相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月15日提交的美国临时专利申请no.62/162,291的权益，其通过引用并入本文，如同以其整体给出。
关于联邦资助研究或开发的声明
不适用。
本公开内容涉及靶向二聚体蛋白质(dimericprotein)存活蛋白(survivin)的化合物用于治疗癌症的用途，以及用于鉴定此类化合物的方法。
背景技术：
存活蛋白是凋亡抑制剂(inhibitorofapoptosis，iap)基因家族的成员，其包含单个杆状病毒iap重复(baculovirusiaprepeat，bir)结构域、锌指折叠和延伸的c端螺旋卷曲螺旋(c-terminalhelicalcoiledcoil)1。其为16.5kda蛋白质的同二聚体2，3。异位存活蛋白过表达引起细胞系4-9和动物10中由内在和外在刺激诱导的细胞死亡抑制。存活蛋白基本上在所有癌症中过表达，但在大部分成年正常组织中不表达1，11。存活蛋白也被证明促进放射治疗和化学治疗抗性，并且抑制存活蛋白使癌细胞对这些治疗敏感12-14。利用分子探针(例如反义寡核苷酸、核酶、sirna和显性负突变体)进行的治疗均导致胱天蛋白酶依赖性细胞死亡(caspase-dependentcelldeath)，并且提高由辐射和抗癌药物诱导的凋亡14-19。这些发现建立了将存活蛋白作为发现抗癌治疗剂的理想靶标。
遗憾的是，由于缺少酶活性，存活蛋白属于被认为“无药可靶向(undruggable)”的一类蛋白质。尽管已经鉴定了可通过阻断其与其他必需蛋白质的相互作用而干扰这类蛋白质之功能的小分子抑制剂，但是这些方法通常不导致有希望的药物候选物。
在存活蛋白的情况下，已经尝试将靶向其表达作为直接靶向存活蛋白蛋白质的替代方案。例如，已经确定小分子化合物ym155通过靶向其转录而抑制存活蛋白表达20。然而，ym155的多个ii期试验显示在人类癌症中仅有限或适度的最佳效力21。还作为实体瘤的i期试验中的单一药剂22以及在去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostatecancer)的ii期临床试验中与多西他赛组合23测试了抑制存活蛋白表达的反义寡核苷酸ly2181308。遗憾的是，这两个试验都没有显示出使用ly2181308的任何益处。
因此，明显需要新的存活蛋白抑制剂，其可能基于计算策略直接靶向存活蛋白蛋白本身的二聚化界面，由于存活蛋白本身被认为是“无药可靶向”的，所以该策略先前没有被尝试过。
发明概述
本发明人已经确定，多种靶向存活蛋白的化合物在两种不同的人前列腺癌细胞系中在低浓度下抑制细胞存活。此外，这些化合物中的一种表现为在广泛涵盖七种不同类型癌症的13种不同人癌细胞系中在低浓度下抑制细胞存活，并表现为在体内模型中有效抑制异种移植肿瘤生长。
因此，在第一方面，本公开内容涵盖通过向有此需要的对象施用治疗有效量的组合物来治疗癌症的方法，所述组合物包含靶向存活蛋白的化合物或其可药用盐。可用于该方法中的示例性靶向存活蛋白的化合物包括：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，所述组合物经口、表面、经鼻、肠胃外、癌旁(paracancerally)、经黏膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、瘤内或通过肺部递送施用于对象。
在一些实施方案中，所治疗的癌症是乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或白血病。在一些实施方案中，所治疗的癌症是前列腺癌。
在第二方面，本公开内容涵盖药物组合物，其包含：(a)以下靶向存活蛋白的化合物之一或其可药用盐：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在第三方面，本发明涵盖靶向存活蛋白的化合物或其可药用盐，其用于在对象中治疗癌症。可使用的示例性靶向存活蛋白的化合物包括：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，所述化合物用于治疗乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或白血病。在一些这样的实施方案中，所述化合物用于治疗前列腺癌。
在一些实施方案中，所述化合物待向对象经口、表面、经鼻、肠胃外、癌旁、经黏膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、瘤内或通过肺部递送施用。
在第四方面，本公开内容涵盖靶向存活蛋白的化合物或其可药用盐，其用于制备用于在对象中治疗癌症的药物。示例性靶向存活蛋白的化合物包括：
在一些实施方案中，其中靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，靶向存活蛋白的化合物是：
在一些实施方案中，所述药物用于治疗乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或白血病。在一些这样的实施方案中，所述药物用于治疗前列腺癌。
在一些实施方案中，所述药物设计成向对象经口、表面、经鼻、肠胃外、癌旁、经黏膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、瘤内或通过肺部递送施用。
在第五方面，本公开内容涵盖用于鉴定抗癌化合物的方法。所述方法包括对化合物库(libraryofcompound)进行计算机筛选(in-silicoscreening)以鉴定所述库中会靶向致癌二聚体蛋白质的二聚化结构域中关键疏水核心氨基酸残基的一种或更多种化合物的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括进行计算分析以鉴定致癌二聚体蛋白质的二聚化结构域中关键疏水核心氨基酸残基的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括测试一种或更多种所鉴定化合物的抗癌活性的步骤。在一些这样的实施方案中，通过使一种或更多种所鉴定化合物与一种或更多种癌细胞接触来进行该步骤。
在一些实施方案中，致癌二聚体蛋白质是存活蛋白。
通过说明书、权利要求书和附图，所公开的组合物和方法的其他目的、特征和优点将变得明显。
附图简述
图1a示出了存活蛋白二聚体的总体结构。显示为带状的两个亚基分别以青色(cyan)和橙色着色。显示为杆状表示的界面非核心残基着绿色。深埋的二聚化核心以其灰色的分子表面表示。
图1b是示出来自md模拟的存活蛋白二聚化核心单元中交换的水分子的图。
图2示出了来自计算机筛选的化合物对癌细胞存活的影响。在计算机筛选中，在载剂dmso或20μm化合物的存在下将人前列腺癌细胞系du145(顶部)和pc3细胞(底部)培养3天，然后进行mtt测定。将在多种化合物的存在下存活的细胞相对于以dmso载剂处理的那些进行归一化。箭头表示在细胞存活中抑制＞50％的化合物。(＊p＜0.05；＊＊p＜0.01)。
图3a-3f。lqz-7的鉴定和表征。
图3a示出了化合物对存活蛋白二聚化的影响的非变性page分析。将纯化的存活蛋白与不同的化合物孵育，然后进行蛋白质的非变性page分析和考马斯蓝染色。
图3b示出了lqz-7的化学结构。
图3c和3d示出了如图3a中所述的lqz-7对存活蛋白和14-3-3σ二聚化的剂量依赖性影响。
