供对运动、食物摄取、致病性攻击和组织损伤修复产生的生理需求的代谢控制和适应。氨基酸还具有作为“自由”代谢物的广泛重要作用，其中一些可直接充当抑制性神经递质(例如甘氨酸)或充当合成激素(从酪氨酸合成肾上腺素和去甲肾上腺素)和神经递质(从谷氨酸合成γ-氨基丁酸)的前体。
哺乳动物摄取食物后，蛋白质被消化，并且所得到的游离氨基酸和小肽被吸收供体内利用。在运动过程中，血液供应从消化道转移到提供氧气以激活肌肉，并且因此不能支持食物的消化。因此，当身体进行运动时，通过在运动期间和运动之后立即分解代谢非纤维肌储存蛋白来补偿自由循环氨基酸的减少。这提供了可以在血液内循环并用于代谢途径中(包括在用以产生能量的氧化磷酸化或葡萄糖-丙氨酸循环中)的氨基酸。
由于游离氨基酸作为易于氧化的能量来源的功用以及某些氨基酸残基作为组织分解代谢指标的相关性，血浆氨基酸水平的测量代表了了解肌肉状况、蛋白质周转和运动员响应运动的能量代谢的潜在有价值的途径。在健康的静息成人中，血浆氨基酸水平反映了营养摄入和组织释放(与组织摄取和身体排泄相对)之间的紧密调节的体内平衡。运动的发生代表着对静息体内平衡的干扰，这是支持肌肉代谢需求所需要的。发生特定氨基酸的肌肉组织摄取和释放速率的改变以支持导致运动后血浆曲线相对于运动前曲线改变的需求。
在运动停止时从组织释放到血浆中的游离氨基酸在理论上可用于再摄取或排泄以及恢复体内平衡。氨基酸和电解质可以通过汗水和水润湿皮肤表面而从皮肤的外角质层中浸出。这种浸出导致汗液中氨基酸浓度的净增加。在尿液和汗水中排出的氨基酸水平代表氨基酸的净损失，氨基酸最终必须通过饮食摄入来补充。
本发明是基于本发明人关于在最终汗水中占优势的氨基酸与来自皮肤表面的贡献的组合的发现而断定的，确定了用以补偿汗水促进的氨基酸损失的包含氨基酸的特定组合的组合物和配制品。此外，鉴定汗水促进的氨基酸损失的具体曲线或表型使得有可能构想并实施曲线或表型指导的氨基酸补充方法，其具有根据个体需要定制补充的益处。
技术实现要素：
在第一方面，本文提供了包含组氨酸、丝氨酸和赖氨酸的氨基酸组合物，其中组氨酸、丝氨酸和赖氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约25％。
在一个实施例中，组氨酸、丝氨酸和赖氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约30％。在另一个实施例中，组氨酸、丝氨酸和赖氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约30％和50％之间。在又另一个实施例中，组氨酸、丝氨酸和赖氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约32％和47％之间。
在一个示例性实施例中，组氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约10％至21％之间，丝氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约13％至16％之间，并且赖氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约9％和10％之间。
第一方面的氨基酸组合物可以另外包含鸟氨酸和甘氨酸中的至少一种。当存在时，鸟氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约12％，和/或甘氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约8％。该组合物可以包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和甘氨酸，其中这些氨基酸构成该组合物中氨基酸总重量的至少约40％，或构成该组合物中氨基酸总重量的约50％和约80％之间。
第一方面的氨基酸组合物可以另外包含谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸中的至少一种。当存在时，谷氨酰胺和/或谷氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约10％，亮氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约10％，和/或天冬氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约7％。该组合物可以包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸，其中这些氨基酸构成该组合物中氨基酸总重量的至少约35％，或构成该组合物中氨基酸总重量的约40％和约60％之间。
在一个示例性实施例中，该氨基酸组合物可以包含丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和酪氨酸。这样的组合物可以被配制用于给予马。
在第二方面，本文提供了包含组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和甘氨酸的氨基酸组合物，其中组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和甘氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约30％。
在示例性实施例中，组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和甘氨酸一起可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约60％、至少约64％或至少约76％。
在第三方面，本文提供了包含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸的氨基酸组合物，其中丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约20％。
在一个实施例中，第三方面的氨基酸组合物被配制用于给予雌性受试者。
典型地，本文披露的氨基酸组合物用作膳食补充剂。在具体实施例中，这些组合物促进或帮助受试者从运动、疾病或损伤中恢复，减轻疲劳，帮助受试者在炎热气候下存活，或者促进或帮助运动表现。
本文披露的氨基酸组合物可以包含指定的氨基酸、由其组成或基本上由其组成。
在第四方面，本文提供了用于促进或帮助受试者从运动、疾病或损伤中恢复的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在第五方面，本文提供了用于帮助受试者在炎热气候下存活的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在第六方面，本文提供了用于促进或帮助受试者的运动表现的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在第七方面，本文提供了用于提高受试者血液中的血红蛋白和/或血细胞比容水平的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在第八方面，本文提供了用于向年长者提供营养支持的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在第九方面，本文提供了用于减轻受试者疲劳的方法，该方法包括向受试者给予有效量的第一或第二方面的氨基酸组合物。
在一个实施例中，受试者可能患有慢性疲劳。受试者可能患有慢性疲劳综合征。在受试者是雌性的实施例中，待给予的氨基酸组合物可以例如至少包含天冬氨酸、天冬酰胺、鸟氨酸和甲硫氨酸。在受试者是雄性的实施例中，待给予的氨基酸组合物可以例如至少包含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和甲硫氨酸。
在第四至第九方面中任一项的方法中，受试者可以是人，并且待给予的组合物的有效量可以在约50mg和10克/天之间。
在第四至第九方面中任一项的方法中，受试者可以是马，并且待给予的组合物的有效量可以在约5至50克/天之间。
在第十方面，本文提供了用于确定待向受试者给予的膳食补充剂的方法，该方法包括：
a)使受试者进行足以产生汗水的运动；
b)确定所述汗水中的氨基酸组成；
c)基于所述汗水中的总氨基酸浓度确定受试者的汗水促进的氨基酸损失曲线，其中小于约4,000μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示‘低’曲线，约4,000和10,000μ摩尔l-1之间的氨基酸浓度表示‘中’曲线，并且大于约10,000μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示‘高’曲线；
其中依照低、中或高汗水促进的氨基酸损失曲线将受试者分层确定了待给予的补充剂的量(或剂量)以及任选地待给予的所述补充剂的量或剂量。
在一个示例性实施例中，从受试者背部收集汗水，以确定步骤c)中的氨基酸浓度。
在一个示例性实施例中，受试者的汗水促进的氨基酸损失曲线的确定另外包括确定汗水中的各氨基酸浓度，其中：(i)‘低’曲线由丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的约50％，丝氨酸是汗水的主要氨基酸成分；(ii)‘中’曲线由鸟氨酸、丝氨酸、组氨酸和甘氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的约70％，鸟氨酸是汗水的主要氨基酸成分；并且(iii)‘高’曲线由组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的约60％，组氨酸是汗水的主要氨基酸成分。
在第十一方面，本文提供了用于确定对待向受试者给予的膳食补充的需要的方法，该方法包括：
a)从受试者获得血浆样品；并且
b)确定所述血浆中的总氨基酸组成，其中小于约2,800μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示氨基酸的‘低’操作水平，指示需要补充。
根据第十和第十一方面，‘低’汗水促进的氨基酸损失曲线的确定可以指示用于受试者的包含丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸的氨基酸补充剂，其中丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约60％。
‘中’汗水促进的氨基酸损失曲线的确定可以指示用于受试者的包含鸟氨酸、丝氨酸、组氨酸和甘氨酸的氨基酸补充剂，其中鸟氨酸、丝氨酸、组氨酸和甘氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约64％。