图3e示出了lqz-7与存活蛋白的剂量依赖性结合。在不存在或存在存活蛋白的情况下，测量lqz-7的固有荧光。
图3f示出了新生存活蛋白的非变性page分析。在不存在或存在lqz-7的情况下，将存活蛋白crna用于在兔网织红细胞裂解物中编程无细胞翻译。对[35s]标记的新生蛋白质进行非变性page和放射自显影分析。
图4a-4g示出了lqz-7诱导蛋白酶体依赖性存活蛋白降解。
图4a-4c示出了lqz-7对内源和异位存活蛋白表达的影响。用lqz-7或dmso载剂对照处理du145细胞不同的时间，随后进行存活蛋白的western印迹分析(4a)或处理48小时以进行存活蛋白mrna的实时rt-pcr分析(4b)。图4c示出了lqz-7对hek293细胞中异位flag-标记的存活蛋白(f-存活蛋白)的影响的western印迹分析。
图4d-e示出了lqz-7对存活蛋白稳定性和半衰期的影响。用环己酰亚胺(cycloheximide，chx)预处理du145和pc-3细胞以抑制蛋白质合成，随后在lqz-7或dmso对照的存在下追踪不同时间并进行剩余存活蛋白的western印迹分析。图e示出了图d中存活蛋白的定量。
图4f示出了蛋白酶体抑制剂mg132和硼替佐米逆转lqz-7诱导的存活蛋白降解。在不存在或存在蛋白酶体抑制剂的情况下，用lqz-7处理pc-3细胞，然后进行存活蛋白的western印迹分析。
图4g示出了lqz-7对存活蛋白合成的影响。在不存在或存在lqz-7的情况下，用[35s]甲硫氨酸对pc-3细胞进行脉冲标记。对新合成的存活蛋白进行免疫沉淀，在sds-page上解析，并通过放射自显影可视化。
图5a-5f示出了lqz-7类似物的表征。
图5a示出了lqz-7及其类似物的化学结构。
图5b示出了使用mtt测定确定的lqz-7及其类似物对pc-3和du145细胞存活的影响。
图5c示出了lqz-7及其类似物对hek293细胞中异位flag-标记的存活蛋白的影响。
图5d示出了lqz-7f对du145和pc3细胞中内源性存活蛋白水平的影响。
图5e示出了lqz-7f对存活蛋白稳定性的影响。用环己酰亚胺(chx)预处理pc-3细胞以抑制蛋白质合成，随后在lqz-7f或dmso对照的存在下追踪不同时间并进行剩余存活蛋白的western印迹分析。
图5f示出了蛋白酶体抑制剂mg132和硼替佐米对lqz-7f诱导的存活蛋白降解的影响。
图5g示出了拉下(pull-down)测定。将lqz-7f固定在cnbr活化的琼脂糖凝胶(sepharose)上并且用于拉下重组存活蛋白，随后在sds-page上分离并进行银染。
图5h示出了使用dock的存活蛋白(条带)中lqz-7f(棒和球)的预测结合模式。
图6a-6f示出了lqz-7f对癌细胞存活的影响。
图6a示出了使用mtt测定确定的不同癌症的人细胞系中lqz-7f的ics0。231，mda-mb-231。
图6b示出了使用集落形成测定确定的lqz-7f对人癌细胞存活的影响。
图6c和6d示出了凋亡测定。在不具有或具有不同浓度的lqz-7f的情况下，将细胞处理24小时，随后进行膜联蛋白v/pi双重染色并使用流式细胞术分析凋亡细胞(6c)或对切割的parp进行western印迹分析(6d)。
图6e-6f示出了不同人癌细胞系中存活蛋白的western印迹和散点图分析。使用来自每个总细胞裂解物的10mg蛋白质进行western印迹。示出了来自六个实验的不同癌细胞系的ic50和相对存活蛋白蛋白质水平的散点图分析。
图7示出了lqz-7f对微管结构的影响。在不具有或具有2μmlqz-7f的情况下，将pc3细胞处理24小时，随后对α-微管蛋白进行免疫染色并用dapi进行复染。使用共焦显微术捕获图像。
图8a-8f示出了lqz-7f的体内效力。
图8a-8b示出了lqz-7f对雄性nsg小鼠的异位异种移植肿瘤生长和体重的影响。箭头指示处理。
图8c示出了异种移植肿瘤的大体解剖学。
图8d示出了异种移植肿瘤的最终湿重。
图8e-8f示出了异种移植肿瘤中存活蛋白的免疫组织化学(8e)和western印迹(8f)分析
发明详述
a.总述
本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系和试剂，因为这些可以改变。本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
在本文中和所附权利要求中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“细胞”时包括多个这样的细胞及其本领域技术人员已知的等同物等。此外，未用数量词限定、“一个/种或更多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。另外，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物通过引用并入本文，用于描述和公开在出版物中报道的可与本发明结合使用的化学品、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法的目的。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开内容。
本发明涵盖使用任何光学活性、外消旋、多晶型或立体异构体形式或其混合物，所述形式具有可用于治疗本文中所述和要求保护的肿瘤相关病症的性质。
本发明包括使用氨基取代的化合物与有机和无机酸(例如柠檬酸和盐酸)的可药用盐。本发明还包括本文中所述化合物的氨基取代基的n-氧化物。也可通过用无机碱(例如，氢氧化钠)处理从酚类化合物制备可药用盐。而且，可用脂肪族和芳香族羧酸制备酚类化合物的酯，例如乙酸和苯甲酸酯。本文中使用的术语“可药用盐”是指由基础化合物配制的化合物，其实现与基础化合物基本上相同的药学作用。
另外，本发明还包括利用抗肿瘤化合物的水合物的方法。术语“水合物”包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等。
本文中使用的术语“治疗”包括预防以及疾病缓解治疗。本文中使用的术语“降低”、“阻抑”和“抑制”具有减轻或降低的其通常理解的含义。本文中使用的术语“进展”意指范围或严重性的提高，前进、增长或变差。本文中使用的术语“复发”是指疾病在缓解后的再现。
本文中使用的术语“施用”是指使患者、组织、器官或细胞与抗肿瘤化合物接触。本文中使用的施用可以在体外(即在试管中)或在体内(即在活生物体(例如人)的细胞或组织中)完成。在某些实施方案中，本发明涵盖向患者或对象施用可用于本发明的化合物。本文中等同使用的“患者”或“对象”是指哺乳动物，优选人，其：(1)患有通过施用抗肿瘤化合物可纠正或可治疗的病症；或(2)易感于通过施用抗肿瘤化合物可预防的病症。
本文中使用的“药物组合物”意指与合适的统称为“可药用载体”的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和辅料一起的治疗有效量的抗肿瘤化合物。本文中使用的术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗响应而没有过度的不良副作用(例如，毒性、刺激性或变态反应)的活性治疗剂的量。显然，具体的“有效量”将随着例如以下的因素变化：所治疗的特定病症、患者的身体状况、被治疗的动物类型、治疗的持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质以及所使用的具体剂型和化合物或其衍生物的结构。本领域普通技术人员使用常规实验可容易地确定最佳有效量。
药物组合物是液体或者冻干或以其他方式干燥的制剂，并且可包含多种缓冲剂含量(例如，tris-hcl、乙酸盐、磷酸盐)、ph和离子强度的稀释剂，防止吸收于表面的添加剂(例如白蛋白或明胶)，洗涤剂(例如，吐温(tween)20、吐温80、普朗尼克(pluronic)f68、胆酸盐)，增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠(sodiummetabisulfite))，防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类(parabens))，填充物质或张力调节剂(例如，乳糖、甘露糖醇)，聚合物(例如聚乙二醇)与蛋白质的共价连接，与金属离子的络合，或者将材料并入到聚合物(例如聚乳酸酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制剂内或上，或者并入到脂质体、微乳剂、胶束、单层(milamellar)或多层囊泡、红细胞血影或原生质球(spheroplast)上。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除率。控制释放或持续释放组合物包括亲脂性储库(lipophilicdepot)(例如，脂肪酸、蜡、油)中的制剂。
本发明还涵盖施用涂覆有聚合物(例如，泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))的颗粒组合物的方法。组合物的其他实施方案并入用于多种施用途径(包括表面、肠胃外、经肺部、经鼻和经口)的颗粒形式、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂。在一个实施方案中，药物组合物肠胃外、癌旁、经黏膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内施用。
此外，本文中使用的“可药用载体”是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于0.01-0.1m(优选0.05m)的磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。另外，这样的可药用载体可以是水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括但不限于水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。
肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖(ringer’sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液(lactatedringer’s)和不挥发油。静脉内载剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些)，等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂(collatingagent)、惰性气体等。
可根据本发明施用的控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库(例如，脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明还考虑涂覆有聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)的颗粒组合物，以及与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶联或者与组织特异性受体的配体偶联的化合物。
根据本发明施用的组合物的其他实施方案并入用于多种施用途径(包括肠胃外、经肺部、经鼻和经口)的颗粒形式、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂。
已知通过共价连接水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸)修饰的化合物与相应的未修饰化合物相比在静脉内注射后表现出在血液中显著更长的半衰期(abuchowski等，1981；katre等，1987；newmark等，1982)。这样的修饰还可提高化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，提高化合物的物理和化学稳定性，并极大降低化合物的免疫原性和反应性。因此，可通过以比未修饰化合物更低的频率或更低的剂量施用这样的聚合物-化合物加合物(polymer-compoundabduct)来实现期望的体内生物学活性。
在根据本发明的另一个方法中，药物组合物可在控制释放系统中递送。例如，可使用静脉内输注、植入式渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式来施用药剂。在一个实施方案中，可使用泵(参见langer，同上；sefton，1987；buchwald等，1980；saudek等，1989)。在另一个实施例中，可使用聚合物材料。在另一个实施方案中，可将控制释放系统放置在治疗靶标(即皮肤)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如goodson，1984)。另一些控制释放系统在langer，1990的综述中讨论。
药物制剂可包含单独抗肿瘤化合物，或者还可包含可药用载体，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂或栓剂(包括直肠和尿道栓剂)。可药用载体包括树胶、淀粉、糖、纤维素材料及其混合物。含有抗肿瘤化合物的药物制剂可通过例如皮下植入丸粒而向对象施用。在另一个实施方案中，丸粒在一段时间内提供抗肿瘤化合物的控制释放。也可通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂，经口施用液体或固体制剂，或通过表面应用来施用制剂。也可通过使用直肠栓剂或尿道栓剂来完成施用。
可通过本发明施用的药物制剂可通过已知的溶解、混合、造粒或片形成过程来制备。对于经口施用，将抗肿瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如盐、酯、n-氧化物等)与常规用于该目的的添加剂(例如载剂、稳定剂或惰性稀释剂)混合，并通过常规方法转化成合适的施用形式，例如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊剂，水性、醇性或油性溶液剂。合适的惰性载剂的实例是与黏合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶)、与崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸)或与润滑剂(例如硬脂酸或硬脂酸镁)组合的常规片剂基质(例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉)。