‘高’汗水促进的氨基酸损失曲线的确定可以指示用于受试者的包含组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸的氨基酸补充剂，其中组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约76％。
附图说明
参考以下附图，本文仅通过非限制性举例的方式描述了本披露的实施例。
图1.来自组合群组(n＝19)的汗水中氨基酸浓度的对数转换的氨基酸浓度数据的主成分分析(pca)。针对被定义为在汗水中测量的低(l)、中(i)和高(h)氨基酸总水平的三个集群之一内的成员关系对每名运动员进行编码。每名运动员根据其相应的氨基酸曲线定位于图上。来自每个sflaa组的运动员已经进行了颜色编码，并且很明显，每组的成员都集群在一起。这提供了他们的氨基酸组成特征在由其sflaa定义的组内相似的证据。
图2.来自低、中和高sflaa集群的汗水中氨基酸的相对百分比丰度与血浆氨基酸的相应组成的比较。对于每种氨基酸：前条＝血浆；第二条＝汗水‘低’sflaa；第三条＝汗水‘中’sflaa；第四(背)条＝‘高’sflaa。血浆水平在来自任一组的受试者之间没有改变，丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和脯氨酸作为主成分存在。从身体表面收集的汗水的组成显示了如下的汗水组成的不同模式，丝氨酸是“低”sflaa集群的主要成分，鸟氨酸是“中”sflaa集群的主要成分，并且组氨酸是“高”sflaa集群的主要成分。
图3.运动后汗水中的总氨基酸浓度与受试者在淋浴并在18℃-24℃休息一夜之后12小时从皮肤表面的洗涤液中获得的氨基酸水平相比较。然后使受试者淋浴，干燥，并通过洗涤新干燥的皮肤表面获得第三样品，以证明氨基酸可以通过润湿皮肤表面而从角质层中浸出。使用三个样品集合产生各集合之间的一周数据。这些结果支持氨基酸作为皮肤天然保湿因子的重要部分而存在，并且通过简单添加水可从表面浸出的概念。
图4.(a)运动后汗水(前条)中氨基酸百分比相对丰度与(b)针对运动后淋浴之后休息12小时后取的样品(第二条)观察到的水平和(c)针对淋浴和干燥之后立即取的样品(第三条或背条)观察到的水平的比较。值是来自一名男性参与者的三个独立抽样事件的平均值。与运动后取的汗水的氨基酸组成的相似性通过清洁和干燥表面后立即来自皮肤的表面洗涤液反映了组成曲线。该相似性是支持浸出过程通过汗水对皮肤的润湿而作为氨基酸损失的主要原因的有力证据。组合起来，浸出物和汗水中排泄量总计为运动过程中相当大的潜在损失。
图5.(a)从在来自47名健康受试者和7名患有慢性疲劳的受试者的汗水中测量的氨基酸的相对丰度绘制的主成分分析(pca)。针对通过k均值聚类定义的四个集群之一内的成员关系对每个例子进行编码，k均值聚类将受试者分成组，以最小化各组内的变异并最大化各组间的差异。pca分析的结果通过在图中明确分离每个组内的成员来证实k均值聚类方法。患有慢性疲劳的受试者作为组1或组3的成员存在。(b)因子1和因子2的pca负载指示氨基酸对集群分离的贡献。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。除非另外指出，否则整个披露中自始至终参考的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、数据库、网站和其他公开的材料均通过引用以其全文而并入。在术语存在多个定义的情况下，在这个部分中的那些定义优先。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等效于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但描述了典型的方法和材料。
本文使用的冠词“一个”和“一种”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“元件”意指一个元件或多于一个元件。
在本说明书的背景下，术语“约”应理解为是指数字范围，本领域的技术人员认为该数字范围相当于在实现相同功能或结果的情况下引用的值。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和随后的权利要求书，词语“包含(comprise)”以及变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当被理解为隐含包括所陈述的整数或步骤或者多个整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者多个整数或步骤的组。
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括但不限于人、表演动物(如纯种马和其他赛马)、牲畜和其他农场动物(如牛、山羊、绵羊、马、猪和鸡)、伴侣动物(如猫和狗)和实验室测试动物。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现一个或多个有益或希望结果的组合物或补充剂的量。可以在一个或多个给予中提供“有效量”。所需的确切量将取决于所使用的各益生菌菌株的身份和数目、受治疗的受试者、受治疗的受试者所患的一种或多种疾病或病症的性质以及受试者的年龄和一般健康状况以及所给予的组合物所处的形式而变化。对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验来确定。
如本文所用，术语“运动”是指个体的任何体力运动，包括足以产生汗水的劳动。如本文所用，术语“运动”包括任何体育活动，无论是通过培训还是正式参与体育运动拼搏、活动或事件。术语“运动”和“体育运动(sport或sports)”在本文中可以互换使用。
如本文所用，关于从运动中恢复的术语“恢复”可以包括与不存在补充相比，在根据本发明的氨基酸补充后改进的恢复时间。在本领域中已知多个用于确定和评估恢复时间的参数，包括生理参数(例如血氧水平、心率、血红蛋白水平、血细胞比容水平)、行为参数和观察性参数。
如本文所用，关于运动或体育运动的术语“表现”是指适用于正在进行的运动或体育运动的任何表现参数，包括例如强度、速度和/或耐力。增强的表现也可以通过克服肌肉疲劳的能力、维持更长时间的活动的能力、改进的训练或运动性活动效率或者肌肉质量的维持或发展来证明。
如本文所用，术语“炎热气候”意指在一年中的至少一部分期间的热量足以导致个体不适并导致受试者出汗使得汗水促进的氨基酸损失发生的任何气候。通过举例，该气候可能会经历超过24℃、30℃、35℃、40℃或45℃的温度。
在运动过程中、在炎热条件或气候下或其他体力劳动时期，个体有可能通过出汗而损失显著量的氨基酸。当受试者运动时，氨基酸因为用于代谢以支持运动而从循环血浆中除去。在汗水润湿皮肤时，液体可以进一步从外角质层中浸出氨基酸，从而产生天然保湿因子，其氨基酸组成类似于从皮肤表面收集的汗液中测量的主要成分的曲线(参见图4)。为了补偿这一点，氨基酸通常从非纤维肌储备中抽出。然而，如果受试者经受高强度运动或训练或者过度训练，这可能导致非肌原纤维蛋白储存的消耗，在这种情况下身体然后不得不转变为涉及结构性成分肌动蛋白和肌球蛋白的蛋白质水解的纤维分解代谢，导致肌肉损伤、酸痛和周围疲劳(参见例如，niblett等人,2007；macintosh和rassier,2002)。因此，本文描述了不需要消化的氨基酸补充剂，用于在运动期间或之后立即摄取来将氨基酸直接递送至循环，以便最小化在恢复期间对肌肉蛋白储存的潜在需求。这一策略被设计为最小化对运动完成后(作为恢复的重要时期)继续进行的肌肉组织中的分解代谢反应的影响。
类似地，患有持续慢性疲劳或伴有消化功能受损的慢性疾病的患者可能会通过汗水和尿液损失氨基酸，导致为了满足人体对氨基酸的需求而持续的分解代谢过程。生活在炎热气候下的个体还可能在也引起大量持续出汗的较低水平的运动或活动期间易经历来自氨基酸周期性消耗的不利影响。
在本文所述的人和马研究中，相对于血浆中的相应水平，汗水促进的氨基酸损失的曲线指示汗水不仅反映血浆氨基酸组成。不希望受理论束缚，数据表明，到位了通过例如从皮肤表面浸出氨基酸而促进某些氨基酸在汗水中的浓缩的机制。如本文例示，提供具有被鉴定为汗水中的关键损失成分的氨基酸的氨基酸补充剂能够将血浆氨基酸浓度提高至可代表工作期间的血浆氨基酸的最大负载的水平。同样，不希望受理论束缚，本发明人认为，增加氨基酸的血浆浓度使更多的底物可用于支持运动和恢复，同时减少对肌肉储存的需求。如本文例示，已经显示根据本披露的氨基酸补充提高血红蛋白和血细胞比容水平。
如本文所述和例示，确定汗水促进的氨基酸损失‘表型’或曲线的能力可用于鉴定在高强度运动、慢性病状况、慢性疲劳或暴露于炎热条件的情况下需要氨基酸支持的那些，并且可以帮助确定最适合在体力要求苛刻的运动、训练条件和极端气候条件下最有效地存活的那些。
如本文所述和例示，确定汗水促进的氨基酸损失‘表型’或曲线的能力有助于开发基于性别专门设计的氨基酸补充剂配制品。因此，本文提供了专门设计供人类男性受试者消费的氨基酸组合物。具体而言，为人类男性受试者配制的氨基酸补充可以包含选自下组的氨基酸中的一种或多种，该组由以下各项组成：α-氨基-己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸。对于男性亚组，氨基酸补充剂可以包含例如组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸作为主要氨基酸成分。对于另一个男性亚组，补充剂可以包含例如丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸作为主要氨基酸成分。用于男性的补充剂可以另外尤其包含谷氨酰胺和/或谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸和/或赖氨酸。
本文还提供了专门设计供人类女性受试者消费的氨基酸组合物。具体而言，专门设计供人类女性受试者消费的氨基酸组合物可以包含下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和天冬酰胺。用于女性的补充剂可以另外包含例如鸟氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸。特定的补充剂可以包含例如丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸；天冬酰胺、鸟氨酸和甲硫氨酸；半胱氨酸和甲硫氨酸作为主要氨基酸成分。
本文还提供了专门设计用于患有慢性疲劳(如慢性疲劳综合征)的个体的氨基酸补充剂配制品。用于雌性慢性疲劳受试者的此类补充剂可以包含天冬氨酸、天冬酰胺、鸟氨酸和/或甲硫氨酸作为组合物中的主要氨基酸。用于雄性慢性疲劳受试者的补充剂可以包含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和/或甲硫氨酸作为主要氨基酸成分。
因此，本文所述的方法和组合物可用于评估或评价在一系列环境、职业和行业中的个体，并且为其提供补充剂，促进或帮助从运动或其他形式的体力劳动中恢复和/或改进所述运动或体力劳动中的表现。根据本披露，可以在运动或其他体力劳动之前、期间或之后将组合物给予需要的受试者。适合的个体可以是例如运动员(专业、半专业或业余)，私人教练或正在进行健身或减肥计划的那些，军事人员，警察和其他安全工作者，消防员，建筑、采矿及相关行业的工人，农场工人和畜牧业者。本领域技术人员将认识到，这仅仅是适合个体的示例性列表，并且本发明不旨在如此受限制。
如上所述，本文所述的方法和组合物也可用于评估或评价经历慢性病(如例如慢性疲劳综合征、免疫缺陷)的那些、经受创伤或其他损伤的那些以及消化功能受损的那些，并为其提供补充剂。根据本披露，可以在经受疾病、创伤、损伤或消化受损之前、期间或之后将组合物给予需要的受试者。本领域技术人员将认识到消化效率随着年龄而减小。因此，本文所述的方法和组合物的另外应用是向年长者提供营养支持。
如本领域技术人员将理解的，本文所述的方法和组合物还可用于评估或评价非人类受试者，并且为其提供补充剂。示例性的非人类动物包括马(如纯种马和标准竞赛用马、役用马)、狗(如赛狗包括灰狗和工作犬)以及在炎热条件下生活和/或工作的其他动物。
本领域技术人员将理解，可以调整本文披露的组合物和补充剂中每种氨基酸的比例，以反映例如在具体个体或动物或者在个体组或动物组(如例如运动员组、赛马组等)的汗水中观察到的那些氨基酸的相对损失。因此，本披露考虑了根据具体个体或动物或者个体组或动物组的需要而定制组合物和补充剂。本文描述和例示了汗水中氨基酸的损失的确定，并且因此组合物和补充剂的具体配方的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，不需要过多的实验负担。
技术人员还将理解，本文披露的组合物和补充剂可以包含本文所述的氨基酸、由其组成或基本上由其组成。
在一个方面，本披露提供了包含组氨酸、丝氨酸和赖氨酸的氨基酸组合物，其中组氨酸、丝氨酸和赖氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约25％。取决于具体受试者的要求，例如如可以通过分析受试者中汗水促进的氨基酸损失来确定的，这些氨基酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。取决于具体受试者的要求，例如如可以通过分析受试者中汗水促进的氨基酸损失来确定的，这些氨基酸可以构成该组合物中氨基酸总量的约30％和50％之间，例如约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。
组氨酸可以构成该组合物中氨基酸总量的约10％至21％之间，例如约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或21％。丝氨酸可以构成该组合物中氨基酸总量的约13％至16％之间，例如约13％、14％、15％或16％。赖氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的约9％和10％之间。
该组合物可以另外包含鸟氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸中的至少一种。当存在时，鸟氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约12％，和/或甘氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约8％，谷氨酰胺和/或谷氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约10％，亮氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约10％，和/或天冬氨酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约7％。在一个示例性实施例中，该组合物包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和甘氨酸，其中这些氨基酸构成该组合物中氨基酸总重量的至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在另一个示例性实施例中，该组合物包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸，其中这些氨基酸构成该组合物中氨基酸总重量的至少约35％、40％、45％、50％、55％或60％。
在另外的方面，本发明的氨基酸组合物包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和甘氨酸，其中组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和甘氨酸一起构成该组合物中氨基酸总重量的至少约30％。取决于具体受试者的要求，例如如可以通过分析受试者中汗水促进的氨基酸损失来确定的，这些氨基酸可以构成该组合物中氨基酸总重量的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％或76％。
除了指定的氨基酸外，本发明的组合物还可以包含任何一种或多种其他氨基酸，并且本领域技术人员将理解，本披露的范围不受包括任何具体的另外的氨基酸的限制。在一个示例性实施例中，适用于向马给予，本披露的组合物可以包含组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸，其一起代表该组合物中氨基酸总重量的约60％，并且另外包含补足氨基酸总重量的剩余40％的丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
本发明的组合物可以另外包含其他合适的营养成分(如矿物质、维生素、辅酶、脂肪酸、碳水化合物、蛋白质或肽)以及用以在恢复或表现方面激活附带益处的另外的成分，如改进氧代谢的成分、抗氧化剂、直接或间接与自由基清除剂相关或改进心脏功能的因子。此类其他成分的量可以是被认为是消费安全，并经相关监管机构的可接受准则批准的任何量。本领域技术人员可以调整此类量以实现希望的结果。
本发明的组合物还可以包括任何合适的添加剂、载剂、另外的治疗剂、生物利用度增强剂、副作用抑制成分、稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、防腐剂或其他不会对组合物功效有害的成分。
本发明的组合物可以由本领域技术人员使用制药和营养及营养保健行业中熟知的技术和工艺容易地制造，并且可以适当地配制用于口服给予。适合的口服剂型可以包括液体、颗粒、粉末、凝胶、糊剂、可溶性囊剂、口服可溶形式、胶囊、囊片、锭剂、片剂、泡腾片、咀嚼片、多层片剂(例如时间和/或ph依赖性释放)等。
适合于口服给予的组合物可以呈现为离散单元，各自含有预定量的该组合物的各成分，作为例如粉末、颗粒、凝胶，作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液。这些组合物可以方便地掺入各种饮料、食品、营养保健产品、营养补充剂、食品添加剂、药物和非处方配制品中，如下文所例示的。然而，本领域技术人员将理解，可以按本领域已知的任何合适的形式配制组合物并提供给使用者。
这些组合物可以方便地掺入各种饮料产品中。合适类型的饮料的具体实例包括但不限于水、碳酸饮料、运动饮料、营养饮料、果汁、蔬菜汁、牛奶、以及其他基于水、基于乳、基于酸牛乳的产品，其他基于奶制品、基于乳替代品(如豆乳或燕麦乳)或基于果汁的饮料。这些组合物可以按粉末、颗粒或其他固体形式提供，以由使用者加入到饮料中，或者在饮料中预混合，或者可以按浓缩液体、凝胶或糊剂形式提供以加入到合适的饮料中。可替代地，可以将该组合物以液体形式提供给使用者，与合适的饮料预混合。在一个示例性实施例中，该组合物可以按约20mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1500mg或2000mg或更大的剂量被包括在基于水的饮料(如运动饮料)中，取决于饮料的确切性质和体积。
这些组合物也可以方便地掺入各种食品、营养保健产品或食品添加剂中。该食品或食品添加剂可以是固体形式(如粉末)或液体形式。适合的食品可以包括烘焙产品如薄饼干、面包、松饼、卷饼、百吉饼、饼干、谷物、棒状食品(如麦片棒、保健食品棒等)、调味品、调味汁、乳蛋糕、酸奶、布丁、预包装冷冻餐、汤和糖果。
在另一个实施例中，这些组合物可以简单地在没有另外的饮料或食品的情况下作为粉末、颗粒、凝胶、糊剂、固体剂型或浓缩液体形式消费。也考虑了其他固体剂型，如胶囊和片剂。例如，在受试者是动物(如马)时，氨基酸可以按适当的比例预混合，并与液体(如水)以适当的比率与粘合剂(如黄原胶)组合以帮助形成用于通过口腔注射器给予的糊剂递送系统。本领域技术人员将理解，取决于受试者的身份和耐受力，可以采用许多其他口服递送系统。
当组合物被配制成胶囊时，该组合物的成分可以与一种或多种药学上可接受的载剂如淀粉、乳糖、微晶纤维素和/或二氧化硅一起配制。另外的成分可以包括润滑剂，如硬脂酸镁和/或硬脂酸钙。这些胶囊可以任选地被包衣，例如用薄膜包衣或肠溶包衣，和/或可以被配制成提供其中的组合物的缓慢释放或控制释放。
片剂可以通过压制或模制来制备，任选地使用一种或多种配合剂。压制的片剂可以通过以下方式来制备：在合适的机器中对自由流动形式(如粉末或颗粒)的组合物成分进行压制，任选地与粘合剂、润滑剂(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)、惰性稀释剂或表面活性/分散剂进行混合。模制的片剂可以通过以下方式来制备：在合适的机器中，对用惰性液体稀释剂润湿的粉末化组合物的混合物进行模制。这些片剂可以任选地被包衣，例如用薄膜包衣或肠溶包衣，和/或可以被配制成提供其中的组合物的缓慢释放或控制释放。
本领域技术人员将理解，本文公开的组合物的单次或多次给予可以按根据需要取决于受试者的需要和待治疗受试者的状况来确定的剂量水平和给药方案来进行。技术人员可以容易地确定合适的剂量方案。宽范围的剂量可能是适用的。可以对给药方案进行调整以提供最佳响应。本领域技术人员将理解，确切的给予量和比率将取决于许多因素，例如所给予的具体组合物(包括所给予组合物的形式)，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食要求，以及与组合物组合使用或巧合一起使用的任何药物或药剂。例如，每小时、每天、每周、每个月或其他适合的时间间隔可服用几个分开剂量，或可以按状况的紧急程度按比例地减少剂量。基于本文的传授内容，通过常规试验和实验，本领域技术人员将能够在个案处理的基础上确定合适的剂量方案。