合适的油性载剂或溶剂的实例是植物油或动物油，例如向日葵油(sunfloweroil)或鱼肝油。制剂可作为干颗粒和湿颗粒二者实现。对于胃肠外施用(皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)，如果期望，将抗肿瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如盐、酯、n-氧化物等)用常规且适合用于该目的的物质(例如增溶剂或其他助剂)转化为溶液、混悬液或排出物(expulsion)。实例是无菌液体，例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他可药用辅料。示例性油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常来说，水、盐水、水性右旋糖及相关的糖溶液、以及二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是用于可注射溶液。
含有活性组分的药物组合物的制备是本领域中充分理解的。这样的组合物可制备成递送至鼻咽的气雾剂或者制备成作为液体溶液或混悬液形式的注射剂；然而，也可制备适于在注射前溶解或混悬于液体中的固体形式。制剂也可被乳化。活性治疗成分通常与可药用且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等或其任意组合。
此外，组合物可含有少量增强活性成分效力的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂。
活性组分可以以中和的可药用盐形式配制到组合物中。可药用盐包括与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐。由游离羧基形成的盐也可来自于无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
为了使用例如乳膏剂、凝胶剂、滴剂等表面施用于身体表面，作为在含或不含药用载体的生理上可接受的稀释剂中的溶液剂、混悬剂或乳剂制备和施用抗肿瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如盐、酯、n-氧化物等)。
在根据本发明的另一种方法中，活性化合物可在囊泡中(特别是脂质体)中递送(参见langer1990；treat等，1989；lopez-beresteinibid.；一般地参见同上)。
为了用于药物，抗肿瘤化合物的盐可以是可药用盐。然而，其他盐可用于制备根据本发明的化合物或其可药用盐。化合物的合适可药用盐包括酸加成盐，其可例如通过将根据本发明的化合物的溶液与可药用酸(例如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合来形成。
总之，本发明提供了用于治疗、抑制癌症或癌症相关病症(包括但不限于白血病、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌或卵巢癌)的复发或发生的多种方法和药物组合物。
以下实施例仅作为示例提供，而不作为限制。
实施例：鉴定用于降解的靶向存活蛋白二聚化界面的抗癌化合物
由于缺少已知的酶活性，许多理想的致癌蛋白质靶标被认为是“无药可靶向”。存活蛋白是iap家族的成员，是这样的蛋白质并且以同二聚体存在。
在本实施例中，我们测试了与界面表面结合的化合物可抑制存活蛋白二聚化、促进存活蛋白降解并导致自发性凋亡的假说。通过将存活蛋白二聚化界面的计算分析与靶向界面的计算机筛选组合，我们成功鉴定了诱导蛋白酶体依赖性存活蛋白降解的命中化合物。对其类似物的进一步分析有助于鉴定以0.4-4.4μm的ic50有效地抑制多种癌细胞系的潜在的先导候选物(lqz-7f)。lqz-7f还有效地诱导存活蛋白降解、自发性凋亡、有丝分裂停滞并且抑制异种移植肿瘤生长。总之，我们推断：将二聚化界面的计算分析与靶向界面中关键疏水核心残基的计算机筛选组合是用于抗癌药物发现的靶向“无药可靶向”的致癌二聚体蛋白质的可行方法。
引言
已知二聚体蛋白质疏水界面的暴露通常导致构象改变24，25，其导致蛋白质通过蛋白酶体或自噬的去稳定化和降解26，27。由于存活蛋白以同二聚体存在，我们推测抑制存活蛋白二聚化的小分子化合物可通过蛋白酶体促进存活蛋白降解并消除蛋白质，导致自发性凋亡。我们最近开发了新的策略来鉴定对于同二聚化关键的界面疏水核心单元28，29。使用这种策略，我们通过首先鉴定了对存活蛋白二聚化关键的疏水核心残基，然后进行靶向关键核心残基的抑制剂的计算机筛选以及进行体外和基于细胞的测定来测试上述假说。我们鉴定了命中化合物lqz-7，其以蛋白酶体依赖性方式使二聚体存活蛋白解离并诱导存活蛋白降解。进一步分析确定了命中化合物的多种类似物，这得到了潜在的先导化合物(lqz-7f)，其以亚微摩尔的ic50抑制多种癌细胞系的存活，抑制异种移植肿瘤生长，并抑制体内存活蛋白。
结果
存活蛋白二聚化结构域的分析。为了有效地靶向存活蛋白的二聚化结构域，我们首先分析二聚化结构域以鉴定对于存活蛋白二聚化关键的残基作为靶标用于计算机筛选。两个相同亚基之间的相互作用残基由第6-10、93-99和101-102(6l、7p、8p、9a、10w、93f、94e、95e、96l、97t、98l、99g、101f、102l)位残基构成。这些残基中的约80％是疏水性的，考虑到二聚体蛋白质中非极性相互作用的平均值仅为～50％1，这是相当高的。二聚体存活蛋白的计算的总溶剂可及面积(solventaccessiblearea)为
以前，我们发现二聚体蛋白质可具有密封以免受水渗透并且对于同二聚化关键的二聚化核心单元28。存活蛋白具有由四个残基(来自一个亚基的leu98和phe101以及来自另一个亚基的相同残基)组成的一个二聚化核心单元(图1a)。通过进行20-ns水显式dm模拟(20-nswaterexplicitmdsimulation)和我们先前开发的计算方法28来确定该二聚化核心单元的水交换速率。如图1b所示，在20-ns的模拟过程中，很少有水分子移进或移出二聚化核心，估计水交换速率为0.5个水/200ps，这与14-3-3σ二聚化核心的水交换率28相当。然而，其显著低于失去二聚化活性并且具有高得多的水交换速率(＞4个水/200ps)的突变型14-3-3σ分子。这些发现表明由leu98和phe101组成的存活蛋白二聚化核心单元被紧密封闭，并且对于形成稳定的存活蛋白二聚体可以是关键的。破坏该核心形成可影响存活蛋白二聚化。事实上，phe101突变成ala101以及leu102突变成ala102已显示破坏存活蛋白二聚化30。
靶向存活蛋白二聚化结构域的lqz-7的鉴定。为了鉴定可潜在抑制存活蛋白二聚化的小分子化合物，我们使用dock进行了靶向二聚化界面中关键疏水核心残基leu98和phe101的约200,000种化合物的计算机筛选。在100种得分最高的结构多样的化合物中，49种化学样品可商购，并使用两种人癌细胞系du145和pc-3测试了其毒性。如图2中所示，仅化合物4、7、9、12、21、36和42在20μm能够抑制du145和pc-3细胞二者≥50％的存活。因此，选择这些化合物进行进一步研究。
首先使用纯化的存活蛋白和非变性page分析测试所选择的化合物使存活蛋白二聚体解离的能力。如图3a所示，化合物#7(命名为lqz-7，具有图3b中所示结构)能够影响纯化的存活蛋白的迁移率(mobility)，推断是通过使二聚体存活蛋白解离成单体。为了确认其活性并测试其潜在的选择性，我们重新合成了lqz-7并对其使二聚体存活蛋白和无关对照但类似的二聚体蛋白质14-3-3σ解离的能力进行了剂量-响应分析。尽管表现为需要100μmlqz-7来使二聚体存活蛋白完全解离(图3c)，但是100μmlqz-7对14-3-3σ二聚化没有影响(图3d)。我们还在lqz-7的存在下对在无细胞体系中合成的新生蛋白质进行了非变性page分析。如图3e中所示，20μm的lqz-7实现了对存活蛋白二聚化的完全抑制。总之，这些发现表明，lqz-7f可抑制新生存活蛋白的二聚化并以高于其他同二聚体蛋白质(如14-3-3σ)的选择性使二聚体存活蛋白解离。与使二聚体存活蛋白解离相比需要更少的lqz-7来抑制新生存活蛋白的二聚化，这也表明抑制新合成的蛋白质的二聚化比使现有的二聚体蛋白质解离在动力学上更容易。
为了证实lqz-7确实与存活蛋白结合并抑制存活蛋白二聚化，我们利用lqz-7的固有荧光性质，并如先前所述在存在或不存在存活蛋白的情况下进行荧光滴定测定(fluorogenictitrationassay)31。图3f示出在重组存活蛋白的存在下，lqz-7的固有荧光显著提高，表明lqz-7可能与存活蛋白相互作用。lqz-7与存活蛋白结合的kd评估为0.24±0.11μm。
lqz-7加速内源存活蛋白的蛋白酶体依赖性降解二聚体蛋白质的疏水界面暴露通常导致构象改变24，25，其导致蛋白质通过蛋白酶体或自噬的去稳定化和降解26，27。因此，我们推测lqz-7可通过使存活蛋白二聚体解离并暴露疏水性二聚化界面导致存活蛋白的蛋白酶体依赖性降解。为了检验该假说，我们首先用lqz-7处理du145细胞不同的时间，随后使用western印迹分析测定内源存活蛋白。图4a示出与载剂对照处理相比，lqz-7处理确实降低了存活蛋白水平。用pc-3细胞也观察到类似的结果(数据未示出)。然而，如使用实时rt-pcr测定的，lqz-7处理对存活蛋白mrna的水平没有影响(图4b)。在cmv启动子的控制下，lqz-7处理也有效地降低hek293细胞中异位ha标记的存活蛋白的水平(图4c)。这些观察结果一起表明，由lqz-7诱导的存活蛋白损失可能是在蛋白质水平而不是在mrna水平。
我们接下来通过检查lqz-7对存活蛋白半衰期的影响来确定lqz-7是否引起存活蛋白降解。为此，将du145和pc-3细胞用环己酰亚胺预处理以抑制新蛋白质的合成，然后用lqz-7处理不同的时间。图4d-e示出在对照处理的dul45和pc-3细胞中，存活蛋白的半衰期为～1.5-2.5小时，这与先前报道的存活蛋白半衰期一致32，33。然而，在lqz-7处理之后，存活蛋白的半衰期降低至约30分钟。与蛋白酶体抑制剂mg132共同处理逆转lqz-7诱导的存活蛋白损失(图4f)，这与存活蛋白降解是由蛋白酶体介导的先前报道一致34。我们还发现lqz-7不抑制存活蛋白蛋白质合成，如在lqz-7处理后使用与存活蛋白的免疫沉淀相组合的[35s]甲硫氨酸脉冲标记确定的(图4g)。总之，上述发现表明lqz-7通过抑制二聚化并暴露存活蛋白的疏水核心残基而导致蛋白酶体依赖性存活蛋白降解。
lqz-7类似物的表征。尽管lqz-7在体外使存活蛋白二聚体解离并导致细胞中的存活蛋白降解，但基于细胞的细胞毒性测定显示lqz-7在人pc3和du145细胞中的ic50为约25mmol/l(图5b)。中等的ic50可能是由于lqz-7中的羧基(图5a)阻碍其细胞通透性的可能性。为了改善lqz-7的细胞效应，我们检索了specs数据库并鉴定了六种市售类似物(lqz-7a、b、c、d、e和f；图5a)。获得这些类似物的化学样品并首先与初始命中lqz-7相比测试其对du145和pc3细胞的细胞毒性。图5b显示对于这两种细胞，六种类似物中的五种具有比lqz-7低得多的ic50。然后将这些类似物与lqz-7一起用于测试其对hek293细胞中异位flag标记的存活蛋白表达的影响。如图5c中所示，虽然lqz-7a、d和e对flag标记的存活蛋白水平没有影响，但是lqz-7b、c和f都降低了存活蛋白蛋白质水平。似乎lqz-7c和f完全消除了存活蛋白，而母体化合物lqz-7没有，这与比母体化合物更低的ic50一致。lqz-7e具有高ic50值并且不降低存活蛋白的事实表明，lqz-7e可以不结合及抑制存活蛋白。依然不清楚为什么lqz-7a和d对存活蛋白水平没有影响，但同时维持低ic50。
在具有最佳ic50和消除存活蛋白之能力的两种类似化合物(lqz-7c和f)中，lqz-7f在结构上是独特、较小且简单的，具有伯胺基团作为用于进一步研究的优点。因此，我们选择进一步寻求lqz-7f作为潜在的先导物，并测试其抑制内源存活蛋白的表达和诱导其降解的活性。与lqz-7类似，lqz-7f有效地抑制du145和pc3细胞二者中的内源存活蛋白表达(图5d)，并提高内源存活蛋白的降解(图5e)。此外，蛋白酶体抑制剂mg132和硼替佐米二者均能够挽救lqz-7f诱导的存活蛋白降解(图5f)。因此，与其母体化合物lqz-7类似，lqz-7f也以蛋白酶体依赖性方式诱导存活蛋白降解。
lqz-7f与存活蛋白相互作用：为了研究lqz-7f是否确实与存活蛋白结合，我们利用伯胺基团并将lqz-7f固定到cnbr活化的琼脂糖凝胶上，用于使用纯化的存活蛋白进行拉下测定。如图5g中所示，存活蛋白被琼脂糖固定的lqz-7f成功拉下，而不被没有lqz-7f的对照珠拉下。因此，与lqz-7类似，lqz-7f可与存活蛋白直接结合。为了解lqz-7f如何与存活蛋白的相互作用，我们在存活蛋白的二聚化界面上进行了lqz-7f的对接分析，这揭示了lqz-7f与存活蛋白之间的两个关键相互作用：(a)lqz-7f的伯胺基团与存活蛋白的glu94之间的h键；(b)除了二聚化核心残基leu98和phe101之外，lqz-7f的四环呋咱并吡嗪环与疏水残基trp10和phe93之间的π-π堆积和疏水相互作用(图5h)。
lqz-7f通过诱导凋亡抑制多种癌细胞系的存活。存活蛋白在人癌症中普遍上调，因此抑制存活蛋白可以是帮助根除许多癌症的一般方法。为了这一目标，我们使用mtt测定法测试了lqz-7f对代表急性髓性白血病以及乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌的多种人癌细胞系存活的影响。如图6a中所示，lqz-7f以0.4-4.4μm的ic50有效地抑制所有癌细胞系的存活。
使用pc3和a549细胞的集落形成测定进一步评价了lqz-7f抑制癌细胞存活的活性。如图6b中所示，在用0.2、0.5和1mmol/l的lqz-7f处理后，pc3细胞的集落形成效率分别从对照的约62％降低至约52％、12％和8％。与pc3细胞相比，a549细胞对lqz-7f更敏感，具有更低ic50，且集落形成效率从对照处理的45％分别一致地降低至用0.2和0.5mmol/l的lqz-7f处理的约2.5％和0％。
先前已表明显性负存活蛋白引起pc3、du145和lncap细胞的自发性凋亡(12)。我们接下来测试lqz-7f是否也通过抑制存活蛋白引起自发性凋亡，如通过膜联蛋白v染色确定的。对于该实验，我们测试了pc3和hl-60作为代表性细胞，因为对于lqz-7f，pc3具有高而hl-60具有中等的ic50(图6a)。如图6c所示，用5至10mmol/llqz-7f处理后，产生了54％至69％的pc3的凋亡和66％至98％的hl-60细胞的凋亡。通过在lqz-7f处理之后在pc3和hl-60细胞二者中确定凋亡的执行期间parp-1(胱天蛋白酶的底物)的切割进一步验证这些发现(图6d)
最后，我们测试了所有13种细胞系中的存活蛋白表达(图6e)并进行了存活蛋白水平和ic50之间的相关性分析。如图6f中所示，在这些细胞中ic50值与存活蛋白水平强烈相关，皮尔逊相关系数(pearsoncorrelationcoefficient)为0.52，表明lqz-7f可能通过作用于存活蛋白而抑制这些癌细胞的存活。