一般地，本披露的组合物可以按有效作为健康补充剂、食品补充剂、食品添加剂和/或治疗剂以实现所希望的保健结果的任何合适剂量量给予。
在一些实施例中，在受试者是人时，有效剂量可以在如下的范围内：从约50mg至15g、约100mg至15g、约200mg至15g、约400mg至15g、约600mg至15g、约800mg至15g、约1000mg至15g、约2g至15g、约3g至15g、约4g至15g、约5g至15g、约6g至15g、约7g至15g、约8g至15g、约9g至15g、约10g至15g、约11g至15g、约12g至15g、约13g至15g或约14g至15g。有效剂量可以在如下的范围内：从约50mg至14g、约50mg至13g、约50mg至12g、约50mg至11g、约50mg至10g、约50mg至9g、约50mg至8g、约50mg至7g、约50mg至6g、约50mg至5g、约50mg至4g、约50mg至3g、约50mg至2g、约50mg至1000mg、约50mg至800mg、约50mg至600mg、约50mg至400mg、约50mg至200mg或约50mg至100mg。这样的剂量可以每天或根据需要给予。可以随时间给予恒定剂量的组合物，例如，约50mg/天、约100mg/天、约200mg/天、约400mg/天、约600mg/天、约800mg/天、约1000mg/天、约1200mg/天、约1400mg/天、约1600mg/天、约1800mg/天、约2g/天、约2.2g/天、约2.4g/天、约2.6g/天、约2.8g/天、约3g/天、约3.2g/天、约3.4g/天、约3.6g/天、约3.8g/天、约4g/天、约4.2g/天、约4.4g/天、约4.6g/天、约4.8g/天、约5g/天至约6g/天、约7g/天、约8g/天、约9g/天、约10g/天、约11g/天、约12g/天、约13g/天、约14g/天或约15g/天，取决于受试者的需要和该组合物将给予的形式。小儿剂量可以在成人剂量的15％至90％的范围内。
在一些实施例中，在受试者是马时，有效剂量可以在如下的范围内：从约1g至50g、从约5g至50g、从约10g至50g、从约15g至50g、从约20g至50g、从约25g至50g、从约30g至50g、从约35g至50g、从约40g至50g或从约45g至50g。有效剂量可以在如下的范围内：从约1g至45g、从约1g至40g、约1g至35g、约1g至30g、约1g至25g、约1g至20g、约1g至15g、约1g至10g或约1g至5g。可以随时间给予恒定剂量的组合物，例如，约1g/天、约2g/天、约4g/天、约6g/天、约8g/天、约10g/天、约12g/天、约14g/天、约16g/天、约18g/天、约20g/天、约22g/天、约24g/天、约26g/天、约28g/天、约30g/天、约32g/天、约34g/天、约36g/天、约38g/天、约40g/天、约42g/天、约44g/天、约46g/天、约48g/天或约50g/天，取决于马受试者的需要。
如果受试者体内的氨基酸水平处于或已恢复至正常或可接受的水平，则本披露考虑了以设计为维持或帮助将受试者体内的氨基酸水平维持在正常或可接受的水平的剂量来给予本文披露的组合物。这样的维持剂量可以低于将氨基酸恢复至正常或可接受水平或者帮助受试者恢复所需的剂量，但是仍然典型地落在本文示例的剂量范围内。例如，当受试者是人时，本披露的组合物可以按如下剂量给予受试者：约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约250mg/天、约300mg/天、约350mg/天、约400mg/天、约450mg/天、约500mg/天、约550mg/天、约600mg/天、约650mg/天、约700mg/天、约750mg/天、约800mg/天、约850mg/天、约900mg/天、约950mg/天、约1000mg/天、约2g/天、高达约10g/天，以维持可接受或正常的氨基酸水平。例如，当受试者是马时，本披露的组合物可以按如下剂量给予受试者：约1g/天、2g/天、3g/天、4g/天、5g/天、6g/天、7g/天、8g/天、9g/天、10g/天、11g/天、12g/天、13g/天、14g/天、15g/天、高达约30g/天，以维持可接受或正常的氨基酸水平。这样的维持剂量也可以适用于例如运动、训练或比赛时间或时间表之外的人类运动员或马匹。
本发明还提供了用于确定待向受试者给予的组合物的最合适的氨基酸构成和最合适的剂量水平的方法。典型地，此类确定是基于对于任何给定受试者的汗水促进的氨基酸损失和/或从受试者获得的血浆样品中总氨基酸浓度的分析。例如，如本文在一个实施例中示例的，本发明提供了用于确定待向受试者给予的膳食补充剂的方法，该方法包括：
a)使受试者进行足以产生汗水的运动；
b)确定所述汗水中的氨基酸组成；
c)基于所述汗水中的总氨基酸浓度确定受试者的汗水促进的氨基酸损失曲线，其中小于约4,000μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示‘低’曲线，约4,000和10,000μ摩尔l-1之间的氨基酸浓度表示‘中’曲线，并且大于约10,000μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示‘高’曲线；
其中依照低、中或高汗水促进的氨基酸损失曲线将受试者分层确定了待给予的补充剂的量(或剂量)以及任选地待给予的所述补充剂的量或剂量。
例如，在高水平运动员或动物的情况下，或者在患有或易患严重疾病或损伤的受试者中，依照低、中或高汗水促进的氨基酸损失曲线将受试者分层可能是理想的。
本文还提供了用于确定对待向受试者给予的膳食补充的需要的方法，该方法包括：
a)从受试者获得血浆样品；并且
b)确定所述血浆中的总氨基酸组成，其中小于约2,800μ摩尔l-1的氨基酸浓度表示氨基酸的‘低’操作水平，指示需要补充。
如本文所示例，受试者的汗水促进的氨基酸损失曲线的确定可以另外包括确定汗水中的各氨基酸浓度，其中：(i)‘低’曲线由丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的至少约50％，丝氨酸是汗水的主要氨基酸成分；(ii)‘中’曲线由鸟氨酸、丝氨酸、组氨酸和甘氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的至少约70％，鸟氨酸是汗水的主要氨基酸成分；并且(iii)‘高’曲线由组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸代表，其构成汗水中氨基酸的至少约60％，组氨酸是汗水的主要氨基酸成分。
此外，如本文所示例，本发明考虑了采用血液或血浆测试来确定受试者的血浆中的总氨基酸水平，基于此确定用于给予的氨基酸补充剂。
考虑到例如当前和过去的表现水平和工作量、受试者状况和未来要求，可以持续使用所描述的方法，以便促进开发和实施针对该受试者的合适的氨基酸补充程序。这可能涉及设计待给予的补充剂的具体氨基酸构成和/或确定待在不同时间采用的一个或多个适当剂量。
本披露的组合物和方法可以用作用于促进或帮助从运动、疾病、创伤或损伤中恢复或用于促进或帮助运动或体育运动表现的其他补充剂程序或者其他疗法或治疗的辅助。因此，本文披露的组合物和方法可以与可促进希望结果的其他药剂共同给予。“共同给予”意指以相同配制品或以两种不同配制品经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径依次给予。“依次”给予意指在给予多种药剂、组合物或处理之间存在几秒、几分钟、几小时或几天的时差。依次给予可以按任何顺序进行。
本说明书中对任何在先公开文件(或从其中所获得的信息)的提及或者对任何已知的事物的提及不是并且不应当被理解为这样一种承认或准许或任何形式的建议，即该在先公开文件(或从其中获得的信息)或已知的事物形成了在本说明书所涉及的研究领域内的公知常识的一部分。
现在将参照以下具体实例描述本披露，所述实例不应当解释为以任何方式限制本发明的范围。
实例
以下实例说明本发明并且不应当解释为以任何方式限制贯穿本说明书而描述的披露内容的一般性质。
实例1-在男性运动员运动期间汗水促进的氨基酸损失
本发明人调查研究了在限定的运动条件及恒定温度和湿度下汗水中是否会损失显著量的氨基酸。如下文所述，在受控的运动和环境条件下进行两项独立研究，以产生总共19名参与者，为分析提供汗水。一项研究为11名受试者提供相应的运动后血浆样品，以与氨基酸的汗水组成进行比较。第二项研究提供了另外的8个汗水样本，以确定是否可以基于汗水特征描绘运动员亚组，如在32℃-34℃和20％-30％相对湿度(rh)下的运动方案中的总氨基酸浓度和体液损失/小时。这些研究由纽卡斯尔大学人类研究伦理委员会批准，并且所有参与者在加入研究之前提供书面知情同意书。
研究参与者
招募了包含11名已在过去2年完成至少10次5km赛跑的训练有素的男性耐力运动员(年龄：29±9岁，身高：179±7，体重：73±10公斤，σ7皮褶厚度：58±24毫米)的研究组。如果潜在参与者报告有会增加运动期间经历不良事件的风险的任何医疗状况(心血管的、肌肉骨骼的或代谢的)，则将其排除。参与者在非机动跑步机上进行了3次模拟5km自定步速时间试验，并且在环境舱内进行各种冷却干预以便提供以七天间隔的炎热环境(32℃-34℃和20％-30％rh)。参与者随机完成了重复的5km自定步速时间试验，其中他们通过摄入冰浆进行了预冷[在跑步前30分钟，7.5g·kg-1·bm-1的冰浆(-1℃)(gatorade，百事可乐公司(pepsico)，美国纽约)]，通过薄荷醇口腔清洗剂进行了中间冷却[在吐到桶中之前5秒在口中将25ml的l-薄荷醇溶液(0.01％浓度；22℃；menthaarvensis，新方向公司(newdirections)，澳大利亚悉尼)喝下)，或没有干预。
招募了包含八名男性三项全能运动员的另外的研究组以提供汗水样品，以便有助于汗水组成特征的扩展亚组评价。这些运动员的年龄是从25至35岁，并且在先前12个月内完成奥运距离铁人三项(年龄：29.6±3.4岁，体重(bm)：77.8±11.1公斤，vo2max：62.1±4.9mlkg-1min-1，在过去12个月的时间奥运距离铁人三项：2:10:12±0:9:12h:min:s，均值±sd)。如果潜在参与者报告有会增加运动期间经历不良事件的风险的任何医疗状况(心血管的、肌肉骨骼的或代谢的)，则将其排除。参与者在环境舱内进行了两次模拟奥运距离铁人三项试验以便提供以七天间隔的炎热环境(32℃-34℃和20％-30％rh)。铁人三项包括三个标准化赛程，包括在50米的室内游泳池中游泳(1500米)，在踏车测力计(lodeexcalibursport，荷兰格罗宁根州)上骑自行车(1小时)和在机动跑步机(powerjogjm100，英国专家健身(expertfitnessuk)，威尔士中格拉姆根)上进行10km自定步速时间试验。骑自行车和跑步赛程在环境舱内进行。每名参与者都需要含水(hydrated)开始运动试验，并在开始运动之前称重。在骑自行车组成部分期间，参与者摄入10g.kgbm-1的冰浆(<1℃)或室温(32℃-34℃)运动饮料(gatorade，百事可乐公司，澳大利亚查茨伍德)。在这些冷却策略之间对汗水组成没有影响。
汗水收集和分析
为了评估角质层的潜在贡献，每隔一星期在三个不同的场合收集皮肤的汗水和水洗液。在标准化的30分钟运动程序后，从一名另外的男性(57岁)的背部收集汗水，以便与从皮肤水洗液收集的样品进行比较。运动在28℃-32℃下在傍晚进行，然后参加者淋浴并在范围为18℃-24℃的温度下睡一夜。运动后12小时，通过将过滤水喷淋到背部皮肤上(足以产生用于在无菌样本容器中收集至少1ml的液滴)来收集洗涤样品。然后使受试者淋浴并彻底干燥，之后立即通过喷淋和从皮肤收集液滴来收集第二样品。这种方法被设计为指示角质层是否可以向皮肤表面上的水中贡献氨基酸，如发生浸出时所预期的那样。该项目由纽卡斯尔大学人类研究伦理委员会另行批准(批准号：h-2015-0534)，并且参与者在加入研究之前提供书面知情同意书。
针对初级研究组在运动前和运动后采样时间取血浆样品。将来自每名参与者的在重复时段的多个血浆样品的结果进行平均，以提供研究中每名个体的单一代表值。在两次试验中都通过直接收集到无菌70ml样本瓶(莎斯特公司(sarstedt)，德国)中来收集汗水样品。在群组1中，8名运动员中有5名在两个场合下提供汗水样品；一次在提供冷浆的情况下且一次在提供环境温度液体的情况下。运动员中有3名只在提供冷浆或环境温度液体的情况下提供一个汗水样品。在群组2中，11名运动员中的每一名在三个场合下都提供了汗水样品。在跑步机跑步后立即通过在每名参与者的中上背部、三头肌和前额的皮肤上刮擦刮板来收集汗水，并立即将汗水转移到无菌容器中。将来自每名参与者的多个汗水样品的结果进行平均，以提供研究中每名个体的单一代表值。在运动程序之后，用毛巾使受试者干燥并称重，以确定运动期间的总体液损失。总汗水量被计算为整个铁人三项中损失的全身质量，通过模拟铁人三项对液体和食物摄入进行校正。将汗水样品保持在4℃，并在收集60分钟内冷冻。将汗水样品保存在-80℃，直到使用ez:faasttm(
数据和统计分析
如通过anova评估的，不同的冷却处理对血浆或汗水样品的氨基酸组成没有影响。每名运动员的复制汗水和运动前或运动后血浆样品因此被平均以包括每名运动员的一个代表值。构建数据集，以通过单因素方差分析来比较运动前和运动后血浆氨基酸曲线，并将统计学显著性水平设定为p<0.05。此外，还通过anova评估了基于汗水中总氨基酸浓度定义的各组之间的血浆和汗水组成。使用statisticatmv12软件(史丹索特公司(statsoft))，使用主成分分析、判别函数分析和相关性分析来分析汗水排泄集群。
结果
在从初级运动员组1(n＝11)收集的汗水中检测到26种氨基酸。在表1中总结了在运动前和运动后时间取的相应血浆氨基酸的比较。天冬氨酸和羟赖氨酸存在于汗水中，但在运动前和运动后血浆样品中不存在。汗水中氨基酸的平均总浓度比血浆中观察到的高超过三倍。总共13种氨基酸以显著高于在运动后血浆中记录的那些的浓度存在并包括：α-氨基-己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸。4种氨基酸以与运动后血浆相比显著更低的浓度存在于汗水中，并包括：α-氨基-丁酸、谷氨酰胺、胱氨酸和脯氨酸。运动后血浆氨基酸显示出丙氨酸的统计学显著增加，并且显示出天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸和苏氨酸的显著降低。因此可以得出结论，运动方案对循环血浆的氨基酸组成有影响，不能通过例如血量变化简单地解释。
确定了二级运动员组(n＝8)的氨基酸组成，并与初级组(n＝11)数据进行了比较，揭示了这两组之间汗水中氨基酸总水平无显著差异。只有三种氨基酸(一起代表汗水组成的5％)在初级和二级研究组之间有统计学差异。这三种氨基酸由初级运动员组中测量的295±158μm与二级组中测量的106±28μm的亮氨酸；74.5±23μm与6.5±0.6μm的α-氨基-己二酸；和15.6±7.4μm与127±32μm的酪氨酸组成(p<0.05)。因此将受试者组合以形成较大的数据集(n＝19)，试图确定解释针对汗水氨基酸浓度获得的高变异。针对出汗特征中的明显差异如氨基酸浓度、汗量和通过汗水损失的总氨基酸评估数据。当将个体基于汗水中总氨基酸浓度排序时，可以将运动员放进特征在于汗水促进的氨基酸损失(sflaa)的三个不同集群或亚组中：1)“低”集群被定义为在汗水中<4.0mm(n＝8)的总氨基酸浓度，均值±sd为2.4±0.7mm；2)“中”集群被定义为4.0至10.0mm(n＝7)，均值为5.9±1.7mm；且“高”集群被定义为>10.0mm(n＝4)，均值为15.2±3.3mm。将氨基酸浓度(不包括总氨基酸水平)的汗水曲线进行主成分分析(pca)，以确定汗水中的曲线是否可用于客观区分集群成员关系。图1中呈现的分析清楚地显示，pca产生的因子基于来自每名个体的汗水中的氨基酸组成的模式，完全分辨了三个集群的成员。
表1.在男性运动员中测量的汗水氨基酸浓度与运动前和运动后血浆氨基酸水平的比较
a运动后血浆中的氨基酸水平与运动前血浆水平显著不同；汗水中的氨基酸水平与运动后血浆水平相比显著更高b或更低c；e必需氨基酸；e2酪氨酸可以由苯丙氨酸合成，并且胱氨酸内的半胱氨酸可以由甲硫氨酸和丝氨酸合成。
来自三个集群中每个的汗水特征和汗水氨基酸组成均总结在表2中。“低”sflaa组展示2.3l/h的最高估计汗量/小时和2.4μm的汗水中最低总氨基酸浓度，其中每小时通过汗水损失的氨基酸的估计量为5.5毫摩尔。相比之下，“高”sflaa组具有1.5l/h的最低估计汗量/小时和15.2mm的最高氨基酸浓度，其中每小时通过汗水损失的氨基酸的估计量为22.8毫摩尔(表3)。“中”sflaa组的汗量/小时为1.8l/h，并且汗水氨基酸浓度为5.9mm，落在“高”组值和“低”组值之间，其中每小时通过汗水损失的估计量为10.6毫摩尔。氨基酸按照在来自“低”集群的汗水中测量的具有最高浓度的成分的顺序排序，并且在三个集群之间的氨基酸曲线中的差异在浓度方面以及在曲线中的相对丰度方面是明显的。
“低”sflaa集群的特征在于具有丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸作为四种主要的氨基酸成分，构成汗水的氨基酸组成的57％；“中”集群具有鸟氨酸、丝氨酸、组氨酸和甘氨酸作为主要成分，构成71％；且“高”集群具有组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸，构成汗水氨基酸组成的62％。“中”和“高”集群的汗水氨基酸中大多数以高于针对血浆观察到的浓度存在，但是对于所有组，谷氨酰胺和脯氨酸总是以较低的浓度存在于汗水中。针对“中”和“低”集群，汗水中的缬氨酸与血浆相比较低，并且针对“低”集群，汗水中丙氨酸和色氨酸与血浆相比也较低。在血浆中没有检测到天冬氨酸，但其在来自“低”集群的汗水中作为第六最丰富的氨基酸存在，并且对于其余的组则以更高的浓度观察到。静息血浆水平中总氨基酸在“低”集群中最高且在“高”集群中最低，并且虽然差异不显著，但在静息总血浆浓度与总汗水浓度之间观察到强负相关(r2＝-0.99)(即汗水中氨基酸浓度越高，静息血浆氨基酸浓度越低)。
表2.与运动后血浆的组成相比，来自“低”、“中”和“高”sflaa集群的汗水中氨基酸浓度的比较。
a“低”集群的汗水中氨基酸的浓度与血浆中的相应水平相比显著不同(p<0.05)。汗水参数通过图基检验(tukey's)(针对不等n的hsd)评估，其中b中>低；c高>中；d高>低(p<0.05)；f中<低；g高<低。e必需氨基酸；e2酪氨酸可以由苯丙氨酸合成，并且胱氨酸内的半胱氨酸可以由甲硫氨酸和丝氨酸合成。
对汗水曲线中氨基酸相对丰度百分比的分析也证明三组之间在组成上有很大的定性差异。这在图2中说明，其中绘制每个sflaa集群在汗水中的氨基酸相对丰度％(图2a)用于与血浆中的相应水平(图2b)进行比较。从这个评价明显的是，丝氨酸、甘氨酸、组氨酸和鸟氨酸代表了所有三个组中汗水中的主要成分，但每个组的特征在于不同的氨基酸作为优势成分：“低”集群为丝氨酸，中集群为鸟氨酸且高集群为组氨酸。还注意到丙氨酸和赖氨酸在汗水中以大于5％的水平存在。相比之下，相应的运动后血浆的主要成分(代表60.1％的氨基酸)如下：22.3％的丙氨酸，17％的谷氨酰胺，11.5％的缬氨酸和9.3％的脯氨酸，所有均作为c组氨基酸存在。
进行了一项单独的研究，以调查研究皮肤表面本身对汗水中氨基酸负载的潜在贡献。一名男性参与者在三个不同的场合进行晚间运动之后，在汗水中测量氨基酸的水平，得到平均总氨基酸浓度为4.5±1.2mm。运动收集汗水后，然后使该男性淋浴并在18℃-24℃休息12小时过夜，随后通过喷淋水润湿背部皮肤表面并立即收集表面液体来收集水洗样品。在运动和淋浴后12小时取表面洗涤样品，发现总氨基酸含量为1.2mm，相当于早期运动后汗水样品的27％。在淋浴和干燥后立即取第二水洗样品，再次喷淋水润湿皮肤表面。发现此样品含有约0.18mm的总氨基酸含量，相当于运动后汗水样品的4％(图3)。这三个类型的样品的相对丰度百分比(图2)指示，来自新洗涤的皮肤表面的液体的氨基酸组成曲线反映了运动后汗水的组成曲线(图4)。
不希望受理论束缚，本发明人认为运动期间出汗代表与静息状态相比氨基酸损失的另外途径，除用于能量代谢、组织修复和恢复的氨基酸利用之外。氨基酸损失的过程将涉及从皮肤表面通过浸出氨基酸(通过出汗润湿皮肤而发生)对汗水的贡献。虽然在目前的研究中丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和丙氨酸的高损失代表了可以通过身体合成的氨基酸，但在运动期间这些代谢物的体内合成可能不一定满足需求。在长时间和剧烈运动的条件下，或在炎热气候下，氨基酸的损失可能会超过身体从非纤维储存存取它们或从头合成它们的能力。一旦这些储存通过代谢氧化和通过汗水的损失而消耗，原纤蛋白可能会分解代谢，以满足对氨基酸的需求，导致潜在的肌肉损伤。这种形式的纤维分解代谢可能导致肌肉无法有效地运转，导致称为外周疲劳的病症。慢性肌肉分解代谢是病症如肌肉减少症、慢性疲劳、长时间不活动和各种其他疾病状态以及伴随的高强度运动或过度训练的不可缺的过程。尽管通过汗水损失的氨基酸量可能代表平均每日摄入量的相对较小比例，但在身体储备正在通过分解反应被利用时的高需求下，所产生的损失(0.3-1.3g，或5.5-22.8毫摩尔/小时)将会很快速。基于世界卫生组织建议的每日容许量，本发明人已经计算出，在针对“高”sflaa集群成员的运动方案期间汗水中组氨酸的损失可能代表高达其10mg·kg-1·日-1的rda的40％。以类似的方式，患有伴随消化功能受损的慢性疾病的患者可能会通过汗水和尿液损失氨基酸，导致为了满足人体对氨基酸的需求而持续的分解代谢过程。生活在炎热气候下的人们也可能在引起大量持续出汗的较低水平的运动或活动期间易经历来自氨基酸周期性消耗的不利影响。在当前研究中使用的推衍集群成员关系的方法也可用在未来的研究中，以鉴定在高强度运动或慢性病状况下需要氨基酸支持的那些，并且它还可以帮助确定在更热的条件下最适于存活和有效运动的那些。