lqz-7f处理破坏微管结构并导致有丝分裂停滞。已显示存活蛋白具有抑制凋亡和促进细胞周期进程的双重功能1。后者被认为来自存活蛋白在体外和体内二者中使微管失稳的作用35，36。因此，为了进一步确定lqz-7f对存活蛋白的作用，我们分析了pc-3细胞中lqz-7f处理后的微管结构。如图7a中所示，对照dmso处理的细胞在所有细胞中都具有有序的微管纤维。然而，在lqz-7f处理后，微管结构被严重破坏。表现为在lqz-7f处理后，许多细胞停滞在有丝分裂期，具有异常的纺锤体。这些观察结果与存活蛋白在微管动力学中的作用37，38以及作为适当染色体分离和胞质分裂所必需的染色体乘客复合体(chromosomalpassengercomplex)的亚基39，40的作用一致。
lqz-7f通过抑制存活蛋白来抑制异种移植肿瘤的生长。我们接下来使用异种移植动物模型确定lqz-7f是否在抑制体内肿瘤生长中有活性。为此，首先向nod/scid小鼠皮下植入pc-3细胞以建立异种移植肿瘤。选择pc-3细胞是因为其具有最高的ic50(图6)。当异种移植肿瘤达到约～100mm3时，将小鼠随机分成两组，并且用25mg/kglqz-7f或载剂对照通过ip注射每三天处理一次，总计8次处理。每三天使用卡尺测量异种移植肿瘤的生长并且监测体重，持续总共30天。如图8a中所示，与载剂对照处理组中的肿瘤相比，在lqz-7f处理组中，异种移植肿瘤的生长受到显著抑制。然而，多次给药后处理组中小鼠的体重保持不变(图8b)，表明lqz-7f在多次给药后可不引起大的毒性。事实上，对照组的体重可能由于异种移植肿瘤的疾病负担而轻微下降。这一症状表现为被lqz-7f处理减轻，与处理组中肿瘤尺寸较小相一致。
处理组中的最终切割的肿瘤表现为小而圆的，具有光滑表面，而对照组的肿瘤表现为不规则且更大(图8c)，表明处理组中的肿瘤被限制，而对照组中的肿瘤具有侵袭性。处理组中的肿瘤平均重量显著小于对照组(图8d)。与对照处理的肿瘤相比，lqz-7f处理的肿瘤也表现为具有更多的凋亡细胞(图8e)。western印迹和ihc染色分析显示，与对照处理组的肿瘤相比，lqz-7f处理组的异种移植肿瘤中的存活蛋白显著降低，表明lqz-7f对异种移植肿瘤生长的作用可以是由于其与存活蛋白的结合以及诱导体内存活蛋白降解。
讨论
在本实施例中，在详细分析包埋的表面积之后，使用靶向二聚化界面中的关键疏水核心残基的计算机筛选，我们成功鉴定了可与存活蛋白直接结合并造成蛋白酶体依赖性存活蛋白降解的潜在的先导抑制剂(lqz-7f)。lqz-7f对不同人癌症的多种细胞系具有0.4-4.4μm的ic50，并诱导自发性细胞凋亡。其还在抑制异种移植肿瘤生长以及降低异种移植肿瘤中的存活蛋白水平方面有效。
本实施例提供了“无药可靶向”的同二聚体蛋白质的二聚化界面中的二聚化核心单元可用作用于药物发现的靶位点的概念验证。如本文示出的，将首先鉴定这些核心单元的二聚化界面的计算分析与计算机筛选组合可能是将有助于成功鉴定抑制靶蛋白二聚化之小分子的可行方法。
lqz-7及其类似物诱导存活蛋白降解的发现与以下概念一致：二聚体蛋白质的疏水界面的暴露通常导致构象改变24，25，这导致蛋白质通过蛋白酶体或自噬的去稳定化和降解26，27。有趣的是，并非所有的lqz-7类似物都诱导存活蛋白降解。lqz-7e对存活蛋白的表达没有影响，与其缺少对细胞存活的抑制作用一致。然而，化合物lqz-7a和7d在抑制癌细胞生长方面是有效的，但看来不诱导存活蛋白降解。该发现是有趣的，并且表明这两种化合物可以与存活蛋白结合并抑制其功能，但不会引起蛋白酶体依赖性降解。或者，这些化合物可具有脱靶效应，其抑制细胞存活但失去其对存活蛋白的作用。
值得注意的是，疏水核心残基phe101至ala101的突变与leu102至ala102的突变一起破坏了存活蛋白二聚化，这看来不导致存活蛋白降解30。这一观察结果显然不同于我们使用小分子抑制剂破坏存活蛋白二聚化的发现。尽管目前尚不清楚这种差异的原因，但可能的是突变诱导的单体存活蛋白通过与其他蛋白(例如crm1)结合而作为异二聚体存在30，并且在哺乳动物细胞中不存在真正的单体。另一方面，由小分子抑制剂(例如lqz-7f)诱导的单体由于界面中化合物的存在而不能与其他蛋白形成异二聚体。还可能的是，二聚化核心残基的突变降低了界面的疏水性，因此蛋白质可逃离细胞质量控制系统，而小分子化合物与界面的结合可提高疏水性并且吸引质量控制系统。
还值得注意的是，先前基于abbot8(通过基于nmr的筛选获得的存活蛋白抑制剂)合成了小分子化合物llp3。认为llp3与存活蛋白的二聚化界面结合31。然而，llp3对存活蛋白二聚化或其表达没有影响。相反，它抑制了存活蛋白与其伴侣ran蛋白之间的相互作用。因此，尚不清楚llp3是否真的与存活蛋白的二聚化界面结合。然而，llp3抑制癌细胞的增殖，但是具有比lqz-7f高得多的14-38μm的ic50。
方法
水运输(watertrafficking)的md模拟分析。如先前所述28，使用amber9包进行存活蛋白二聚体和水运输的md模拟。从rcsb蛋白质数据库获得具有pdb编码1f3h的存活蛋白二聚体的晶体结构2。锌参数由y.p.pang使用阳离子虚拟原子(dummyatom)(cada)方法开发41。使存活蛋白二聚体在切去顶端的八面体盒(truncatedoctahedronbox)中成为溶剂合物，边与溶质中的任何原子之间的距离不小于
通过ccp4包的areaimol计算总包埋二聚化界面面积和分解成每个残基的包埋表面面积。选择具有高于75％的溶剂可及面积包埋入二聚化界面的二聚化核心残基。存活蛋白具有由四个残基组成的一维二聚化核心单元：来自一条链的leu98和phe101以及来自另一条链的相同残基。如先前所述28，29，通过20-ns水显式md模拟确定水交换率来进一步验证该二聚化核心实体。从核心的质量中心得到半径为
计算机虚拟筛选。如先前所述进行基于结构的计算机筛选42，43。简单来说，从pdb编码1f3h获得存活蛋白的3-d坐标。仅保持两条链中的一条，并准备蛋白质链用于对接。使用dms(分布式分子表面(distributedmolecularsurface))程序计算分子表面。通过ucsfchimeradockprep模块将部分电荷和质子添加至蛋白质44。使用ucsfdock6.0程序进行了来自specs库的200,000种化合物的计算机对接筛选45。首先用dockgrid评分功能对每种化合物的对接进行评分46。再次分析得分最高的1000种化合物，并使用dock6.0包的amber评分功能进行重新评分47。将这些化合物使用moe(分子操作环境(molecularoperatingenvironment))程序进行聚类(cluster)，并使用ucsfchimeraviewdock功能进行目视检查。根据grid和amber评分的组合、药物相似性(利平斯基的五规则(lipinski′sruleoffive))以及使来自不同聚类的化合物最大化的考虑来选择最终的100种化合物。
非变性page。在将1-μg纯化的存活蛋白用20μm候选化合物、dmso载剂对照或不同浓度的lqz-7孵育，之后与等体积的2×tritonx-100样品缓冲液(100mmtris，ph8.0，20％甘油，0.005％溴酚蓝，2％tritonx-100，和100mmdtt)混合，随后在室温下孵育30分钟。在以11,000×g离心10分钟后，通过在15％tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离上清液，随后如先前所述转移至pvdf膜用于western印迹分析48。