实例2-运动期间汗水中氨基酸的排泄表明成人女性胶原蛋白周转高于男性
本发明人表征了来自一般人群的成人的汗水的氨基酸组成以评估汗水组成的性别差异，以及汗水氨基酸损失模式是否代表对氮平衡的显著影响。还从慢性疲劳受试者的群组中测量汗水，以调查研究患有慢性疲劳的受试者是否展示较高的氨基酸排泄率，导致净负氮平衡。
参与者是从一般人群中招募的成年男性和女性以及被诊断患有慢性疲劳综合征的一小群个体(n＝7)。从总共54名人类受试者收集汗水，包含21名女性和33名男性。4名女性和3名男性报告患有慢性疲劳超过3年。使用无菌样本瓶(70ml，莎斯特公司，德国)从健康群组收集汗水，运动后从前臂在皮肤表面上轻轻刮擦。在坐在温暖的地方休息的同时，从疲劳群组从他们的前臂收集汗水，将其装在固定在肘部下方的塑料袋中。汗水样品在4c下储存并在收到48小时内使用商业试剂盒通过气相色谱火焰离子化检测(gc-fid；ez:faasttm)进行分析。该研究得到纽卡斯尔大学人类伦理委员会的批准(h-2014-0086)。
将汗水氨基酸相对丰度数据进行反正弦转换以改进正态性。将来自cf和健康组的数据合并，且进行k均值聚类分析，以确定基于汗水氨基酸曲线的离散组是否可辨别。针对不等样本大小，使用anova和图基hsd比较通过k均值聚类产生的来自每个组的氨基酸浓度数据。对经反正弦转换的氨基酸数据进行主成分分析。所有统计均使用dellstatistica13版(戴尔公司(dellinc.)2015)进行。
结果
氨基酸组成从54名受试者的汗水测定。对氨基酸水平的初步估计主要聚焦于比较来自健康且没有报告慢性疲劳的30名男性和17名女性的汗水氨基酸组成。表3a总结了结果，并指示与男性相比，女性汗水中氨基酸的浓度显著更高。男性中没有氨基酸显著高于女性。健康女性汗水中总氨基酸水平比健康男性中观察到的高1.5倍(p<0.05)。羟脯氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸在女性汗水中比男性汗水中的相应水平分别高3.8倍、2.8倍和2.5倍，并且除了组氨酸以外，显示的其他氨基酸的浓度在女性中比针对男性测量的水平多1.8—2.2倍(p<0.05)。女性的谷氨酰胺水平为95±16μ摩尔/l，并且男性的谷氨酰胺水平为79±14μ摩尔/l。相对丰度百分比数据也证明了健康男性与健康女性群组的氨基酸即丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的显著差异。
针对女性和男性分开比较了报告慢性疲劳的受试者的汗水中的氨基酸组成(表3b)。慢性疲劳组的重复次数低，变异高，但显著差异明显。患有慢性疲劳的女性一般比健康女性测量的大多数氨基酸的水平要高，天冬氨酸、天冬酰胺、鸟氨酸和甲硫氨酸的水平显著更高(p<0.05)。相对于健康男性的汗水，患有慢性疲劳的男性的汗水中氨基酸的总负载显著增加，在丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、羟脯氨酸和甲硫氨酸中注意到具体增加(p<0.05)。
将氨基酸浓度数据转化为相对(百分比)丰度，并进行反正弦转换用于多元统计分析。k均值聚类分析揭示n>6可以产生四个集群(表4)。在集群3中更频率地观察到女性，在集群1中观察到数量相当的男性和女性。集群2主要由男性组成，并且集群4全部由男性组成。
每个集群的氨基酸组成由每个集群中的4种主要成分占主导地位，其一起构成了57％-61％的氨基酸。丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和组氨酸/天冬氨酸是集群1、2和3的汗水曲线中的优势氨基酸。组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸和甘氨酸是集群4中最丰富的氨基酸(表4)。
表4.尿液、汗水和血浆中氨基酸的比较，基于估计的平均每日尿和汗排泄率计算损失。
集群1的特征在于在汗水中具有最高浓度的氨基酸，包括与其他集群相比显著更高浓度的必需氨基酸(p<0.05)。在这同一集群中，汗水中总氨基酸负载的升高主要由高浓度的丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸和组氨酸驱动。与集群2相比，集群3具有较高水平的甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸。集群1和2在汗水中具有羟脯氨酸和脯氨酸，而集群2和4没有。集群4的特征在于具有最高浓度的组氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。集群2对于大多数氨基酸展示高变异，并且仔细检查揭示男性(n＝11)的汗水中总氨基酸水平为3,851(±856)，相比女性的11,144(±5,294)。
将氨基酸的相对丰度数据进行主成分分析(pca)，并基于如通过k均值聚类确定的组成员关系对例子进行颜色编码。从图5a中的散点图清楚看出，每个集群的例子彼此很好地分辨。集群4中的例子沿因子1扩散，如图5b中的因子负载所示，因子1与组氨酸、鸟氨酸和赖氨酸的贡献一致。
来自健康女性的汗水中13种氨基酸的浓度高于在男性中测量的相应水平，导致来自女性的汗水中显著更高的总氨基酸负载。相对于血浆，谷氨酸(8.1x)、组氨酸(7.3x)和甘氨酸(7.2x)也在汗水中大量浓缩。这些结果与这些氨基酸可以通过从角质层皮肤表面中发现的天然保湿因子(nmf)中浸出氨基酸的过程而浓缩在汗水中的提案相一致。
汗水中高浓度的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸以及高排泄损失的可能性代表了在高强度运动训练、长时间高温暴露、损伤和致病性攻击的情况下代谢体内平衡的可能问题。这是因为它们通过汗水的损失可能会限制与一般蛋白质合成和细胞分裂相关的维持、修复和恢复过程。例如，需要相对较高比例的这些氨基酸(连同脯氨酸)来合成胶原蛋白。因此，非常高水平的汗水促进的甘氨酸和丝氨酸损失可能成为胶原蛋白合成的限制因素，特别是在女性中。女性汗水中脯氨酸的浓度是男性中测量的那些的两倍，这可能指示女性对于降低的胶原蛋白合成能力的进一步易感性。可能男性有一些能力限制通过汗水的脯氨酸损失，而女性没有。针对女性，更高水平的脯氨酸可能简单地反映出更高比率的胶原蛋白降解以及后续的脯氨酸释放。在女性中羟脯氨酸的排泄(在胶原蛋白分解代谢期间也释放出来)几乎是男性汗水中测量的4倍，指示女性中更高的胶原蛋白周转率。因此，更高的胶原蛋白周转率加上更低的保留脯氨酸和甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的能力表明女性肌肉组织恢复和修复率可能较慢。
与男性相比，女性在汗水中展示出更高的氨基酸损失率。此外，患有慢性疲劳的个体比同一性别的健康个体在汗水中展示出更高量的氨基酸。甘氨酸和组氨酸是在汗水中发现的主要成分，并且不希望受理论束缚，本发明人认为汗水中损失的氨基酸代表用以维持蛋白质周转和支持代谢、修复和恢复过程的限制性成分。来自女性和慢性疲劳受试者的汗水中脯氨酸和羟脯氨酸的较高水平(浓度和相对丰度)指出这些受试者中的胶原蛋白周转率一般较高。汗水中的谷氨酰胺浓度一直较低，指示它最有可能在角质层中脱氨，以产生谷氨酸和焦谷氨酸作为天然保湿因子的一部分。
将尿液中的氨基酸浓度与汗水中的浓度以及文献值血浆浓度进行比较(表4)。为了估计尿液中的平均日损失量，取1,500ml的体积来代表人体平均每日尿排泄率；这允许与循环血浆和汗水的总氨基酸负载进行比较。出汗率将取决于性别、温度和湿度及活动水平连同调节身体特征如bmi和健康水平)的潜在遗传因素而变化。运动期间最大出汗率确定为1-2l/小时。在工人中在每天有10-12l的汗水可能会损失掉的长时间炎热条件下观察到这些比率。在范围从19c至33c的温度下，在大多数体育运动中的训练和竞赛，对于男性和女性，可产生每小时0.7和2l之间的出汗率，而在10c下，赛艇运动已经显示产生每小时0.8l的出汗率。因此，为了与针对0.5l和2l的每日汗量的尿排出量和血浆浓度进行比较，认为合理的是存在汗水的潜在损失(表3)。这些比较揭示，与无运动相一致，基于每日出汗率的相对保守估计值的总氨基酸损失将得到与尿损失相比较低量的所损失的氨基酸。注意到，与男性相比，女性的汗水损失较高。这些比较还证明，并不是所有的氨基酸在尿液和汗水中相等地损失。肾脏重吸收过程对于支链氨基酸和脯氨酸是非常有效的，但在尿液中组氨酸和甘氨酸以在血浆中测量的浓度的超过四倍损失。与汗水相反，提出了从外分泌腺排出的汗水的氨基酸组成与以前针对血浆观察到的类似，但通过在角质层中的nmf浸出而富集，丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和天冬氨酸有很大的损失可能性。因此得出结论，出汗代表与皮肤表面中nmf功能相关的那些氨基酸的损失的主要途径。
当出汗率由于在一天中包括运动而升高到2l时，氨基酸的损失模型是针对男性几乎为尿液中的两倍，并且针对女性为尿液中的三倍。在男性中，每l汗水中，在血浆中循环的氨基酸的总负载的78％损失掉，而在女性中，1l汗水中，116％的血浆负载损失掉。这代表了对氨基酸的血浆资源的相当大的需求，这些氨基酸的血浆资源必须由身体维持。为了确保血浆中的氨基酸体内平衡，而食物摄取是不可能的运动，氨基酸是通过非肌原纤维蛋白的蛋白水解产生的，以提供氨基酸用于能量、恢复和修复。对新的蛋白质合成的需要在运动员运动后24-36小时可保持升高，在未经训练的个体中可高达48小时。因此得出结论，女性因运动、炎热气候条件暴露、饮食不良、应激、损伤或致病性攻击等而更容易发展净负氮平衡。
实例3-在马中汗水促进的氨基酸损失和氨基酸补充
本发明人表征了马汗水的氨基酸组成以评估运动导致的汗水促进的氨基酸损失的可能性，并调查研究了通过补充进行氨基酸替代以改进在训练期间的马状况的可能性。
该研究包含5至6匹纯种轻驾车赛阉马的两个群组，年龄从3至5岁，研究开始时没有重大疾病的病史或患有任何重大疾患或损伤。该研究由纽卡斯尔大学动物关爱与伦理委员会批准。
第一群组