存活分析(mtt和集落形成)。如先前所述进行这些测定49，50。简单来说，如下进行mtt测定：在96孔板中接种2500个细胞并培养24小时，然后添加不同浓度的存活蛋白抑制剂并继续培养3天。然后对细胞进行mtt测定。对于集落形成测定，将100个细胞/孔接种在6孔板中并培养24小时，然后添加存活蛋白抑制剂或dmso载剂。在存活蛋白抑制剂或dmso存在下将细胞继续培养10至14天，随后用结晶紫染色并人工计数。
荧光测定。如先前所述进行荧光测定31。简单来说，在不具有或具有10μg纯化的存活蛋白的情况下，将lqz-7在37℃预孵育30分钟，随后用590nm的激发测定485nm处的荧光发射。使用graphpadprism4.0软件将剂量响应曲线拟合至描述一位点结合模型(one-sitebindingmodel)的方程，以确定lqz-7与存活蛋白结合的kd。
凋亡测定。如制造商(invitrogen)提供的说明书中所述进行膜联蛋白v凋亡测定。简单来说，在用pbs洗涤后收获经处理细胞，然后以1×106个细胞/ml的密度重悬在膜联蛋白结合缓冲液(10mmhepes，ph7.4，120mmnacl，2.5mmcacl2)中。在添加alexafluor488膜联蛋白v和碘化丙啶后，将细胞在室温下孵育15分钟，随后用膜联蛋白结合缓冲液稀释，并用488nm激发对530nm和575nm处的荧光发射进行facs分析。
半衰期测定。如先前所述测定存活蛋白抑制剂对存活蛋白半衰期的影响51。简单来说，将pc-3或du145细胞用2μm环己酰亚胺预处理1小时，随后在不具有或具有9μmlqz-7或5μmlqz-7f的情况下孵育不同时间。然后收获细胞用于存活蛋白的western印迹分析。
异种移植小鼠模型中的效力分析。对于效力研究，将3×106个pc-3细胞皮下注射到10只nod/scid小鼠的胁部。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成两个不同的组(5只/组)，其中一组通过载剂对照处理，另一组每三天一次用25mg/kg的lqz-7f通过ip注射处理，共计8次处理。每两天测量肿瘤体积和体重。在初始处理后的第30天，处死小鼠并收集肿瘤组织、称重并进行苏木精-伊红(h&e)染色以及对存活蛋白的western印迹和免疫组织化学分析。
本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的。根据所述实施例和实施方案将会向本领域技术人员提示多种修改和改变，并且这些修改和变化包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
背景技术和实施例部分中引用的参考文献
1.altieri，d.c.survivin，versatilemodulationofcelldivisionandapoptosisincancer.oncogene22，8581-9(2003).
2.verdecia，m.a.etal.structureofthehumananti-apoptoticproteinsurvivinrevealsadimericarrangement.natstructbiol7，602-8(2000).
3.chantalat，l.etal.crystalstructureofhumansurvivinrevealsabowtie-shapeddimerwithtwounusualalpha-helicalextensions.molcell6，183-9(2000).
4.tamm，i.etal.iap-familyproteinsurvivininhibitscaspaseactivityandapoptosisinducedbyfas(cd95)，bax，caspases，andanticancerdrugs.cancerres58，5315-20(1998).
5.suzuki，a.etal.survivininitiatesprocaspase3/p21complexformationasaresultofinteractionwithcdk4toresistfas-mediatedcelldeath.oncogene19.1346-53(2000).
6.kasof，g.m.&gomes，b.c.livin，anovelinhibitorofapoptosisproteinfamilymember.jbiolchem276，3238-46(2001).
7.hoffman，w.h.，biade，s.，zilfou，j.t.，chen，j.&murphy，m.transcriptionalrepressionoftheanti-apoptoticsurvivingenebywildtypep53.jbiolchem277，3247-57(2002).
8.mirza，a.etal.humansurvivinisnegativelyregulatedbywild-typep53andparticipatesinp53-dependentapoptoticpathway.oncogene21，2613-22(2002).
9.zaffaroni，n.etal.expressionoftheanti-apoptoticgenesurvivincorrelateswithtaxolresistanceinhumanovariancancer.cellmollifesci59，1406-12(2002).
10.grossman，d.etal.transgenicexpressionofsurvivininkeratinocytescounteractsuvb-inducedapoptosisandcooperateswithlossofp53.jclininvest108，991-9(2001).
11.fukuda，s.&pelus，l.m.survivin，acancertargetwithanemergingroleinnormaladulttissues.molcancerther5，1087-98(2006).
12.zhang，m.etal.adenovirus-mediatedinhibitionofsurvivinexpressionsensitizeshumanprostatecancercellstopaclitaxelinvitroandinvivo.prostate64，293-302(2005).
13.zhang，m.，latham，d.e.，delaney，m.a.&chakravarti，a.survivinmediatesresistancetoantiandrogentherapyinprostatecancer.oncogene24，2474-82(2005).
14.pennati，m.etalribozyme-mediatedattenuationofsurvivinexpressionsensitizeshumanmelanomacellstocisplatin-inducedapoptosis.jclininvest109，285-6(2002).
15.li，f.etal.pleiotropiccell-divisiondefectsandapoptosisinducedbyinterferencewithsurvivinfunction.natcellbiol1，461-6(1999).
16chen，j.etal.down-regulationofsurvivinbyantisenseoligonucleotidesincreasesapoptosis，inhibitscytokinesisandanchorage-independentgrowth.neoplasia2，235-41(2000).
17.olie，r.a.etal.anovelantisenseoligonucleotidetargetingsurvivinexpressioninducesapoptosisandsensitizeslungcancercellstochemotherapy.(cancerres60，2805-9(2000).
18.williams，n.s.etal.identificationandvalidationofgenesinvolvedinthepathogenesisofcolorectalcancerusingcdnamicroarraysandrnainterference.clincancerres9，931-46(2003).
19.choi，k.s.，lee，t.h.&jung，m.h.ribozyme-mediatedcleavageofthehumansurvivinmrnaandinhibitionofantiapoptoticfunctionofsurvivininmcf-7cells.cancergenether10，87-95(2003).
20nakahara，t.etal.ym155，anovelsmall-moleculesurvivinsuppressant，inducesregressionofestablishedhumanhormone-refractoryprostatetumorxenografts.cancerres67，8014-21(2007).
21.rauch，a.etal.survivinandym155：howfaithfulistheliaison？biochimbiophysacta1845，202-220(2014).
22.tanioka，m.etal.phaseistudyofly2181308，anantisenseoligonucleotideagainstsurvivin，inpatientswithadvancedsolidtumors.cancerchemotherpharmacol68，505-11(2011)
23.wiechno，p.etal.arandomisedphase2studycombiningly2181308sodium(survivinantisenseoligonucleotide)withfirst-linedocetaxel/prednisoneinpatientswithcastration-resistantprostatecancer.eururol65，516-20(2014).
24.agashe，v.r.，shastry，m.c.&udgaonkar，j.b.initialhydrophobiccollapseinthefoldingofbarstar.nature377，754-7(1995).
25lins，l.&brasseur，r.thehydrophobiceffectinproteinfolding.fasebj9，535-40(1995).
26.kubota，h.qualitycontrolagainstmisfoldedproteinsinthecytosol：anetworkforcellsurvival.jbiochem146，609-16(2009).
27.hochstrasser，m.intracellularproteindegradation.incell(eds.lewin，b.，cassinmeris，l.&lingappa，v.r.)jones&bartlettlearning，2007.
28.liu，j.y.，li，z.，li，h.&zhang，j.t.criticalresiduethatpromotesproteindimerization：astoryofpartiallyexposedphe(25)in14-3-3sigma.jcheminfmodel51，2612-25(2011).
29.li，z.etal.determinantsof14-3-3sigmaproteindimerizationandfunctionindrugandradiationresistance.jbiolchem288，31447-57(2013).
30.engelsma，d.，rodriguez，j.a.，fish，a.，giaccone，g.&fornerod，m.homodimerizationantagonizesnuclearexportofsurvivin.traffic8，1495-502(2007).
31.guvenc，h.etal.impairmentofgliomastemcellsurvivalandgrowthbyanovelinhibitorforsurvivin-ranproteincomplex.clincancerres19，631-42(2013).
32chiou，s.k.&mandayam，s.nsaidsenhanceproteasomicdegradationofsurvivin，amechanismofgastricepithelialcellinjuryandapoptosis.biochempharmacol74，1485-95(2007).
33chowdhury，s.etal.histonedeacetylaseinhibitorbelinostatrepressessurvivinexpressionthroughreactivationoftransforminggrowthfactorbeta(tgfbeta)receptoriileadingtocancercelldeath.jbiolchem286，30937-48(2011).
34fortugno，p.etal.regulationofsurvivinfunctionbyhsp90.procnatlacadsciusa100，13791-6(2003).
35giodini，a.etal.regulationofmicrotubulestabilityandmitoticprogressionbysurvivin.cancerres62，2462-7(2002).
36.tran，j.etal.aroleforsurvivininchemoresistanceofendothelialcellsmediatedbyvegf.procnatlacadsciusa99，4349-54(2002).
37cheung，c.h.etal.survivincounteractsthetherapeuticeffectofmicrotubulede-stabilizersbystabilizingtubulinpolymers.molcancer8，43(2009).
38.rosa，j.，canovas，p.，islam，a.，altieri，d.c.&doxsey，s.j.survivinmodulatesmicrotubuledynamicsandnucleationthroughoutthecellcycle.molbiolcell17，1483-93(2006).
39lens，s.m.，vader，g.&medema，r.h.thecaseforsurvivinasmitoticregulator.curropincellbiol18，616-22(2006).
40kitagawa，m.&lee，s.h.thechromosomalpassengercomplex(cpc)asakeyorchestratoroforderlymitoticexitandcytokinesis.frontcelldevbiol3，14(2015).
41.pang，y.p.successfulmoleculardynamicssimulationoftwozinccomplexesbridgedbyahydtoxideinphosphotriesteraseusingthecationicdummyatommethod.proteins45，183-9(2001).
42neher，t.m.，shuek，s.c.，liu，j.y.，zhang，j.t.&turchi，j.j.identificationofnovelsmallmoleculeinhibitorsofthexpaproteinusinginsilicobasedscreening.acschembiol5，953-65(2010).
43huang，w.etal.asmallmoleculecompoundtargetingstat3dna-bindingdomaininhibitscancercellproliferation，migration，andinvasionacschembiol9，1188-96(2014).
44pettersen，e.f.etal.ucsfchimera--avisualizationsystemforexploratoryresearchandanalysis.jcomputchem25，1605-12(2004).
45.lang，p.t.etal.dock6：combiningtechniquestomodelrna-smallmoleculecomplexes.rna15，1219-30(2009).
46meng，e.c.，shoichet，b.k.&kuntz，i.d.automateddockingwithgrid-basedenergyevaluation.journalofcomputationalchemistry13，505-524(1992).
47.graves，a.p.etal.rescoringdockinghitlistsformodelcavitysites：predictionsandexperimentaltesting.jmolbiol377，914-34(2008).
48.zhang，m.，wang，g.，shapiro，a.&zhang，j.t.topologicalfoldingandproteolysisprofileofp-glycoproteininmembranesofmultidrug-resistantcells：implicationsforthedrug-transportmechanism.biochemistry35，9728-36(1996).
49.li，z.etal.roleof14-3-3sigmainpoorprognosisandinradiationanddrugresistanceofhumanpancreaticcancers.bmccancer10，598(2010).
50.qi，j.，dong，z.，liu，j.&zhang，j.t.eif3ipromotescolononcogenesisbyregulatingcox-2proteinsynthesisandbeta-cateninactivation.oncogene33，4156-63(2014).
51.peng，h.etal.anoveltwomode-actinginhibitorofabcg2-mediatedmultidrugtransportandresistanceincancerchemotherapy.plosone4，e5676(2009).