在第一群组(n＝5)中，所有的马在一名驯马师的监督下遵循相同的训练计划，并且在整个研究过程中积极参与竞赛。采样被整合到马的常规训练方案中，并且计划与涉及高强度径赛练习的时段相一致。因此，每周收集一次样品持续三周的时间，每匹马最多提供五个运动前样品和五个运动后样品。在每个训练时段之前，马配备有gps/心率监测装置，以允许测量速度、距离、力气和恢复。在接受补充和饲料之前，从星期一至星期六(除了比赛日)每天早晨使马每天经受训练。早晨练习后使马接受1kghygainpowatorque(粗蛋白17％、粗脂肪10％、最大粗纤维10％、添加的销售物1.5％、钙1.5％、磷0.6％、裂解物11g/kg、维生素e1000iu/kg、硒1.5mg/kg；hygainfeeds私人有限公司，澳大利亚维多利亚州)，并且在晚间再次接受。针对每只动物取决于尺寸和条件，马还接受2.5-4.5kghygain
为补充氨基酸，在开始两周的补充后采样和评价之前，持续34天(比赛日限制除外)每天为马提供复合氨基酸补充剂(fatiguerevivatm；顶级营养私人有限公司(topnutritionptyltd))。氨基酸补充剂包含20种l-氨基酸(甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、肉碱、苏氨酸、赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、牛磺酸、丝氨酸、半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和酪氨酸)、低聚果糖、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、核糖以及13种矿物质和13种维生素。在大的可重复密封的塑料容器中提供该配制品，并且每天与mct(中链甘油三酯)油1:1混合以在通过60ml塑料注射器口服之前形成糊剂。适当调整人剂量用于马，每天每匹马提供30gfatiguerevivatm(除了由比赛排除的)，其递送14.1g氨基酸。补充34天后，在两周的时间内，在继续补充的同时，在三个不同的场合下，于辛苦训练之前和之后取血液和汗水样品。
第二群组
研究了第二群组的马，以便使用不同的动物样品来复制对来自第一群组的汗水组成的分析。再次，所有的马在同一名驯马师的监督下遵循相同的训练计划，并且在整个研究期间积极参与竞赛。在最初的两周时间内，对马进行四次取样以获得基线测量，并且然后在持续64天的训练和比赛期间提供氨基酸补充剂(见下文)。在补充剂试验的最后两周内，从每匹马取四个汗水和血浆样品。在第一阶段基线测试之后并且在补充之前，由于损伤问题，两匹马被撤回，并被另一只纯种马替代。这为第一阶段评价提供了6只动物，并且然后在持续40天的训练和比赛期间为其中4只提供补充剂。在两周的时间内，在继续补充的同时，在四个不同的场合下，于辛苦训练时段之前和之后取补充后血液样品，而在训练后取汗水样品。由于恶劣天气造成的延误，样品收集期延长。从驯马师财产下的一组七匹马评价静息血浆样品，并作为未处于工作状态的马(4个月-7岁)和年龄范围从3-14岁的马进行评估(6匹阉马和1匹种母马)。这些马在评估前至少四个月内没有提供任何hygain高蛋白含量饲料，并在围场草地上觅食。由于这些马没有接受高蛋白饮食支持，因此将其用作参考组，用于比较血浆中的氨基酸水平。
此第二群组的马提供有补充剂(hygainominar3，hygainfeeds私人有限公司)，该补充剂被配制成仅含有14种氨基酸，被鉴定为代表汗水中损失的主要氨基酸成分(丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和酪氨酸)。调整氨基酸的比例以反映针对这些动物汗水中氨基酸所观察到的相对损失。将这些氨基酸以适当的比例预混合，并与水凝胶(aqagel)基产品1:1(hygainfeeds私人有限公司)组合以通过60ml注射器形成糊剂递送系统，其被动物良好接受。该糊剂每服包含30g氨基酸与500mg葡萄糖，处于30ml水凝胶中。
实验程序
对于两个群组的马，运动时段每周涉及马不比赛时的两个辛苦时段，或者是一个辛苦工作时段和一场比赛。马平均每三周比赛一次。辛苦工作时段涉及在拉动双轮马车和驾驶员的同时在全身赛车安全带下绕700m跑道遛蹄。每个时段包含以适度步速进行大约2.5圈跑道的‘热身活动(warmup)’，加速到比赛速度持续3-4圈，然后逐渐减速持续2.5圈作为最后的‘放松活动(warmdown)’。在清晨辛苦工作时段之前和之后并且在提供饲料或补充剂之前取所有样品。轻度训练时段涉及以适度步速进行大约2.5圈跑道的‘热身活动’，并且然后以约速度19km/h慢跑9-12km。为了提供马之间和采样事件之间的训练节奏和需求的一致性，在所有时段中所有马都使用相同的驾驶员。在第一群组中定期监测训练的各个方面，包括持续时间、时段时间、距离、速度和心率参数，以评估马之间和补充后与补充前阶段项目之间的一致性。
在基线和补充后阶段，每匹马都取复制样品，用于评估运动前血液和血浆，以及运动后血液、血浆和汗水。将每个测试阶段的重复样品进行平均，以代表每只动物在基线和随后的补充后阶段的单一代表性血液、血浆或汗水样品。分别分析两个群组的数据集，以在两个不同群组的动物中评估氨基酸组成在汗水中的一致性和对氨基酸补充的反应。在补充开始之前，通过在四或五个不同的场合下在运动训练方案之前和之后立即取血液样品建立每匹马的血浆氨基酸的基线水平。在第一群组中补充35天后，在三个不同场合取第二组样品，而马仍补充补充剂，以建立血浆和汗水的补充后组成。对第二群组采用相同的方法，其中在补充前四个单独的采样事件期间，建立每匹马的基线水平。对于第二群组，在补充40天后，在四个不同场合取第二组样品，而马仍补充补充剂，以建立血浆和汗水的补充后组成。
在20ml注射器中从每匹马的颈静脉收集血液，并直接转移到标记的9ml肝素钠
抽血后，将100μl全血样品吸入肝素化毛细管(bacto实验室，利物浦，nsw)中。将样品立即从毛细管中排出到istatcg8+柱体的样品孔中。在将柱体封闭前，从样品中去除所有气泡。通过istat临床分析仪针对血细胞比容(hct)、血红蛋白(hb)、离子钙(ica)、葡萄糖(glu)、钠(na)、钾(k)、ph、碳酸氢盐(hco3)、血气(po2、pco2、tco2、so2)和碱过量的测量来分析柱体。在每个测试时段之前，根据制造商的说明书，通过电子刺激和2级i-stat校核液(i-stat公司，美国新泽西州)对i-stat分析仪进行校准。在使用前，按照制造商的说明书储存柱体(2c-8c)，并在使用前将其移至室温大约5min。
通过离心(3000rpm，10min)从血液样品中分离血浆级分，并且随后将血浆上清液转移到无菌的2mleppendorf管中。将等份的汗水样品从
统计分析
使用statisticatm12(史丹索特公司，塔尔萨，美国俄克拉菏马州)通过单因素方差分析完成样品组之间的血液参数、运动方案和氨基酸浓度的比较。计算效应量并相应地解释，以评估在基线和补充后评估的血细胞比容和血红蛋白的均值之间的差异量级(cohen'sd；小＝0.2-0.49，中等＝0.5-0.79，大≥0.8)。合并来自两个群组的样品，用于使用statistica中的配对样本t检验比较静息血浆中总氨基酸的补充前和补充后水平。使用statistica，对在基线和补充期之后马中血浆氨基酸的静息血浆水平以及相应的血细胞比容和血红蛋白水平进行相关性分析。统计学显著性水平设定为p<0.05。
结果
在整个实验期间训练方案尽可能保持一致，以便能够在补充前后采取的各种措施之间进行有意义的比较。对来自该训练方案的一系列参数进行客观评估，以鉴定第一群组的两个阶段之间运动负荷的潜在变化。数据总结于表5中。明显的是，在两个评估阶段之间75％的测量参数没有显示出显著的差异。预期训练速度均值和时段距离将在一定程度上基于流行季节、天气和跑道条件而变化。鉴于此，得出的结论是，训练方案在该研究的补充前和补充后组之间是充分一致的，以允许进行比较。将类似的方案应用于第二群组。
针对每匹马，将从群组1的每只动物的三个收集部位收集的汗水合并，并展示氨基酸浓度的高变异性(表6)。分别分析从群组2样品中的每个采样部位收集的汗水，揭示胸部样品的总氨基酸浓度为3,214±411μmol/l，相比之下，下腹部为2,777±428μmol/l且后腿为1,876±315μmol/l(p<0.05)。胸部汗水也具有最高水平的丝氨酸、组氨酸和苏氨酸
表5：第一群组的马的基线和补充后训练参数的比较。
值为均值±se，n＝5。在基线获得的值的显著性差异为*p<0.05。
并且被认为是动物处理者最简单且最安全的收集部位。因此，此采样部位用于报告群组2的汗水数据。在基线时，群组2运动期间发生的体重损失均值为5.1±0.7kg。
在从马中取的运动后血浆中检测和定量了22种氨基酸。来自群组1和群组2的血浆组成之间的比较揭示，两个研究中的平均血浆曲线模式相似(表6)，甘氨酸为主要血浆氨基酸，随后为丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和丝氨酸，构成61％-64％的血浆氨基酸。在个体氨基酸量级和分布中，来自两个群组的血浆中氨基酸的总水平都是相似的。
针对两个群组，汗水的氨基酸组成与相应的血浆样品的氨基酸组成显著不同(表6)。针对群组1，汗水样品中氨基酸的平均总浓度是血浆的两倍(p<0.05)，而尽管在群组2中高1.2倍，但后一个差异未达到统计学显著水平。针对两个研究群组，汗水中含有与对应的血浆水平相比在汗水中一致呈现出更高浓度的5种氨基酸，并包括丝氨酸(高3.9-5.4倍)、谷氨酸(高7.0-9.5倍)、组氨酸(高4.3-4.5倍)、苯丙氨酸(高1.9-3.4倍)和天冬氨酸。
在群组1中来自马的血浆中未检测到天冬氨酸，但在汗水中以262±29μmol/l存在。类似地，在来自群组2的血浆中测量到在2±2μmol/l，与汗水中相应的154±21μmol/l相比。在群组1中，相对于血浆，汗水中的丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和酪氨酸更高，但在群组2中不是这样。在群组1中，相对于血浆，汗水中的缬氨酸和鸟氨酸浓度更大，但是在群组2中它们在汗水中的浓度更小。在两个群组中，相对于血浆，汗水中的谷氨酰胺、胱氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺浓度一致更低。在群组2中，与血浆相比，甘氨酸和色氨酸更低，而在群组1中，在两个基质中以相当水平存在。
表6.在补充开始前取自马的运动后汗水和血浆样品的氨基酸浓度均值
值为均值±se(μmol/l)。样本大小：群组1n＝5；群组2n＝6。*血浆值与相应的汗水值相比显著不同(p<0.05)。#总计包括一些未显示的次要氨基酸衍生物：α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸、甘氨酸-脯氨酸和β-氨基异丁酸。
补充后静息血液、血浆和汗水的变化
在基线和补充后，在静息血浆样品中评估平均氨基酸水平，以评估氨基酸补充后代谢体内平衡的潜在变化(表7)。群组1具有较高的平均基线水平，总血浆氨基酸为2,293±68μmol/l，与群组2的2,044±135μmol/l相比，而静息水平在两年间展示相似的曲线特征。补充后，两个群组中的平均总血浆氨基酸水平相比其相应的基线水平均值分别增加至2,674±41μmol/l和2,663±124μmol/l(p<0.05)。因此，针对两个群组在补充后血浆中氨基酸的平均总水平是相当的。将两个群组合并以进行配对样本t检验，以用邦费罗尼校正进行基线和补充剂后血浆氨基酸浓度的比较。在补充期后在静息血浆中观察到，与基线水平相比存在如下项的显著增加：甘氨酸(基线：582μmol/l与补充剂后：769μmol/l)、苏氨酸(93μmol/l与118μmol/l)、丝氨酸(175μmol/l与312μmol/l)和谷氨酰胺(213μmol/l与343μmol/l)(n＝9，p<0.002)。也使用配对样本t检验评估补充后血浆中的平均总氨基酸浓度(均值＝2669μmol/l，sd＝165)，并且发现与补充前观察到的水平相比显著更高(均值＝2,138μmol/l，sd＝313)(t(8)＝-4.29，p<0.003)。数据指示，运动后立即补充氨基酸的过程导致静息血浆中氨基酸水平的循环水平增加。
与群组1水平5,696±932μmol/l相比，群组2同样在基线具有较低血浆总氨基酸含量，汗水中的初始平均总氨基酸水平为3,213±411μmol/l(表8)。补充后，群组1的平均总汗水氨基酸水平并未显著增加，为6,228±546μmol/l，但群组2的浓度增加超过两倍，为8,682±563μmol/l(p<0.05)。与群组2的基线水平相比，所测量的所有氨基酸在补充剂后汗水中观察到处在更高的水平(p<0.05)。
表7.群组1和群组2的补充前和补充后运动前血浆的氨基酸组成的比较。
单位为μmol/l。*每个群组内基线和补充后浓度之间有显著性差异。a结果报告了2-20岁的无牧杂种马(mcgorum和kirk,2001)；nr指示未报告。b在当前研究中报告了4种氨基酸，在mcgorum和kirk(2001)的研究中没有报告它们。因此，为了参考比较的目的，来自当前研究的针对停止工作的马的脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺和胱硫醚的值被代入总数计算。参考数据报告了当前技术未测量的针对精氨酸、牛磺酸和瓜氨酸的另外的值(代表另外的合计195μmol/l)。
表8.群组1和群组2的基线和补充剂后汗水的氨基酸组成的比较。
值为均值±se(μmol/l)。在补充剂前获得的值的显著性差异为*p<0.05。
完成补充程序后，4匹群组2的马的静息血细胞比容和血红蛋白水平均值分别为0.41±0.025和141±8.6g/l。补充后，针对两个参数观察到大量增加(cohen'sd>0.8)，其中静息血细胞比容增加至0.46±0.015而血红蛋白增加至155±5.3g/l。血浆氨基酸的静息水平的相关性分析指示，苏氨酸是唯一与血红蛋白静息血液水平强相关的氨基酸。补充期后，多种氨基酸显示出与血红蛋白的强相关，其中组氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸展示r2>0.98。在具有初始低血红蛋白(117g/l)的另外的马中，给予该动物30g/天的被配制成仅含有14种氨基酸的氨基酸补充剂，这14种氨基酸被鉴定为代表汗水中损失的主要氨基酸成分(丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和酪氨酸)。调整氨基酸的比例以反映针对这些动物汗水中氨基酸所观察到的相对损失。将这些氨基酸以适当的比例预混合并与水3:1组合，加入黄原胶，以帮助通过60ml注射器形成糊剂递送系统，其被动物良好接受。该糊剂每服包含30g氨基酸与500mg葡萄糖。补充4天后血红蛋白增加至125g/l。补充13天后血红蛋白进一步增加至132g/l。在这13天期间，红细胞计数也从6.9x1012/l增加到7.7x1012/l。这些数据支持氨基酸补充可导致血红蛋白水平升高，特别是起始水平低于140g/l时。
来自第一群组的表现评估揭示，完成运动后10分钟测量的平均恢复心率从补充剂前的83.3±5.6降低至补充期后的77.2±4.3bpm(p<0.05)。在整个实验期间监测动物的状况，并且驯马师为两个研究群组的每只动物提供有价值的反馈，这总结在表9中。驯马师主观评估和报告的主要特点是补充导致了一系列改进，包括健康、幸福(well-being)和表现。具体注意关于改进的皮毛、明亮的眼睛以及比赛状况的更好维持和在测试期间肌肉质量的发展的评论。
对两个群组的分析揭示，在训练或运动方案期间，汗水促进的氨基酸损失(sflaa)可能很大，而马损失估计1.6–3g的游离氨基酸。这种损失将导致对通过分解代谢反应利用肌肉氨基酸储备的需求立即增加。为了在上下文中设定这一点，虽然马的血浆体积在品种与健康和含水的水平之间是可变的，但是平均450kg的马将具有约16l的血浆体积，相应的红细胞体积约为20l。因此，在本研究中，在两个群组的马中，16l血浆体积中的总氨基酸负载被计算为3.8-4.3g。基于上述计算，在运动期间大约40％-70％的血浆氨基酸负载可能通过汗水而损失，这导致身体质量通过出汗减少1％。这指示出汗增加了通过肌肉储存蛋白的分解代谢周转使氨基酸进入循环的需要。因此认为，氨基酸通过汗水的损失将另外需求肌肉储备来补充支持代谢过程所需的血浆水平，这些代谢过程包括能量产生(葡萄糖-丙氨酸循环)、供氧、肌肉修复和恢复。
表9：在第一群组和第二群组补充期后来自驯马师的评论。
1.6–3g游离氨基酸的这种损失将导致对通过分解代谢反应利用肌肉氨基酸储备的需求立即增加。蛋白水解可以允许替代支持代谢过程所需的氨基酸，这些代谢过程包括能量产生(葡萄糖-丙氨酸循环)、供氧、以及肌肉修复和恢复。汗水中的氨基酸曲线与血浆中相应水平的比较揭示了一组6种氨基酸，这6种氨基酸被称为a型，在两个研究中，其在汗水中以与血浆中相应水平相比实质上更高的浓度存在，以及b型氨基酸，在其中一项研究中，其在汗水中与血浆相比显著更高。这些氨基酸中的一些是非必需氨基酸，并且可以由马合成，但在长时间运动或高温暴露的情况下，如果合成不能满足需求，这些代谢物可能会变得有条件地必需。丝氨酸是汗水中测量到的主要氨基酸。除了蛋白质合成的需要外，丝氨酸及其衍生物在关键膜磷脂如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺中形成官能团。丝氨酸是合成甘氨酸的直接前体，甘氨酸是马血浆中最丰富的氨基酸。从丝氨酸形成甘氨酸也从四氢叶酸产生亚甲基四氢叶酸，这是合成核酸所必需的。因此，如果身体供应不能满足需求，那么大量汗水促进的丝氨酸损失可能导致广泛的代谢缺陷，对表现和恢复产生影响。
第一群组中使用的补充利用了被设计用于解决人类疲劳的商业氨基酸补充剂(dunstan2013,2014)，而第二群组测试了如下补充剂，该补充剂被设计为通过提供被鉴定为a型氨基酸的氨基酸来专门解决马中由出汗造成的损失。该配制品包括相对于血浆，在汗水中具有最高浓度的6种氨基酸：丝氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。作为马汗水中损失的主要成分，这些氨基酸代表该配制品中氨基酸的60％，连同补足剩余40％的丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和酪氨酸。包括缬氨酸作为潜在的高损失必需氨基酸，并且包括甘氨酸，因为尽管其浓度在汗水中与血浆中相当，但它代表汗水中损失的第二或第三最丰富的氨基酸。
40天氨基酸补充的关键结果是两种产品均导致静息血浆水平分别升高至2,674±41μmoll-1和2,663±124μmoll-1的相当水平。这一结果证明补充过程在改变两个群组的马中的氨基酸体内平衡方面是有效的。不希望受理论束缚，平均总氨基酸浓度升高至类似水平表明存在氨基酸的血浆优化水平(polaa)的假设，其不能在训练和常规工作的条件下通过补充而进一步增加。已经从工作中休息的马的数据揭示，血浆中的总氨基酸浓度增加到比工作中的马补充后评估的polaa高大约30％的水平。这被解释为反映在常规强度训练和比赛的条件下，动物在不同的体内平衡下以较低水平的循环血浆氨基酸活动。在高强度训练条件下，持续的每日运动周期需要激活分解代谢反应，以从肌肉储存提供氨基酸。运动后，马用于补充和恢复的时间有限，可能会对递送氨基酸用于全身代谢产生过度需求。在一段时间的休息之后，储存被补充，并且体内平衡转换到更高水平的血浆氨基酸浓度，如在停止工作的马中观察到的。不希望受理论束缚，本发明人提出，被过度训练或感染性攻击刺激的长时间分解代谢可能导致氨基酸储存减少，在这种情况下身体不能通过从头合成满足需求。也不希望受理论束缚，本发明人提出，针对氨基酸总水平的简单血浆测试将提供马中的氨基酸状态的指示，以确定在训练和比赛期间对优化表现和状况的补充需要。这将提供一个工具，用于在整个训练期间管理和优化剂量水平。
这里描述的结果指示，具有14种氨基酸的简化配制品在实现polaa方面与更复杂的fatiguerevivatm配制品同样有效，该fatiguerevivatm配制品含有20种氨基酸、低聚果糖(fos)、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、核糖、13种矿物质和13种维生素。在第二群组中使用的补充剂导致马具有更高水平的在配制品中包括的关键氨基酸，包括脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和天冬氨酸，这将对动物的幸福有潜在的益处。
在补充后，汗水中氨基酸的相应水平也实质上增加。在第二群组中，这更为突出，其从3,213±411μmoll-1增加到补充后的8,682±563μmoll-1(表8)。汗水中较高水平的氨基酸很大程度上归因于丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸的差异，起始第二补充剂的主要成分。这些结果被解释为指示基于汗水促进的损失配制的补充剂在递送氨基酸方面是非常有效的。在补充后汗水中氨基酸组成的增加也表明，从马收集的汗水中测量到的氨基酸反映了马的代谢体内平衡和营养状态。
来自两个群组的驯马师的反馈提供了如下的重要主观证据，补充提供了针对马的一般状况的益处，即支持肌肉质量的发展、有光泽的皮毛、明亮的眼睛和更长时间辛苦工作的能力。不希望受理论束缚，表明较高水平的血浆氨基酸潜在地将能够更好地支持在工作和蛋白合成期间提供能量，支持供氧、肌肉生长和运动恢复的过程。这是通过表9中的结果证明的，指示在补充期间维持体重，而在补充期之后两匹马显示血红蛋白水平增加。
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